个体化药学实验指导1013.docx
《个体化药学实验指导1013.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《个体化药学实验指导1013.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
个体化药学实验指导1013
一、检测流程
①富集白细胞样本。
样本处理方法可参照一、
（一）至（五）中的内容。
②将待测样本、质控加入到试剂中，上机，编辑样本名称并选择基因型。
某一批次的试剂第一次检测时，须加质控用于设定参数，之后的检测不需要再加质控。
选择基因型时，样本选择相应的基因型，质控选择“通用”
③设备运行检测。
④根据质控的St值关系，计算出ΔSt，依据“三、1”的内容，进行MaxSt差值上限与MinSt差值下限（在博奥客户端中，此二项为ΔSt上限、ΔSt下限）的设定。
必要时，修正St值上限与St值下限等参数。
⑤重新加载实验数据文件，进行结果的判定。
（一）可检测样本
1、血液样本：
2-3ml静脉全血（不需空腹），使用一次性真空抽血管（EDTA抗凝紫帽管）采集，于4℃或-20℃低温保存，保存时间不宜超过24h。
2、组织样本：
样本量大于0.3g（约黄豆大小），普通肌肉或肠胃黏膜等组织样本均可。
使用石蜡或其他染色液处理的样本需要清除包埋剂或染色液。
3、纯化的基因组。
（二）试剂与器材准备
1.商品名：
耀金保；用于在进行SNP分析前对血液、组织标本的保存。
2.商品名：
耀金分/耀金染；用于荧光染色原位杂交及染色体核型分析、化学药物用药指导时的样本分析。
3.10×NH4Cl预处理液。
处理血液样本时用于裂解红细胞。
4.1×NH4Cl。
使用注射用灭菌水，按照注射用灭菌水：
预处理液=1:
9的比例，将预处理液10×NH4Cl稀释为1×NH4Cl，备用。
5.1000ul、200ul、2.5ul移液枪及枪尖，1.5ml离心管（灭菌）。
6.液氮。
用于组织样本处理。
7.陶瓷研钵、研棒。
用于组织样本的处理。
8.注射用灭菌水。
（三）样本处理方法—从血液样本中富集白细胞
1.对用EDTA抗凝管采集到的临床全血样本进行编号（年、月、日、患者编号），上下颠倒混匀；取若干1.5ml离心管，并在管盖上编写序号，与抗凝管上编号一致。
2.在1.5ml离心管中加入1.2mL1×NH4Cl预处理液。
3.取150ul混匀的临床全血，加入对应编号的1×NH4Cl预处理液离心管中。
4.上下颠倒10次，室温静置5min，此时1×NH4Cl裂解红细胞。
血样与1×NH4Cl混匀后，液体颜色会逐渐变为澄清的红色。
5.室温3000rpm（或500-700g）离心5min，将上层透明红色液体吸取干净，注意避免吸走沉淀在管底的白细胞。
注：
离心后管底部可见约2×2mm的白细胞沉淀，如白细胞团过小，须重复2-5步骤。
6.加入1mL1×NH4Cl（或生理盐水）彻底重悬白细胞，室温3000rpm（或500-700g）离心5min，将上层液体吸干净，注意避免吸走管底白细胞。
7.向富集有白细胞的离心管中加入50ul耀金保，反复吹打混匀。
8.室温静置20-30min，期间颠倒混匀2次，待检测。
（四）样本处理方法—组织样本处理
1.在洁净的陶瓷研钵中加入待处理组织样本，加入足量液氮。
2.使用陶瓷研棒将组织样本研磨破碎，尽量破碎组织样本的细胞结构。
3.向研钵中加入100ul耀金保，使用研棒搅动以溶解破碎的样本。
4.将溶有样本的耀金保吸取到1.5ml离心管中，待检测。
（五）样本处理方法—纯化的基因组
纯化的基因组不需要进行预处理，也不需要使用耀金保保存。
