无定形磷酸钙负载rhBMP.docx

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无定形磷酸钙负载rhBMP

无定形磷酸钙负载rhBMP2纳米缓释体的制备及细胞毒性实验

【摘要】制备无定形磷酸钙（ACP）负载重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2／ACP）纳米缓释体并观察其细胞毒性，为进一步体内植入提供实验依据。

［方法］采用湿化学法合成rhBMP2／ACP纳米缓释体；兔间充质干细胞（BMSCs）与rhBMP2／ACP纳米缓释体进行体外复合培养，观察细胞在材料表面的黏附、增殖及功能表达，检测材料的细胞毒性。

［结果］材料浸提液对兔BMSCs的生长无影响，其细胞相对增殖率在1002％～1025％之间，细胞毒性评级为0级；BMSCs于复合材料表面的黏附、生长速度、形态与对照组无明显差别。

［结论］rhBMP2／ACP纳米缓释体无细胞毒性，复合培养不影响BMSCs的正常生理功能，细胞相容性良好。

【关键词】重组人骨形态发生蛋白-2无定形硫酸钙细胞培养骨髓间充质干细胞细胞毒性

Abstract:

［Objeetive］Todeveloptherecombinanthumanbonemorphogeneticprotn2（rhBMP2）loadedamorphouscalciumphosphate（ACP）delayedreleasenanosizedmaterial，investigateitscytotoxicityofcell，andprovideareferencefortheexperimentofcompositematerialinvivo．［Method］The　rhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialwerepreparedbychemicalwetmethodandculturedonrabbitbonemarrowderivedmesenchymalstemcells（BMSCs）invitro．Thentheadhesion，proliferation，growthandfunctionalexpressionofBMSCsweremeasured．［Result］CytotoxicitytestdemonstratedthatrhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialhadnotaffectthepercentageofcell’sproliferationwithmaterialextractedliquidculturedwithBMSCsandthecytotoxicitywasgradedzero．Theadhesion，proliferation，configurationofthecellsonthesurfaceofthismaterialwereidenticaltothecontrolgroup．［Conclusion］ItwassuggestedthatrhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialmighthavegoodcellularbiocompatibility,nocytotoxicityandnoteffectedthenormalfunctionalexpressionofBMSCsinvitro．

Keywords:

rhBMP2；amorphouscalciumphosphate；cellculture；BMSCs；cytotoxicity

　目前，骨修复替代材料的研究在生物取材、细胞的体外培养、支架材料复合体等诸多方面积聚了丰厚的基础。

无定形磷酸钙（amorphouscalciumplosphate，ACP）是在采用湿化学法合成羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）时发现一种磷酸钙的无定形中间相，是一类X射线衍射为非晶态的磷酸钙材料的总称，具有典型的无定形物质的球形面貌。

研究发现ACP的骨传导及细胞黏附性能优于HA〔1〕，生物降解速率高于磷酸三钙〔2〕，可降解可任意塑形，其化学组分、磷酸钙颗粒的表面形态、表面亲水性等，能满足药物分子和人体细胞对载体的多重要求〔3〕，但ACP不具备诱导成骨能力、降解速率不易控制等缺点。

作者采用ACP包裹重组人骨形态发生蛋白2（recombinanthumanbonemorphogeneticprotn2，rhBMP2），通过湿化学法合成技术，制备出rhBMP2／ACP纳米缓释体，以期发挥单一材料的原本优势，克服ACP的劣势和rhBMP2易被体液稀释及蛋白酶分解不能充分发挥成骨诱导活性等不足，进一步提高材料的综合性能。

本研究在rhBMP2／ACP纳米缓释体研制等前期实验的基础上，观察兔骨髓间充质干细胞（bonemarrowderivedmesenchymalstemcells，BMSCs）在材料表面的黏附、增殖及功能表达，评价其细胞毒性。

