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董晓明毕业设计
SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
毕业论文
赤霉素（GA3）蛋白核小球藻油脂积存的阻碍研究
学院：
生命科学学院
专业：
生物技术
学生姓名：
董晓明
学号：
06
指导教师：
孟春晓教师
2014年6月
摘要
论文初步研究了必然质量浓度范围内的赤霉素（GA3）对蛋白核小球藻生长和总脂积存的阻碍。
实验设置了6个质量浓度梯度的GA3L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L）对蛋白核小球藻诱导处置后进行培育。
在现在期中，按期取样进行吸光度值测定，然后绘制生长曲线来观看每一个浓度梯度下小球藻的生长情形。
当藻生长至必然浓度时用氯仿-甲醇提取法进行总脂含量的测定。
实验结果说明：
浓度为10mg/L和15mg/L的赤霉素（GA3）对蛋白核小球藻总脂含量的积存有增进作用；20mg/L的赤霉素（GA3）实验组的总脂含量积存有抑制作用，油脂产量明显低于未添加赤霉素的藻液。
赤霉素（GA3）对蛋白核小球藻总脂含量的积存有增进作用；且随实验组添加赤霉素（GA3）浓度的增加，其对蛋白核小球藻总脂含量积存的增进作用在减小。
其中，15mg/L实验组的总脂含量最高，比对照组提高了%，是对照组的倍。
综合分析得出在实验所设置的激素浓度梯度内诱导浓度为15mg/L的赤霉素（GA3）的实验组增进作用最大，总脂含量最高，最适合作为产油藻进行工业化生产。
关键词：
生物质能，蛋白核小球藻，GA3，油脂含量
Abstract：
ThepaperpreliminarystudiedontheimpactoftheGA3withinacertainrangeofconcentrationonthechlorellapyrenoidosagrowthandtotaloilaccumulation.TheexperimentsetL、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L）6rangesofGA3gradientofchlorellapyrenoidosainduced,thencultured.Andregularlysamplingfordeterminationoftheabsorbancevalue.Whenthealgaegrowthreachedtoacertainconcentrationtodeterminedtotallipidcontentbychloroform-methanolextractionmethod.Theresults:
Concentrationof15mg/L（GA3）roleinpromotingthechlorellapyrenoidosaaccumulationofthetotallipidcontent;inhibitedtheaccumulationofthetotallipidcontentof20mg/L（GA3）,theexperimentalgroup, andtheinhibitoryeffectisobviouslowerthantheblankcontrolgroups. GA3canpromotetheaccumulationofthetotallipidcontentofchlorellapyrenoidosa.IncreaseoftheconcentrationofGA3andaddedwiththeexperimentalgroup,inreducingitsroleinpromotingtheaccumulationChlorellapyrenoidosatotallipidmg/Ltotallipidcontentoftheexperimentalgroup,%higherthanthecontrolgroup,timesthatofthecontrolgroup. Comprehensiveanalysisofthehormoneconcentrationgradientintheexperimentalset-inducedconcentrationof15mg/LofGA3,theexperimentalgrouptopromotetheroleofthelargest,highesttotallipidcontent,themostsuitableforindustrialproductionastheoil-producingalgae.
