猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较分析.docx

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猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较分析

猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较

试验方案

猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较

参考编号

试验的日期

动物试验

开始日期

2014--

动物试验

完成日期

2014--

实验室试验

开始日期

2014--

实验室试验

完成日期

2014--

动物试验

地点

实验室试验地点

省农科院兽医所

试验负责人

邵国青

动物试验

负责人

志新、熊祺琰、华利忠

动物试验参与者

甘源、王佳、徐飞扬、财

实验室试验

负责人

志新、熊祺琰、华利忠

实验室实验参与者：

志新、熊祺琰、马庆红、财、王佳

试验方案起草人

志新、熊祺琰、华利忠

试验方案讨论参加者

邵国青、茂军、志新、熊祺琰

试验方案定稿人及时间

2014-

记录的附件页数

猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较

1目的

猪支原体肺炎活疫苗AN306菌株与原168菌株的肺注射免疫效果比较；

猪支原体肺炎疫苗（天邦、正业、辉瑞）免疫效果比较；

2材料与方法

2.1材料

2.1.1待试的疫苗产品与试剂

2.1.1.1疫苗

A.猪支原体肺炎活疫苗AN306株F321，由省农业科学院兽医所研制，规格为2×107CCU/瓶（2ml冻干），批号为20140325。

有效期：

______。

PCR鉴定:

Mhp_____，Mhr_______。

B.猪支原体肺炎活疫苗（168株），由天邦生物科技提供，规格为50头份/瓶，批号为139078-1。

有效期：

______。

PCR鉴定:

Mhp_____，Mhr_______。

C.猪支原体肺炎活疫苗（乳兔继代株），由正业生物科技提供，规格为4头份/瓶，批号为2014002。

有效期：

_20150110__

D.猪支原体肺炎灭活疫苗（P-5722-3株，SuvaxynRespiFendMH），由硕腾（辉瑞）提供，规格为50头份/瓶，批号为1302777A。

有效期：

15/11/16_

2.1.1.2试剂

A．猪支原体肺炎活疫苗（乳兔继代株）稀释液,批号：

2014002；有效期：

20170115

B．猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液

C．猪支原体肺炎肌注活疫苗佐剂G-1-1

2.1.2动物

选择猪肺炎支原体抗体、抗原均阴性的5-10日龄仔猪，54头.

饲养地点：

省农科院兽医所

饲养员：

_徐飞扬，才__

仔猪免疫状况：

未打气喘病疫苗。

2.1.3动物饲料

仔猪料:

2.1.4设备

气雾免疫设备、滴鼻头、20（10、5、2）ml注射器、耳标、耳号钳、冰盒、相机、解剖器械、离心管。

2.1.5攻毒用强毒

猪肺炎支原体强毒JS株组织强毒，来自本所，批号20130625，-20℃保存，有效期至：

2014/06/25。

2.2方法

2.2.1动物分组说明

G1:

-猪支原体肺炎活疫苗168株肺免疫组。

每头猪肺注射免疫1头份（1ml）即1×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。

免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。

G2:

-猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺免疫组。

每头猪肺注射免疫1ml，即1×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗AN306株。

免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。

G3:

-猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。

每头猪气雾免疫5×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。

免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。

G4:

-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。

每头猪肌肉注射免疫5×107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。

首免后两周二免，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。

G5:

-猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。

每头猪肌肉注射免疫1头份（2ml）猪支原体肺炎灭活疫苗。

首后2周，加强免疫一次，首免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。

G6:

-猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。

每头猪胸腔注射免疫1头份（5ml）猪支原体肺炎乳兔活疫苗。

免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖杀。

G7:

-猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。

每头猪滴鼻免疫？

头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。

免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。

G8:

-健康对照组（不免疫，不攻毒）。

不接种疫苗。

不攻毒，其它组攻毒后28天剖杀。

G9:

攻毒对照组（不免疫，只攻毒）。

不免疫疫苗，只攻毒，攻毒后28天剖杀。

2.2.2动物分组与试验操作概表

组号

组别

疫苗

剂量

DPI-0

DPI-7

DPI-14

DPI-21

DPI-28

DPI-35

DPI-42

DPI-70

168肺组

天邦

1×107CCU/头（1头份）

肺免疫/采血/鼻拭子/称重

鼻拭子

采血/鼻拭子

鼻拭子

采血/鼻拭子

鼻拭子

采血/鼻拭子/攻毒/称重

剖检/称重

AN306肺组

ADC

1×107CCU/头

168气雾组

天邦

5×107CCU/头

气雾免疫/采血/鼻拭子/称重

168肌注组

天邦

5×107CCU/头

肌注免疫/采血/鼻拭子/称重

肌注免疫/鼻拭子

采血/鼻拭子

灭活苗组

辉瑞

2ml/1头份

乳兔苗胸腔组

正业

5ml/1头份

胸腔免疫/采血/鼻拭子/称重

采血/采血/鼻拭子

鼻拭子

乳兔苗滴鼻组

正业

1头份

滴鼻免疫/采血/鼻拭子/称重

健康对照组

采血/鼻拭子/称重

攻毒对照组

称重

攻毒/称重

总计

2.2.3免疫

G1—猪支原体肺炎活疫苗168株肺免疫组

用灭菌生理盐水50ml溶解168活疫苗冻干粉1瓶，使活疫苗终浓度为1×107CCU/ml，1头份/ml。

每头猪肺免疫1ml，即1×107CCU/头。

G2—猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺免疫组

用灭菌生理盐水溶解AN306活疫苗冻干粉，使活疫苗终浓度为1×107CCU/ml。

每头猪肺免疫1ml，即1×107CCU/头。

G3:

-猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。

将1瓶168株活疫苗用5ml无菌猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液溶解稀释成1×108CCU/ml浓度，取5ml疫苗溶液倒入喷雾器，对保温箱中的6头仔猪进行气雾免疫（0.2MPa，约10min）。

G4:

-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。

将1瓶168株活疫苗用25ml佐剂G-1-1溶液稀释成2×107CCU/ml浓度，每头仔猪颈部肌肉注射免疫2.5ml，注射时分左右侧肌肉共2个注射点。

首免后14天二免，方法同上。

G5:

-猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。

按猪支原体肺炎灭活疫苗说明书，每头猪肌肉注射免疫1头份猪支原体肺炎灭活疫苗。

G6:

-猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。

按猪支原体肺炎乳兔活疫苗说明书，每头猪胸腔免疫1头份猪支原体肺炎活疫苗。

G7:

-猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。

每头猪滴鼻免疫？

头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。

免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖杀。

G8—健康对照

不免疫

G9—攻毒对照

不免疫

2.2.4疫苗免疫后临床症状观察记录

免疫后观察并记录可能出现的临床症状，填写附录3。

尤其要记录如下重要的症状：

咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤、死亡等

2.2.5疫苗免疫后血清抗体及分型检测

除攻毒对照组外，其余各组于免疫前、免疫后2、4、6周取3头猪各采血1ml（两次免疫组于首免前、首免后3、4、6周采血），分离血清，用自制P46-ELISA试剂盒检测IgG抗体。

对于阳性者继续用分型试剂盒检测IgG亚类。

2.2.6疫苗免疫后细胞免疫指标检测

除攻毒对照组外，其余各组于首免后2、4、6周取3头猪各采集抗凝血5ml（两次免疫组于免疫后3、4、6周采血），其中1ml用于血液生化检测；1ml用流式细胞仪检测CD4+T细胞、CD8+T细胞含量、CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+/CD8+比率；另外3ml用于淋巴细胞增殖试验和IFN-γ检测

2.2.7疫苗免疫后黏膜免疫指标检测

除攻毒对照组外，其余各组于免疫前、首免后7、14、21、28、35、42天采集鼻拭子样品，检测吸呼道特异性sIgA抗体。

2.2.8攻毒

将每瓶猪肺炎支原体组织强毒用50ml生理盐水稀释，气管途径接种试验组试验猪，每头5ml。

2.2.9攻毒后临床症状观察

所有猪在攻毒后按附录2要求观察临床症状

2.2.10日增重计算

各组分别选定3头猪，不采集血样，分别于首免当天、攻毒当天和剖杀当天称重，计算日增重。

2.2.11攻毒后肉眼病变剖检

所有仔猪在攻毒后的第28天进行宰杀，记录肺病变，用28分法统计确定肺病变程度，并记算攻毒保护率（见附录1）。

2.2.12攻毒后病理损伤观察

剖杀后，采集所有猪左尖叶，福尔马列林溶液固定后，切片观察病理损伤。

2.2.13攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测

剖杀后，每头猪用50ml生理盐水采集肺泡灌洗液，用定量PCR方法检测猪肺炎支原体抗原。

附录1攻毒保护率计算

攻毒保护率的统计与评判：

试验猪扑杀后，分别记录左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶、副叶病变百分比率，将0～25%记为1；26～50%记为2；51～75%记为3；76～100%记为4，统计每个试验猪病肺病变指数（最高为28）。