可以直接加入到试剂中进行检测。
（六）上样
1、根据需要检测的基因位点，取出相应耀金分/耀金染试剂，并将样本编号标注在试剂管盖上；如果试剂粘附在管壁或者上盖，需要离心，保证检测体系完整。
2、向相应编号的耀金分试剂中加入1.5ul处理后的白细胞样本（加样时应再次混匀，枪头在管内液体中间吸足样本，加入量过少会直接影响结果）；
3、盖紧管盖，短暂离心，上机检测。
（七）软件运行（以天隆仪器客户端作为演示）
1、打开检测仪器电源，仪器进行自检运行；双击点开“个体化药学服务平台”分析软件；
2、在提示框中的“温控实验项”选择待检基因类型组别；在“基因位点项”选择该次检测的SNP位点。
点右下角“选择”按钮进行下一步。
每一个基因组里的SNP位点可同批次进行检测（各基因位点在打开软件之后的“样本设置”界面的“基因类型”下拉框中选择）
3、对待检标本进行设置
（1）点击“新建”按钮，或在“文件”选项里的“新建”，弹出保存对话框，设置文件名和保存路径。
（也可以不点击新建，在进行样本设置过程中会自动弹出保存对话框，设置并保存后不再提示。
）
（2）按照位置从A1开始的顺序，在“名称”栏对待检样本进行编号。
在“基因类型”栏选取该标本待检的基因名称。
选择基因型时，样本选择相应的基因型，质控选择“通用”。
4、点击右上角“开始”按钮（三角图形），开始运行检测。
5、检测运行完成后。
软件“数据分析”界面给出基因型分析结果。
注意事项：
1）待检样本放入仪器的位置顺序。
与软件“样本编辑”界面中位置顺序一致。
2）运行开始后，不能关闭软件或者进行其他操作。
检测完成后，数据会自动保存。
3）在检测过程中，电脑不能进入待机或者休眠。
使用前，需将待机、睡眠、关闭显示器等设置修改为“从不”。
4）检测过程中，如果需要查看先前的数据，可以重新打开客户端软件，不会影响正在运行的原件。
但是，此时不能修改各位点参数、温控等设置等。
5）若检测样品显示的结果为“重测”，则表示该样品无阳性检测信号或信号过低。
“重测”往往是因为样本量太低，加入的样品DNA拷贝数，达不到本方法的检测下限3000拷贝，应增加样品DNA拷贝数后，重新检测。
（八）质控品说明
1、标准品质粒
每个SNP位点对应三个标准品（野生纯合型、突变杂合型、突变纯合型），是根据NCBI的标准序列、人工合成的DNA标准片段。
标准品为1.5ml离心管包装。
每个SNP位点有对应标准品，标准品编号与样本分析试剂盒上基因位点编号对应。
2、质控的制备
分别从每个标准品中取1.5ul标准DNA序列，加入到分析样本处理试剂，用于检验的质控。
每个SNP位点对应三个标准品，对应做三种质控。
质控试剂有该位点的三个基因型的标示，质控试剂与普通检测试剂相同，可以依据实际情况调换使用。
3、质控的使用
质控主要用于“MaxSt差值上限”与“MinSt差值下限”（在博奥设备客户端中，此二项为“ΔSt上限”、“ΔSt下限”）的设定。
每使用一批新的试剂时，应用该批试剂随带的三种基因型的质控品进行系统参数校准。
若连续使用同一批试剂，在累计完成50份临床标本检测时，应进行一次新的质控检测。
4、若质控在“通用”类型进行试验后，计算出的ST差值不能按照从小到大或从大到小（A-B-C或C-B-A，质控杂合突变基因型ST差值必须在中间）时，必须在第一时间，将质控试验结果文件以及软件一起打包发送至我司技术支持部。
我公司技术支持服务邮箱为：
********************。
（九）试剂与样本的保存
1、血液标本：
4℃可临时存放，-20℃冷冻保存时间不能超过1周。