1材料和方法

11rhBMP2／ACP纳米缓释体的制备

在ACP原研技术条件下〔4〕，取适量K2HPO4、CaCl2分别溶于乙醇形成A、B液，rhBMP2溶于A液，于B液中添加适量有机物静置过夜后，将A液缓慢滴加到B液中，在反应体系中加入01mol的NaOH以使pH保持在7左右，反应2h，经抽滤、洗涤，脱水干燥，获得rhBMP2／ACP纳米缓释体。

经X线衍射检测成品表征为无定形相；扫描电镜观察纳米颗粒均匀圆整，具有较好的球形形貌

（1）。

纳米缓释体中rhBMP2释放起始量1d为（1399±166）％，呈现快速释放，随后则维持有效浓度持续缓慢释放，30d时累积释放量为（4576±460）％（图2），符合双向动力学释放规律。

12rhBMP2／ACP纳米缓释体的细胞毒性实验

121实验材料

1211主要试剂：

DMEM培养液（美国Gibco）；胎牛血清（杭州四季青）；胰蛋白酶（美国Sigma）；MTT试剂（南京创瑞）；二甲基亚砜（DMSO，南京创瑞）；碱性磷酸酶试剂盒（ALP，南京建成）。

1212主要仪器：

倒置相差显微镜（德国Zeiss）；光学显微镜（日本Olympus）；扫描电镜（日本Hitachi）；超净台（苏州净化仪器厂）；细胞培养箱（德国Herabus）；台式高速普通离心机（德国Heraeus）；低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂）；酶标仪（美国BIORAD）；微量移液器（法国Gilson）；电热恒温水浴箱（上海医用恒温设备厂）。

122材料浸提液制备

取rhBMP2／ACP纳米缓释体实验材料（以下简称实验材料）的固相粉末3g，经60Co25kGy辐射灭菌后，浸入30ml浸体介质（含10％胎牛血清的DMEM培养液）中，置37℃、5％CO2、100％湿度孵育箱内静置浸提，10d后取其上清液移入无菌玻璃容器内密封备用。

123材料试件制备

将湿化学法合成制备的实验材料、对照材料（ACP由南京工业大学提供）预制成直径2mm，厚度为3mm圆形标准试件，聚乙烯塑料袋双层包装，经60Co25kGy辐射灭菌后备用。

124实验方法

1241BMSCs细胞的分离与培养取出生3d内的乳兔（南京金陵种兔场提供），颈椎脱臼法处死后置于75％酒精中浸泡20min消毒，无菌条件下取双侧肱骨以及股骨，剔去肌肉，用含10％胎牛血清的DMEM培养液冲洗髓腔以及干骺端，以107个／ml的细胞密度接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2、饱和湿度的孵育箱内培养，48h后弃去未贴壁的细胞，更换新鲜培养液，以后每3d更换一次培养液，细胞长到80％融合时，用025％的胰蛋白酶消化，按104个／cm2的细胞密度传代培养，以第3代细胞作为实验细胞。

1242细胞增殖率检测（MTT法）将常规收集的第3代BMSCs，用025％胰酶消化计数后分为2组：

实验材料组加100％浸提液，对照组加DMEM培养液，每组复种8孔，置37℃、5％CO2、100％湿度孵育箱内静置培养，倒置显微镜观察细胞生长形态；于接种后2d、4d、6d和8d，分别进行MTT检测：

每孔加入MTT溶液20μl，培养4h后用移液器吸除孔内培养上清液，再于每孔内加入DMSO150μl，振荡5min，待完全溶解后，置酶标仪500nm波长处测定各孔吸光光度值，各组所测结果取平均值，计算细胞相对增殖率（relativegrowthrate，RGR）。

RGR=实验组吸光度值／对照组吸光度值×100％。

1243细胞黏附率检测将实验材料试件置入培养板孔内，调整密度为5×105／ml的细胞悬液滴加到材料上，置孵育箱内培育4h，PBS缓冲液冲洗，去除未黏附的细胞，以025％的胰酶消化计数后计算细胞黏附率。

黏附率=黏附细胞数／总细胞数×100％。

设相同面积ACP材料作为对照。

　　1244细胞形态观察将实验材料试件安放于24孔培养板孔底，与1×105／ml密度的BMSCs直接接种于材料上，常规培养8d后取出试件，以3％戊二醛固定，PBS缓冲液漂洗3次，30%～100％梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金，扫描电镜观察。