试验猪病变指数大于10判为发病，小于4为健康（排除猪肺炎支原体感染），根据肺病变指数，按以下公式计算试验猪攻毒保护指数。

试验猪攻毒保护指数＝（攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值－试验猪肺病变指数）/（攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值－不攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值）％

试验猪攻毒保护指数小于60％为无保护，大于或等于60％为有保护，再按以下公式计算试验猪攻毒保护率。

试验猪攻毒保护率＝有保护试验猪数/试验猪数

试验在阳性对照组全部发病、阴性对照组至少全部健康时有效。

附录2猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准

评判参数

最高分

咳嗽

无

有

严重

呼吸困难

无

有

严重

呕吐

无

有

严重

俯卧

无

有

严重（躺卧）

食欲不振

无

有

震颤

无

有

死亡

无

有

注射后第1日（D1）直肠温度高出围

1.0℃以下

1.0℃～1.5℃

1.5℃以上

注射后第2日（D2）直肠温度高出围

1.0℃以下

1.0℃～1.5℃

1.5℃以上

注射后第3日直肠温度较对照组高出围

0.5℃以下

0.5～1.0℃

1.0℃以上

累计总分

猪安检试验中，每头试验猪症状全部累计，总分不大于2判为安全，累计总分大于5判为不安全，累计总分2～5，可重检1次，重检累计总分不大于2安全。

附录3动物分组记录表

猪场：

农科院

组别

头数

标记

耳号

G1168肺组

G2AN306肺组

G3168气雾组

G4168肌注组

G5灭活苗组

G6乳兔苗肺组

G7乳兔苗滴鼻组

G8健康对照

G9攻毒对照

附录4动物免疫记录表

动物免疫日期:

组

标记

疫苗

免疫途径

剂量

猪（头数）

G1168肺组

G2AN306肺组

G3168气雾组

G4168肌注组

G5灭活苗组

G6乳兔苗肺组

G7乳兔苗滴鼻组

操作人:

复核人：

附录5免疫后异常临床症状观察记录表

组：

猪数：

日期：

标记：

猪号

观察

日期

第几日

附录6抗体检测记录表

组别

耳标

DPI14/21

DPI28

DPI42

IgG

亚类

IgG

亚类

IgG

亚类

耳标

DPI14/21

DPI28

DPI42

IgG

亚类

IgG

亚类

IgG

亚类

附录7淋巴细胞增殖试验结果

附录8血象分析

附录9T淋巴细胞分类计数

附录10黏膜抗体检测记录表

附录11攻毒记录单

攻毒株:

批号：

来源：

稀释液：

批号：

来源：

在实验室稀释日期:

管（毒液）

批号

量

稀释

动物攻毒

日期:

组

猪（头数）

攻毒途径

剂量

耳号

操作人：

复核人：

附录12特殊情况记录表

日期:

组:

隔离器：

观察：

签名:

日期:

组:

隔离器：

观察：

签名:

－如有特殊情况，比如转群，疾病，用药，换料等影响动物的事件。

填写“附录12:

特殊情况记录”

注：

试验负责人员（SGQ,LMJ）应定期现场核查饲养情况，以及攻毒后的临床症状等，并在临床观察以及饲养记录上签字及日期。

及时将原始数据传递至JAAS，便于沟通。

附录13攻毒后临床症状观察记录表

组

耳号

临床症状记录与评分

症状类型

评分

组

耳号

临床症状记录与评分

症状类型

评分

附录14日增重记录

组别

耳标

DPI0

DPI42

DPI70

日增重

人重

总重

猪重

人重

总重

猪重

人重

总重

猪重

DPI0-42

DPI-0-70

组别

耳标

DPI0

DPI42

DPI70

日增重

人重

总重

猪重

人重

总重

猪重

人重

总重

猪重

DPI0-42

DPI-0-70

附录15攻毒后肺部剖检记录

组

耳号

肺部照片

背侧面

腹侧面

组

耳号

肺部照片

背侧面

腹侧面

附录16攻毒后剖检记录

组

耳号

肺叶病变指数

攻毒保护率

左尖叶

左心叶

左膈叶

右尖叶

右心叶

右膈叶

副叶

总分

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