长时间冷冻或反复冻融会破坏白细胞结构，导致富集的样本不足，使用分析保存液（耀金保）保存的待检血样，于4℃临时保存，于-20℃可保存至少3月。
2、分析保存液：
可于4℃低温保存。
3、NH4Cl预处理液。
10X或1X的NH4Cl预处理液在4℃避光保存，可长期保存。
在保证容器无菌时，1XNH4Cl可预先大量配制。
（十）电脑与客户端软件设置
1、在检测过程中，电脑不能进入待机或者休眠。
使用前，需将待机、睡眠、关闭显示器等设置修改为“从不”。
2、目前软件能够支持WindowXP、Win7、Win8操作系统。
在安装时，需要由工程师安装相应的驱动软件，并进行通信端口的设置。
因此不建议随意更换操作电脑。
3、在客户端软件的更新升级时，需要确认电脑通信端口与软件中的端口相一致。
进入电脑“设备管理器”界面，打开“端口”下拉菜单，将“USBserial…（COM？
）”中的串口设置为串口X（如COM3，且此端口不能被其他设备占用）；在客户端软件中，将软件的端口也设置为X端口（如COM3）即可。
4、“管理员配置”密码为20060117。
“MaxSt差值上限”与“MinSt差值下限”（在博奥设备客户端中，此二项为“ΔSt上限”、“ΔSt下限”）的设定不需要密码。
其他参数的修改需要以此密码获得权限。
二、检测原理
在检测体系中，针对SNP突变位点的碱基，设计有两条配对碱基不同、荧光标记也不同的探针，能够分别识别一种突变。
在纯合子样本中，当某条探针与模板完全匹配时，该探针的竞争能力最强，能够优先与模板结合并产生荧光信号，此时，该探针的St较小，信号增长快并信号值较高，而另一条探针则St较大，信号增长慢且信号值较低。
（St是按照特定的运算规则得到的一个反应循环数值。
良好的荧光曲线一般为S型或接近S型，St一般在S型曲线下部的拐点位置，此时，两条探针间的竞争能力的差异表现的最明显。
）
以CYP2C19*3的检测产品02CYP2C19*3为例。
该产品的每管试剂内，都有FAM-G探针、HEX-A探针。
FAM-G探针能优先与突变位点碱基为G模板的结合，并由通道1进行信号的检测，HEX-A探针能优先与突变位点碱基为A模板的结合，并由通道2进行信号的检测。
如果样本为纯合的AA基因型，则HEX-A探针优先于模板结合并快速增长（绿色曲线），FAM-G探针与模板的结合能力弱，信号产生时间晚且信号增长慢（蓝色曲线），如图1。
在纯合GG型样本中，情况与上面相反，如图2。
在杂合AG型样本中，两条探针都能顺利的与目标模板结合并产生信号，其St值较接近，信号的增长也较一致。
三、分型判读的依据
在对数据进行分型判读时，软件的运算逻辑是：
①依据St值上限与St值下限确定有效循环数范围，范围之外的循环数值及信号不考虑；②依据通道一阶导阈值，排除信号过低的循环及其信号③依据MaxSt差值上限与MinSt差值下限，判定基因型，得出最终分型结果。
1、依据St的ΔSt的分型
分型主要的依据是St的差值。
在参数的设定中，ΔSt是两个通道的St值的差值，即ΔSt=St通道1-St通道2。
在普通的单个SNP检测中，由于FAM-探针、HEX-探针对模板结合能力的差异，使ΔSt存在正值、负值的差别，其正负差异及差值的大小是进行基因分型的主要依据。
以2位点（CYP2C19*3）的检测数据（哈医大二院演示实验数据）为例，其检测数据如下：
AA型Stchannel1=35.6609Stchannel2=27.0791ΔSt=+8.6
（图1）
GG型Stchannel1=31.4214Stchannel2=37.4288ΔSt=-6
（图2）
AG型Stchannel1=29.4933Stchannel2=28.4751ΔSt=+1