Keywords:
biomasschlorellapyrenoidosaGA3greasecontent
第一章引言
课题的背景和意义
1.1.1能源危机和生物质能
最近几年来,由于工业的迅猛进展和人口数量的不断增长,各类化石燃料的利用量迅速增加,致使大气被污染得加倍严峻。
而全世界范围内的化石能源储蓄正在迅速减少，石油需求量则以每一年1%的速度增加。
依照国际能源机构的预测，到2050年，世界人口将增至101•108，一次能源需要量将会达到82•1012MJ,而且其中关于石油的需求将占到30%，即•1012MJ。
全世界的天然气需求量那么以每一年%的速度递增，占总能源需求量的22%。
从21世纪初到此刻，活着界范围内暴发了第三次以石油、煤炭为主的“能源危机”。
地球上最丰硕的碳源来源渠道确实是来源于化石燃料燃烧和排放的烟气,即便只有10%的二氧化碳通过量重途径回收和利用,它所提供的碳源将是超级庞大的。
煤炭的需求增加量那么是最高的，以每一年2%的速度增加。
但是，地球上贮存的化石能源是有限的，总会有消耗殆尽的时候，在这种情形下，新型能源的推行显得尤其重要。
生物质能作为一种新型的清洁能源，其本身的开发利用取得了更为广泛的关注。
生物质能即为生物能源。
而生物质本领指通过光合作用而形成的各类有机体，大部份为动植物和微生物。
生物质能是太阳能以化学能形式贮存在生物质中的能量形式，以生物质为载体能量。
生物质能具有以下优势：
生物质原料可再生，具有多样性和普遍性的特点，资源开发潜力十分庞大；生物质的挥发成份含量高，易燃烧，能量利用率高；生物质是低碳燃料，燃历时产生的二氧化碳，可被等量生长的植物光合作用所吸收，实现温室气体的“零”排放．能够减缓日趋严峻的“温室效应”；生物质的S、N含量少，供能时可大幅减少对环境造成的污染；生物质燃烧后灰分少，而且不易黏结。
生物质能是世界上最为普遍的可再生能源，也是以后最重要的替代能源之一。
藻类作为数量群庞大的生物质，成了生物能源载体的研究热点。
而利用微藻生产生物能源具有以下独特的优势：
微藻数量庞大，光照下能有效地利用太阳能，通过光合作用固定C02，同时能将无机物转化为油脂、高不饱和烷烃、氢等能源物质：
同时微藻所需要的能量要求低，投资小，不占耕地，易于进行大规模培育：
微藻生物能源为可再生能源，燃烧后并非会污染大气，可不能产生有害气体。
因此利用微藻进行生产生物能源具有很高的潜在应用价值。
1.1.2微藻产油技术与生物柴油
海洋生物质能[3]是指海洋植物利用光合作用将太阳能以化学能的形式贮存于体内的能量形式，其要紧来源为海洋藻类，包括海洋微藻和大型海藻等。
由于海洋微藻生物质能开发具有生长速度快，能大量积存脂质，具有减排效应，可高值化综合利用（可开发的高值产品包括虾青素、活性蛋白、活性多糖、不饱和脂肪酸、天然色素、生物肥料和饵料等）等特点和优势，海洋微藻生物质能的研究一直是国际生物质能研究的重点。
微藻生物柴油能够解决当下很多问题，譬如解决目前利用植物原料进展生物柴油面临的耕地不足，气候转变对产量的阻碍和农作物价钱周期性转变和上涨等问题。
综合运用转基因技术，若是能培育出高繁衍力、短生长周期的能用于工业利用的微藻，即可比陆生植物产油高出几十倍。
利用藻类制造生物柴油是一种可再生的新型能源，可大大提高资源的利用，也是一种对不可再生能源的一种爱惜，为后代造福。
因此取得愈来愈多的关注，乃至有一些学者以为微藻是解决能源与环境问题的终极前途。
微藻生物柴油生产的成套技术涵盖多个技术环节,是个复杂的系统工程,要紧包括:
挑选和培育生长快含油率高的优良藻株、大规模培育取得可观的微藻生物量、将采收的微藻制成微藻生物柴油及其他产品实现综合利用等[3]。
