第九章 维生素类药物的分析.docx

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第九章维生素类药物的分析

第九章维生素类药物的分析

第九章维生素类药物的分析[基本要求]一、掌握维生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。

二、掌握维生素类药物的鉴别原理与方法。

三、掌握三点校正法测定维生素A的原理、测定方法与计算方法。

四、掌握维生素D的HPLC含量测定法和维生素E的GC含量测定法。

五、掌握维生素B1非水溶液滴定法与维生素C碘量法的测定原理、方法与注意事项。

六、熟悉本类药物其他的含量测定方法。

七、熟悉本类药物杂质检查方法。

八、了解维生素A三点校正法的推导过程。

[重点、难点、基本概念]一、结构特点与分析方法之间的关系

（一）维生素ACH2ORCH3CHCH33CH3CH31．共轭多烯结构：

具有紫外吸收，可采用紫外吸收光谱法进行鉴别，采用紫外分光光度法进行含量测定。

天然维生素A是全反式维生素A。

2．结构式中R的不同，可以形成维生素A醇或其酯。

临床上多用其醋酸酯和棕榈酸酯。

（二）维生素DCH2CH3CH3HHOCH3HHCH3CH3HHCH2CH3HHOCH3HHCH3CH3H维生素D2维生素D31．开环的甾体：

具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。

2．手性碳原子：

具有旋光性，可用于鉴别。

3．多烯：

可进行紫外检测。

（三）维生素E维生素EOOCH3CH3CH3CH3CCH3OCH3CH3CH3CH31．芳环：

具紫外吸收，可用于鉴别。

2．乙酰化的酚羟基：

水解后生成生育酚，可发生三氯化铁反应和氧化还原反应，用于鉴别。

（四）维生素B1NNNH3N+SOHCH3H3CCl,HCl维生素B11．氨基嘧啶环和噻唑环：

具有硫色素反应，此反应专属性强，用于鉴别和含量测定。

具杂环的沉淀反应，与生物碱沉淀剂反应，产生沉淀，用于鉴别与含量测定。

2．共轭体系：

具紫外吸收，用于含量测定。

3．盐酸根：

呈氯化物的反应，用于鉴别。

（五）维生素COHOHOHOHOHO维生素C1．烯二醇结构：

具有强环原性，可发生氧化还原反应，用于鉴别和含量测定。

2．与糖类似的结构：

具有糖类似的性质和反应，可用于鉴别。

二、鉴别方法

（一）化学鉴别法药物反应名称试剂现象维生素A三氯化锑反应饱和无水三氯化锑即显蓝色，渐变紫红（Carr-Price反应）的无醇氯仿溶液维生素D醋酐-浓硫酸醋酐、硫酸D2黄红紫绿。

反应D3黄红紫、蓝绿绿三氯化锑反应三氯化锑试液即橙红色，渐变粉红三氯化铁反应三氯化铁试剂橙黄维生素E硝酸反应硝酸橙红水解后的三氯2，2-联砒啶血红化铁反应三氯化铁维生素B1硫色素反应铁氰化钾试液强烈的蓝色荧光，酸化后荧光消失，再碱化后，荧光复现沉淀反应碘化汞钾淡黄色沉淀碘红色沉淀硅钨酸白色沉淀苦酮酸扇形白色结晶氯化物反应硝酸铅反应氢氧化钠、硝酸铅黑色沉淀维生素C硝酸银反应硝酸银试液黑色沉淀2，6。

二氯2，6。

二氯靛酚试液颜色消失靛酚反应试液其他氧化剂亚甲蓝或高锰酸钾试剂褪色的反应碱性酒石酸铜砖红色沉淀磷钼酸钼蓝糖类的反应三氯醋酸、吡咯50℃产生蓝色

（二）紫外-可见吸收光谱法：

药物溶剂浓度判断维生素A无水乙醇-盐酸在300～400nm范围内扫描，应仅在326nm初有单一吸收峰；经水浴加热30秒，应在348、367、389nm处有三个尖锐的吸收峰维生素E无水乙醇1%在284nm处有最大吸收，254nm处有最小吸收维生素C0.01mol/L盐酸在243nm处有唯一的最大吸收维生素D96%乙醇加乙醇和85%硫酸，D显红色，在570nm处有最大吸收，D显黄色，在495nm处有最大吸收（三）TLC法1．维生素A：