（图3）
在产品的研发和出厂检测中，对产品的ΔSt的控制要求为：
纯合质粒中ΔSt>4（上限），ΔSt<-4（下限）,杂合质粒-2<ΔSt<2。
2、依据信号阴阳性的分型
对于70、65等位点，其突变方式与普通的SNP不同。
这些位点是缺失/加倍等突变方式，其探针体系包括一条用于检测缺失/加倍等突变方式的探针和一条用于保证体系正常反应的内参。
当内参探针具有正常可信的荧光信号时（一般在500以上），表明此管试剂的检测正常，数据可信。
在阳性样本的检测中，特异的探针的信号是高于内参信号的。
因此，在70等位点中，如果出现两条荧光信号且探针信号高于内参信号，我们可认为此位点的阳性。
以70位点为例，“1502+”表示结果为1502阳性，而“1502-”为体系的内参，用于保证实验反应正常。
因此“1502+1520-”和“1520+1502+”的结果均表示1502阳性，而“1502-1520-”表示1502阴性。
与之类似的是3101类、5801类位点。
四、主要参数及其意义
1、MaxSt差值上限与MinSt差值下限（在博奥客户端中，此二项为ΔSt上限、ΔSt下限）
MaxSt差值上限（ΔSt上限）、MinSt差值下限（ΔSt下限）用于将两种纯合基因型、杂合基因型相互分开，是主要的分型参数。
若某样本的ΔSt可以简单的认为，在纯合子中，St值较小的基因型为检测结果，St较大的基因型为非特异性。
在检测时，若某通道的信号过低，软件会将其判定为无信号并显示St=-1（博奥设备中0）。
此时，我们固定认为此通道的ΔSt为10（通道2显示-1或0时）或-10（通道1显示-1或0时）。
MaxSt差值上限、MinSt差值下限是进行分型的主要标准。
MaxSt差值上限、MinSt差值下限的设定需要依据随同试剂提供的参数设定液（质控）的检测结果。
设定前，需要计算以下ΔSt（以图1、图2、图3数据为例）。
ΔSt1=Stchannel1-Stchannel2=+8.6（AA型）
ΔSt2=Stchannel1-Stchannel2=-6（GG型）
ΔSt杂=Stchannel1-Stchannel2=+1（AG型）
则
MaxSt差值上限=（ΔSt1+ΔSt杂）/1.8=5.3
MinSt差值下限=（ΔSt2+ΔSt杂）/1.8=-2.8
参数修改方法为，计入管理员配置界面，依据计算结果，修改相应位点的MaxSt差值上限与MinSt差值下限参数。
修改后，保存并重新加载实验数据即可。
（图示为MaxSt差值上限与MinSt差值下限修改界面）
2、通道一阶导阈值
通道一阶导值，是指某循环结束后，该通道的信号的增加值，相当于荧光信号的一阶导数。
在检测时，随着反应的进行，信号的增长地越来越快，通道一阶导值也越来越大。
当反应达到稳态时，每个循环信号的增长保持不变，则通道一阶导值达到最大且不变；当反应逐渐终止时，通道一阶导值逐渐减小至0。
通道一阶导阈值，是指整个反应过程中通道一阶导值的最小值。
用于确定有效的循环数范围，当某循环的信号的增加值高于通道一阶导阈值时，此循环反应才会被认为是有效反应，其St值才会进行ΔSt的计算，这样可以排除信号强度太低、可信度不高的检测结果。
在某些检测时，如果模板量较少，会导致信号较低，软件会将数据判定为“重测”。
以新疆自治区人民医院的检测数据（70位点）为例。
此次反应为缩短时间，在45循环时终止了反应，因此作为内参的通道2的荧光信号值较低，软件将其判定为“重测”。
如下图。
此时，在管理员配置中，将70位点的“通道2一阶导阈值”从“50”修改为“30”，保存后，重新打开文件，该样本结果显示为“HH”（即阴性），通道2St为8.4138。