1245ALP含量检测取第3代BMSCs与实验材料（ACP材料为对照）复合培养，分别于2d、4d和8d终止，弃去培养液，PBS缓冲液漂洗3次，每孔加入Tritonxl00细胞裂解液100μl，4℃24h充分裂解细胞，酶标仪450nm处测定各孔吸光度值，计算ALP含量。

125学方法

采用SPSS100统计处理，数据用均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析，P＞005为无显着性差异。

2结果

21细胞相对增殖率（MTT法）

RGR实验材料组为1002％～1025％，空白对照组为100％，两组间无显着性差异（P＞005）；两组细胞毒性评级均为0级。

表明实验材料对兔BMSCs无细胞毒性（见表1）。

22细胞黏附率测定

BMSCs在实验材料表面的黏附率为（838±86）％，对照组为（789±72）％，两组间差异无统计学意义（P＞005）。

23细胞生长形态观察

倒置相差显微镜下观察：

贴壁细胞胞膜完整，胞浆饱满，胞核明显，具有正常的细胞形态（3）。

2d时实验材料边缘可见细胞附着生长，细胞多呈梭形，似成纤维细胞（图4）。

4d时细胞在材料完全铺展，细胞形态为梭形、多角形，胞体伸出细长突起，生长趋势良好。

第8d细胞已铺满瓶底，呈多层集结，排列无规律。

动态观察中，未见细胞形态发生改变。

传代细胞形态与原代相似。

扫描电镜可见实验材料表面及孔隙中有大量细胞黏附、增殖、生长，细胞呈梭形或多角形，并从胞体伸出数量不等、长短不一、形态各异的突起，相互　，生长活跃（图5、6）。

表1MTT检测结果及细胞毒性分级

测定时间点实验组OD值（±s）RGR（%）毒性分级对照组OD值（±s）RGR（%）毒性分级2d0323±0023102500315±0023100004d0686±0025100400683±0020100006d0935±0022100200933±0021100008d1227±0025100201225±001910000图1扫描电镜下材料的形态图图2rhBMP2累积释放曲线图3倒置相差显微镜下观察第3代BMSCs细胞形态图4实验材料与BMSCs共培养第2d细胞形态图5、6扫描电镜下实验材料与BMSCs共培养第8d细胞形态（×400，×1500）24ALP含量测定

各时间点ALP含量见表2，2d时两组ALP无明显差别（P＞005），随培养时间的增加，实验材料组明显高于ACP材料组，两组间差异有统计学意义（P005）。

表2两组材料各时间点ALP含

　　3讨论

理想的载体材料应具备与种子细胞的良好相容性、形状的可塑性、易降解性和低抗原性等优点〔5〕。

羟基磷灰石、磷酸三钙和生物活性玻璃等无机高分子材料具备良好的材料界面，但材料脆性大，不易降解或降解速率难以控制，故　受到限制。

ACP是一种不同于羟基磷灰石和磷酸氢钙的混合物，进程结构近似于磷灰石的Ca6（PO4）6团族和β相磷酸三钙的Ca3（PO4）2团族〔6〕。

以湿化学法合成制得的rhBMP2／ACP纳米缓释体，期望能优势互补，充分利用ACP在生物矿化过程中显现出的无定形物质各向同性的特点以赋予骨骼较高的力学性能，以及可降解、可任意塑形、通过改变组分进行调节〔1〕等特性和rbBMP2良好的诱导成骨作用〔7〕，寻求一种具有良好的生物活性、细胞黏附性、细胞相容性及可控的生物降解速率与新骨生成速率相匹配的骨修复替代材料。

本实验制备品经检测纳米缓释体的物性、粒径、表面形貌等保持了原材料的基本属性。

其负载的rhBMP2具有较好的体外释放起始浓度，且能维持相应浓度持续缓释，释放规律与BMSCs向成骨细胞分化的时间相符，表明ACP球形纳米微观结构的高吸附性，能负载

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