微藻具有光合效率高、零净碳值、易培育、生长周期短、油含量高等优势［八、14、15］，是一种极具前景的生物柴油大宗原料，最近几年已引发各国政府和学者的高度关注。
生物柴油（脂肪酸甲酯）是一种已经取得证明的燃料,以其为可再生性的环保燃料能源而取得世界的普遍关注[2]。
目前，生物柴油是以动植物的脂肪酸为原料来生产的，而不是微藻，可是这并非能知足当下车用燃料的需求，仅仅能够代替极小一部份的化石燃料。
可是利用微藻生物来制造柴油，他们的产油量远远高于最好的油料作物。
于是近年来,微藻产油技术[4]开发取得了全世界性的普遍关注,成为生物技术、生物质能研究和能源和环境领域的热点课题。
微藻产油技术集成了微藻培育、微藻减排、微藻高值化产品和生物柴油制备等多项技术。
可是由于微藻的产油开发存在缺乏优良产油藻种与高效低本钱的培育模式、培育肥料和能耗太高、产品附加值低等关键技术问题，目前全世界尚未一家企业或机构实现微藻产油技术的产业化。
只有利用选育出的优良藻种,成立改良的开放式培育技术,通过利用废水废气有效降低培育本钱,以微藻产品的高值化利用为动力,才能有望冲破微藻产油的产业化瓶颈。
1.1.3研究现状和进展前景
全世界的生物质能源相当丰硕，每一年经光合作用产生的生物质月1700亿吨，其能量相当于世界要紧燃料奉献的10倍，而作为能源的利用量却不到总量的1%[6]，因此开发潜力庞大。
目前我国的生物质能产业起步较晚，但也已经初具规模，积存了一些比较有效的体会，可是相较于发达国家来讲，仍是比较欠缺。
生物质能开发利用技术成为世界重点研究课题之一，许多国家都制定了相应开发研究打算，我国在生物质能的应用技术方面的研究，从“六五”打算就开始设立了研究课题，进行重点攻关，要紧在气化、固化、热解和液化等方面开展研究和开发工作。
而世界各国关于生物质能源的开发和利用只会愈来愈关注，投入的开发力度也将会愈来愈大，生物质能源在全世界能源结构中所占的比重也会愈来愈大，生物质能源必将成为21世纪新型能源的主宰。
蛋白核小球藻及其应用
本文论述的选用的实验用藻为蛋白核小球藻（chlorellapyrenoidosa），是由澳大利亚昆山大学微藻研究所提供。
实验前经扩繁并培育至对数生长期备用。
通过对蛋白核小球藻的诱变和培育：
研究不同质量浓度的GA3对蛋白核小球藻诱变，通过生长曲线和油脂的提取、测定，从而确信GA3对蛋白核小球藻生长和产油的阻碍和确信最正确质量浓度。
小球藻（Chlorellapyrenoidosa）隶属于绿藻门（chlorophyta）、小球藻属（chlorella）,是一种世界性散布的一种球形单细胞淡水藻类，直径3～8微米，是地球上最先的生命之一，散布极广。
它是一种高效的光合自养型生物，其光合作用十分高效。
小球藻繁衍能力极强，蛋白质含量50%左右，超过很多高蛋白食物，如牛肉、大豆等。
而小球藻本身蛋白质来源那么是通过光合作用利用太阳能合成的；小球藻还含有碳水化合物10%～25%，不饱和脂肪酸10%～30%、丰硕的多种维生素，并含有8种必需氨基酸，及铁、锌、钙、钾等矿物质。
另外，在近期的研究中，生长因子（CGF）也在小球藻中被发觉，它能增进机体，增强人体免疫力，专门是儿童及老年人体质，具有极好的成效。
而小球藻本身的高油脂积存量那么关于研究如何将其转为生物柴油生产原料具有关键作用。
已有的研究说明:
大部份微藻细胞大量积存油脂发生在细胞割裂受阻或抑制,而碳继续被细胞固定同化的情形下（如氮欠缺等逆境条件）[9-12],现在细胞含油率迅速增加但细胞数量增加缓慢（如处于稳按期的微藻）,这致使总生物量增加减缓进而制约了总油脂生产量的提高[5,7,9,13]。