比较供试品溶液和对照品溶液所显蓝色斑点的位置。

2．维生素E：

在规定的条件下进行试验，-生育酚、-生育酚醋酸酯、-生育醌的Rf值分别为0.5、0.7、0.9。

（四）旋光法--维生素D比旋度的测定药物溶剂浓度比旋度值注意事项维生素D2无水乙醇40mg/ml+102.5～+107.5应于容器开启维生素D3无水乙醇5mg/ml+105～+11230分钟内取样，在溶液配制后30分钟内测定三、杂质检查1．中杂质的检查药物检查项目检查方法维生素E酸度以NaOH滴定液（0.1mol/L）体积控制游离生育酚硫酸铈滴定法维生素C有色杂质分光光度法四、含量测定方法

（一）维生素A的测定维生素A含量测定方法有紫外分光光度法和三氯化锑比色法，前者是法定方法，后者多用于食品或饲料中的维生素A的测定。

中国药典采用三点校正法。

1．为何要采用三点校正法？

维生素A原料药中常混有杂质，如维生素A2、维生素A3、维生素A的氧化产物、鲸醇以及维生素A的异构体，这些杂质在维生素A的最大吸收波长附近有吸收，干扰维生素A的测定。

采用三点校正法可以消除这些杂质的干扰。

2．测定原理该法基于两点：

1）在310～340nm范围内，杂质吸收呈一直线，且随波长的增大吸收度下降。

2）物质对光吸收呈加和性波长的选择：

一点选在维生素A的最大吸收波长处

（1），其它两点选在1的两侧。

第一法（等波长差法）的三个波长为1=328nm、2=316nm、3=340nm；第二法（等吸收比法），使A2=A3=6/7A1，则三个波长为1=325nm、2=310nm、3=334nm。

3．测定方法首先判断用哪个吸收度进行含量计算。

第一法：

供试液浓度为9～15IU/ml，溶剂为环己烷，在300、316、328、340、360nm五个波长处测定吸收度。

1）最大吸收波长在326～329nm之间，计算吸收度比值Ai/A328，并与规定值相减，差值不超过0.02，则用A328计算含量：

CLAEcm=1%11900/%cm11=EgIUWgIUggIUIU==////丸丸%100/%=表示量丸标示量IU或：

标示量标示量=LWWDA1001900%2）如果最大吸收波长在326～329nm之间，5个波长下的差值有一个或几个超过0.02，这时先计算A328（校正）：

）2（52.3）（340326328328AAAA=校正328328328）（AAA校正再计算若所得的数值在3%，则仍用A328计算含量；若所得的数值在-15%～-3%之间，则需用A328（校正）计算含量；若所得的数值小于-15%或大于+3%，或最大吸收波长不在326～329nm之间，则应采用第二法（皂化法）测定。

4．讨论1）维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导而来：

维生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或6/7定位法）推导而来。

2）在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。

如果仪器波长精度不准确时，会产生较大误差。

因此，在测定前务必要校正波长，并可用全反式维生素A进行测定，比较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对仪器波长是否准确。

测定的样品应不得少于两份。

3）中国药典（2019年版）收载的维生素A胶丸、维生素AD滴剂、维生素AD胶丸等均采用三点校正法测定。

（二）维生素D中国药典（2019年版）采用正相高效液相色谱法测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯，该法分为三个方法。