样本检测出现“重测”时，建议根据“运行监控”的情况来人工修正软件的判读结果，或者将数据交由公司技术支持的工程师进行分析。
3、通道质控阈值
用于规范质控试剂的信号增长率。
目前软件不设置专门的质控通道，因此此参数不具有意义。
4、St值上限与St值下限
St值上限、St值下限是用于限定有效的St范围。
在反应中，由于初期信号较低，会存在荧光信号波动等问题，导致软件将异常波动位置或阴性曲线的某些位置计算为St值。
我们依据反应效率的计算，将20至50个循环（S56、S58条件下为5-50）作为有效的、可靠的St区域。
在此循环内的数据，才会进行ΔSt、通道一阶导阈值等参数的比较。
St是受模板量影响的。
模板浓度高，则检测时的St会减小；使用纯化的基因组时，检测得到的St也会较白细胞样本小，这种情况是正常的。
一般说来，St值上限与St值下限是固定的参数设定，不需要进行修改。
如果由于模板浓度高或纯化的样本导致St较小到小于20，可以通过“管理员配置”修改对应通道的“St值下限”。
五、影响实验效果的因素
1、如何判断一个数据是否是良好的结果
对于普通的SNP位点，我们在研发过程中会根据检测情况调整探针的设计和温控程序。
依据目前的数据看，一个良好的检测结果，具有以下特征：
①曲线呈“S”型或者类“S”型。
如图4、图5中的白细胞样本；
②在天隆设备中，通道1、通道2曲线能够达到或者接近达到平台期，信号强度一般在3000（通道1）或2000（通道2）以上；在博奥设备中，通道1、通道2曲线能够达到或者接近达到平台期，信号强度一般在3000（双通道1）；需要注意的是，质控的信号一般比检测的白细胞样本的信号高，但是其分型只能作为参考，而不能代表实际的白细胞的分型。
白细胞的分型图谱一般比质粒好，其阴性曲线一般较低，杂合白细胞曲线更为重合。
③纯合子质粒的ΔSt差值在+4以上或-4以下，阴性曲线信号较低或者没有阴性曲线；杂合质粒ΔSt一般在+2至-2以内；
或者简单说来，曲线线型与跟随试剂发送的质检报告相类似，数据良好。
2、温度
需要说明的是，温度对探针的竞争能力有显著的影响，进而影响样本的ΔSt。
当温度较标准温度高时，样本的ΔSt的绝对值会增大，样本分型效果更好。
但是温度过高会使探针的信号降低，不利于数据的可靠性分析，造成样本重测。
同时，如果温度过低，检测时样本的分型会变差，导致不同基因型之间曲线类似，不能分型。
如下图所示60位点CYP2C19*17试剂高温、低温测试。
60位点CYP2C19*17高温试验（64度）（图4）
（质粒）
（白细胞）
60位点CYP2C19*17低温试验（61度）（图5）
（质粒）
（白细胞）
由于设备间难免存在温度的差异，某些位点在进行检测时，其信号会相对较低。
此时，需要将温度降低以保证信号强度，从而保证其数据的可靠性。
对于不同的位点，对温度的敏感性也不同。
以图4、图5数据为例，60位点CYP2C19*17对温度不敏感，并且在适当的高温时其分型更好。
而1、68、93位点则较敏感。
反应温度修改方法：
（以基因组-62为例）
进入软件温控选择界面。
选择位点的程序，进入。
（天隆设备）
（博奥设备）
在“温控设置”（博奥设备客户端中为“程序设置”）内，将“过程3”的“步骤2”中的“62℃”修改为目的温度60度。
（天隆客户端修改前）
（天隆客户端修改后）
（博奥客户端修改前）
（博奥客户端修改后）
点击左侧界面中的“保存”，保存后“保存”按钮会变为灰白色。
保存设置后，即可。
（天隆客户端）
（博奥客户端）
设备的温控、软件等设置在进行技术演示时会由技术支持人员进行检查。