目前，因为小球藻的营养价值较高，关于小球藻研究多集中在保健品方面，尚未具体实验将小球藻的油脂积存和工业生物柴油连接起来。
因此，因此研究蛋白核小球藻生长的环境因子（不同质量浓度梯度的激素）对缩短小球藻代时、增加油脂积存量、提高生长速度、实现高密度培育十分关键。
赤霉素（GA3）及其作用机理
1.3.1赤霉素（GA3）
赤霉素，俗称九二零，具有赤霉烷骨架，能刺激植物细胞割裂和伸长的一类化合物的总称，是植物界大量存在的植物激素，普遍散布在植物的各个部份,其中应用最普遍的确实是GA3。
赤霉素具有增进种子萌生和植物生长的作用，能使植物细胞伸长和割裂、叶片增大，茎伸长，能够使植物提早成熟，而且能够改变植物的品质和增加产量。
另外，赤霉素能刺激多种植物产生的单性果实，还能够增进坐果[1]。
赤霉素同时能够打破植物休眠，减少植物器官的脱落，提高果实的结实率，亦或形成无籽果实，在蔬菜上应用的较多。
同时赤霉素还能阻碍植物的开花，还能改变一些植物的雄雌比率，能使某些二年生的植物在当年开花。
1.3.2GA3作用机理
GA3与植物的耐热性、耐盐性、发芽率、耐冷性、重金属胁迫、生物胁迫等都有很紧密的关系,但其诱导抗性的高低与质量浓度有紧密关系,由于GA3对植物具有明显阻碍，而小球藻属于低等植物，由此推测GA3对蛋白核小球藻中脂质的积存可能具有必然的阻碍。
目前,GA3在农业生产上取得了普遍的应用,但关于外源GA3对蛋白核小球藻中脂质积存的阻碍还未见相关报导,笔者对此进行了研究并取得了初步的功效。
第二章材料与方式
蛋白核小球藻的培育
2.1.1藻种
本次实验利用的蛋白核小球藻（blankcontrolgroup），是澳大利亚昆山大学微藻研究所提供，实验前经扩繁并培育至对数生长期备用。
2.1.2藻种培育
在5L的三角瓶中加入3L的液体培育基，接种必然体积的原藻液。
光照下培育，由日光灯提供光照，其中光照与黑暗比为12h:
12h，光照强度为4000Lx，其培育温度为23℃恒温培育，天天手动摇瓶3至5次，藻种培育的营养液加盐频率为2周加一次1/4浓度的营养盐，待培育至生长对数期备用。
本实验藻种和实验用藻的培育采纳BBM培育基，其中各营养成份及浓度加样表如下：
盐标号
药品
工作液
母液（g）
每升藻液加营养盐量
200mL加营养盐量（µL）
A
KNO3
200mg
200
1mL
200
B
KH2PO4
20mg
20
1mL
200
C
MgSO4·7H2O
100mg
100
1mL
200
D
CaCl2•H2O
80mg
80
1mL
200
E
Na2-EDTA
µg
100µL
20
FeCl3·H2O
µg
100µL
20
F
ZnCl2
µg
100µL
20
H3BO3
µg
100µL
20
CoCl2·6H2O
µg
100µL
20
CuSO4·5H2O
µg
100µL
20
MnCl2·6H2O
µg
100µL
20
（NH）4Mo7O244H2O
µg
100µL
20
实验材料
2.2.1药品与试剂
蒸馏水、95%乙醇、丙酮、氯仿、甲醇、氮气等
2.2.2仪器和实验用具
三角瓶（250mL、5L）、饲养瓶（25mL）、研钵、擦镜纸、盖玻片、细线、封口膜、pH试纸、比色皿、量筒、胶头滴管、玻璃棒、药匙、试管、记号笔、移液枪、离心管（10mL、50mL）、称量纸、烧杯等。
氮吹仪（上海泉岛公司QSC—12T）
超声波破碎仪（美国SONICS）
台式低温离心机（HERAEUS）
电子天平（HANGPINGFA1004）