第一法：

用于无维生素A醇及其它杂质的干扰的情况，步骤如下：

1．系统适用性试验：

测定重复性和分离度。

2．测定校正因子：

f2=（ASmr-f1mSAr1）/（Ar1mS）3．含量测定：

mi=（f1Ai1+f2Ai2）mS/AS第二法：

用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：

1．皂化处理：

皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙醚、制备供试液A。

2．净化：

供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制备成供试液B。

3．含量测定：

取供试液B按第一法测定。

第三法：

用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况，步骤如下：

1．制备供试液C。

2．含量测定：

在第一法的色谱条件下，交替精密进样对照液和供试液C，按外标法定量。

（三）维生素E测定维生素E的法定方法是GC法，另外还有HPLC法、铈量法、比色法和荧光法。

1．采用GC的优点：

GC法具有高度选择性，可分离维生素E及其异构体，可选择性地测定维生素E。

2．测定步骤：

系统适用性试验：

测定理论塔板数（按维生素E计算）测定维生素E与内标物（正三十二烷）的分离度测定校正因子：

xxssmAmAf=测定含量：

ssxmAAfm=（四）维生素B1维生素B1及其制剂的测定方法有非水溶液滴定法、紫外分光光度法、硅钨酸重量法和硫色素荧光法。

中国药典（2019年版）采用非水溶液滴定法测定原料药，采用紫外分光光度法测定片剂和注射液。

1．非水溶液滴定法：

分子中有两碱性基团，均可与高氯酸作用，其摩尔比为1∶2，分子量为337.27，滴定度为16.86mg/ml。

2．紫外分光光度法：

用盐酸溶液（91000）将维生素B1片粉中的维生素B1溶出，经过滤、稀释后于246nm测定吸收度，计算含量。

标示量标示量=WEWDAcm100%%11（五）维生素C维生素C可采用碘量法、2，6-二氯靛酚法、比色法、紫外分光光度法和HPLC法。

其中碘量法是维生素C原料及其制剂的法定方法。

1．碘量法原理：

维生素C具有较强的还原性，在醋酸性条件下，可被碘定量的氧化。

讨论：

醋酸的作用：

维生素C再酸性介质中受空气中氧的氧化速度减慢。

加新沸过的冷水：

减少水中溶解的氧对测定的影响。

2．2，6-二氯靛酚滴定法原理：

维生素C具有较强的还原性，在酸性条件下，可被2，6-二氯靛酚氧化。

指示终点方法的特点：

在酸性溶液中，氧化型的2，6-二氯靛酚为红色，当与维生素C反应后，即转变为无色的酚亚胺（还原型），因此，用2，6-二氯靛酚滴定液滴定至溶液显玫瑰红色时，即为终点，无需另加指示剂。

[练习题及答案]一、练习题[A型题]1.维生素B1的鉴别方法是A.三氯化铁反应B.硫色素反应C.柯柏反应D.与碱性酒石酸铜试液反应E.双缩脲反应2.维生素E《中国药典》规定的含量测定方法为A.非水溶液滴定法B.旋光法C.HPLC法D.紫外分光法E.GC法[B型题]A.亚消基铁氰化钠反应B.硫色素反应C.硝酸反应D.三氯化锑反应E.硝酸银试液的反应1.维生素C2.维生素E3.维生素B14.维生素A[X型题]1.用碘量法测定的药物有A.醋酸地塞米松B.丙酸睾酮C.维生素CD.硫酸阿托品E.维生素C注射液2.可用紫外分光光度法测定含量的药物有A.维生素A丸剂B.丙酸睾酮C.维生素AD.硫酸阿托品E.维生素B1片二、答案精讲[A型题]1.B硫色素反应是维生素B1的特殊反应,可用于鉴别。

故选B。

2．E维生素类药物的含量测定，《中国药典》只规定维生素E的含量测定，采用GC法。

故选E。

[B型题]1.E2.C3.B4.D[X型题]1.CE维生素C及其注射剂的含量测定方法均采用碘量法，故选C，E。

2．ACE维生素A及其制剂和维生素B1片的含量测定均采用紫外分光光度法，故选A，C，E。