若在正常检测时，发现某位点信号持续较低，请联系技术支持人员，由公司技术支持人员进行现场维护或者指导温控的调整。
3、模板量
保证足够的模板量才能保证实验的成功。
样本量太少时，会使检测的信号过低，St也会延迟到40个循环之后。
此时，样本往往有趋势明显的曲线，但信号低，数据不可信。
76位点样本过少（反应完全完成）1位点样本过少（反应没有完全完成）
在富集白细胞时，注意观察管底是否有白色的白细胞聚团。
如果聚团明显，则表明富集较好。
如果聚团不明显或者没有白色的白细胞聚团，则需要再次进行富集。
在使用耀金保溶解时，可以根据检测的试剂需要添加耀金保。
如果只进行少量位点的检测，可以减少耀金保量至20ul，以相对提高模板浓度，保证检测效果。
4、位点分组
我们依据反应温度对位点进行了分组。
在相同分组内的位点，是可以在一次反应中同时检测的。
如果将低温组调整到高温组进行检测，样本的分型会优化，但是信号会降低甚至不能检测出有效信号。
高温组位点到低温条件下检测时，分型会变差，各基因型间ΔSt会减小，白细胞检测信号会上升，检出率会提高。
我们建议使用分组所在的温度进行检测，如果检测效果持续信号较低，可以降低温度，但降低的幅度最好不要超过1度。
5、富集白细胞时离心力的选择
在进行白细胞富集时，离心力一般是3000rpm。
由于某些离心机的转速可能达不到要求，造成富集的白细胞较少。
此时，可以将离心力提高到3200-3500rpm。
但是不建议离心力高于4000rpm。
离心力过高，会使白细胞团过于紧密，导致耀金保无法溶解细胞团。
对于一些大型离心机，离心力和离心时间需要根据实际状况进行调整。
离心力过高会沉淀过多的红细胞碎片，导致样本颜色太重，影响设备对信号的检测。
6、循环数的要求
目前标准检测程序为55个循环，反应总时间一般在2.5小时以内。
依据目前的经验，在50循环内既能完成检测。
若样本信号已经达到分型的要求，可以在保存数据后提前终止反应，缩短反应时间。
如果信号较低（在运行监控界面目测信号低于1000），建议完全完成检测反应，保证信号的可靠性。
提前终止反应时，需在运行界面点击“保存”按钮，以保存实验数据。
7、试剂的保存与使用
试剂需要在-20℃条件下避光保存。
使用时依据需要取用试剂，避免反复冻融试剂。
试剂为25ul标准体系，试剂在使用前，需要稍微离心，将粘附在管壁的试剂甩到管底，以保证体系的完整性；体系缺失太多时，检测信号会较低甚至检测失败。
8、适用的样本
人全血需要按照样本处理方法进行白细胞的纯化后才能用于检测；肌肉等组织样本等需要使用液氮冷冻研磨后使用；纯化的基因组样本可以直接检测；
9、野生型与突变型的说明
我们一般将“>”前面的碱基作为野生型，而后面的碱基作为突变型。
而使用”>”区分野生型和突变型是没有特别固定的硬性规定的。
一种说法中的野生型，换成另外的说法就是突变型。
在严格的讨论中，是以碱基型，即AA（TT）或GG（CC）或AG（CT）来说明的。
我们的用药指导指南中，也是以基因型为准的，就是为了避免不同说法中对野生型和突变型的混淆。
如58位点CYP3A5*3（G>A）rs776746在PharmacyGKB网站中的数据，如下。
五、典型位点分型图示（相同基因型中，分别是质控、白细胞样本检测图）
各位点的分型图谱请参阅试剂的出厂质检报告。
1位点CYP2C19*2分型图谱
天隆设备
博奥设备
AA
GG
AG
2位点CYP2C19*3分型图谱
天隆设备
博奥设备
AA
稀少基因型
GG
AG
60位点CYP2C19*17分型图谱
天隆设备
博奥设备
TT
稀少基因型
稀少基因型
CC
CT
升级会员 