电热恒温鼓风干燥箱（DGF30/14—IIA）
可见分光光度计（上海光谱仪器723型）
高压蒸汽灭菌锅
超净工作台（DL—CJ—IN）
旋涡混合器（MVS—1）
实验方式
2.3.1蛋白核小球藻的激素诱导
实验设置GA3L、1mg/L、5mg/L、15mg/L、20mg/L、）6个质量浓度梯度和不用任何激素处置的空白对照，每一个质量浓度梯度设置三个重复，空白对照设置5个重复。
当藻液培育到对数生长期后，在超净工作台上将藻液分装至23个250mL的饲养瓶中（每瓶200mL），依次标记好各质量浓度梯度值，每一个浓度梯度下的重复组进行标记。
然后再别离将已装有藻液的饲养瓶于超净工作台上，添加相应浓度梯度的激素。
添加激素GA3完毕后转移至培育室光照下培育。
2.3.2实验藻的培育及培育条件
将接种好的藻液置于光照下培育，天天按时手动摇藻，一天3至5次；每6天向每一个接种过的三角瓶装中添加等量的蛋白核小球藻培育盐。
蛋白核小球藻生长的培育温度为24℃，光照与黑暗比为12h:
12h，白天光强约为4000Lx。
藻种培育时期天天按时摇藻（一日3至5次），每2周加盐一次，一次加入1/4倍数浓度的盐藻营养盐；诱导接种后一周加一次营养盐。
2.3.3蛋白核小球藻细胞生长标准曲线的测定
每隔三天，从每一瓶藻液中取4ml测定其吸光度值并记录。
然后依照测得数据作出生长曲线。
测按时均在超净工作台中操作，迅速取样，取样以后将各实验组放回培育箱按前述培育条件继续培育。
2.3.4蛋白核小球藻生物量的测定
从实验组蛋白核小球藻添加激素完毕后开始，每三天测定一次实验所设质量浓度梯度内各质量浓度实验组藻细胞的吸光度值，添加激素完毕后的测定为第一次吸光度值的测量值。
具体测定方式为：
在超净工作台上用移液枪别离从每一个时刻梯度的三个重复培育瓶中各抽掏出的藻液共，倒入石英比色皿中在450nm的波长下用分光光度计测定其吸光度值，并记录数据，以后每3天测定一次各组的吸光度值。
测按时均在超净工作台中操作，迅速取样，取样以后将各实验组放回培育箱按前述培育条件继续培育。
本次实验蛋白核小球藻的培育和吸光度值的测按时刻为12天，共测得各组的吸光度值4组数据。
2.3.5蛋白核小球藻细胞的富集搜集
依照前述培育条件将各组盐藻培育必然的时刻后（本实验培育了12天），在超净工作台上别离将各瓶藻藻液在转移至50ml的离心管中，并在离心管和盖子上做好对应的标记，配平后，放于低温高速离心机中，4℃下8000rpm转速离心10min；离心后将各离心管警惕地从离心机中掏出，除去上清；然后将搜集取得的藻泥置于-20℃的冰箱中冷冻保留，以备总脂含量的测定。
2.3.6蛋白核小球藻总脂含量的测定
藻细胞样品的预处置。
从冰箱中掏出离心搜集于离心管中，用于测总脂含量的藻细胞样品，放置到电热恒温鼓风干燥箱中，在100℃条件下干燥留宿去除多余水分；干燥后，佩带乳胶手套在干燥样品冷却前迅速用分析天平别离称量出各实验组干藻粉的质量m0，并记录数据。
称量后快速将已称量的干藻粉进行研磨，并加入等体积的氯仿和甲醇（二者体积比1:
2，现配现用）。
注意：
实验研磨进程中先加氯仿进行研磨，最后加入甲醇，再用氯仿配制成约4mL。
且药品有毒，操作时必然要在通风橱中进行，而且要戴上口罩和乳胶手套，避免吸入大量氯仿和甲醇而中毒。
研磨后将研磨液连同破碎物一路倒入10ml离心管，并做好对应标记，并用适量的已配好的氯仿和甲醇混合溶液冲洗残留在研钵上的破碎物和液体，冲洗后一并倒入离心管，尽可能保证冲洗干净。
超声波破壁。
对研磨后的样品进行超声波破壁处置（实验所用超声波细胞破碎仪是由美国SONICS公司提供的VC605型号）。
利用功率为40W，周期是1min，破壁15s，距离5s的3个循环的条件下进行破壁[16-17]。
在破壁进程中，注意要将离心管用冰浴作爱惜，以避免细胞破碎仪的探头发出的超声波产生高温，在破壁工作中对藻细胞造成灼伤。
离心。
将破壁完的藻液分装于两个50mL离心管中，配平后，放于低温高速离心机中，10000rpm条件下离心10min。
萃取。
离心完成后，将离心管警惕地从离心机中掏出，轻轻打开离心管的盖子，将上清液倒入以对应标记好的空的50ml离心管中，并按体积3:
1（氯仿：
上清液）的比例加入氯仿并涡旋混匀。
以后再加入与氯仿等体积的蒸馏水并涡旋混匀，静置待其分层（共分三层：
上层水层，中层杂质，基层有机相）。
配平后，于低温高速离心机中，10000rpm条件下离心10min。
用移液枪警惕地抽取基层有机相转入预先烘干并称重（m1）的10ml离心管中，用氮吹仪吹干有机溶剂后，将离心管烘干称重（m2）并记录数据，氮吹仪水浴温度设定为60℃。
计算。
总脂含量的计算公式为：
总脂含量百分比=（m2-m1）/m0×100%
第三章结果与讨论
GA3对蛋白核小球藻总脂含量积存的阻碍
GA3浓度（mg/L）
1
5
10
15
20
0
总脂含量
%
%
%
%
%
%
%
表各组的总脂含量
图各组的总脂含量柱状图
表、图是通过氯仿-甲醇法提取油脂经吹干后测得的对照组和各实验组的总脂含量。
从表中能够看出，实验组（添加GA310mg/L和15mg/L）的总脂含量均比对照组大，说明浓度为10mg/L和15mg/L的赤霉素（GA3）实验组的总脂含量积存有增进作用；而实验组（添加GA320mg/L）的总脂含量比对照组小，说明浓度为20mg/L的赤霉素（GA3）实验组的总脂含量积存有抑制作用；在实验所设置的浓度梯度内，15mg/L实验组的总脂含量最高，是对照组的倍，增进作用最明显，10mg/L实验组次之；且随着添加赤霉素（GA3）浓度的增加其增进作用在慢慢减小，当达到20mg/L时，那么具有必然的抑制作用。
进行工业化生产的选择参考分析
综合分析赤霉素（GA3）对蛋白核小球藻的生长和总脂含量积存的阻碍，结果别离是：
15mg/LGA3实验组的结果最大说明：
该浓度下的激素能够增进蛋白核小球藻的产油和总脂的积存；因此，15mg/LGA3实验组作为进行工业化生产的选择参考。
第四章结论
赤霉素（GA3）对蛋白核小球藻总脂含量的累阻碍：
赤霉素（GA3）对蛋白核小球藻总脂含量的积存有增进作用；且随实验组添加赤霉素（GA3）浓度的增加，其对蛋白核小球藻总脂含量积存的增进作用在减小。
其中，15mg/L实验组的总脂含量最高，比对照组提高了%，是对照组的倍。
对工业化生产提供的参考：
在实验所设置浓度梯度内赤霉素（GA3）处置15mg/L的实验组总脂含量最高，能够为微藻产油的工业化生产提供选择参考。
参考文献：
[1]Lopez-GalarzaS,PascualB.Theinfluenceofwintergibberellicacidapplicationsonearliness,productivityandotherparametersofqualityinstrawberrycultivationontheSpanishMediterraneancoast[J].ActaHort,1989,265:
217-222.
[2]杨艳,卢滇楠,李春,等.面向21世纪的生物能源.化工进展,2002,21（5）:
299~30
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