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手性分析
手性分析经验谈
关于手性化合物、手性分析、手性填料和手性柱，现在的理论很多，讲的也比较复杂，我看了很多也不是特别明白，做分析三年多，分过的手性化合物最少也有几千种，拿到手里的消旋体几乎没有分不开的，没用到什么理论，主要都是经验，这里还是拣最实用的来讲。
手性分析可以使用普通的色谱柱，需要流动相中添加手性分离试剂，也可以直接用固定相为手性填料的手性色谱柱，前者使用较少，大家更多的是使用商品化的手性色谱柱。
手性分析包括气相和液相两种，这个主要和样品的物理性质有关系，现在的手性化合物绝大多数都不能做气相，所以气相手性色谱柱无论从数量还是质量上来讲都不能与液相手性色谱柱相提并论。
一、手性柱
手性分离最重要的是选择一根好的手性柱，说到手性柱就不得不提大赛璐，做手性分析的都知道，大赛璐的手性柱目前市场占有率最高，大家最熟悉的可能是OD-H，很多文献中都有报导。
大赛璐公司最初有四种填料，结构类似，对应的色谱柱分别是OD、AD、OJ和AS，粒径10um，后来填料粒径变为5um，就是卖的最多、使用范围最广的柱子，号称四大金刚，分别是OD-H、AD-H、OJ-H和AS-H，在柱子名称后边加“-H”，意思应该是高效，这些柱子都只能做正相使用，为了在反相色谱中使用开发的柱子在相应的色谱柱名称中添加了一个“R”，上述色谱柱都属于涂覆型填料，不耐溶剂，使用起来受样品溶解性的限制，最近又开发了键合相手性柱，可以使用几乎所有的常见溶剂做流动相，新的溶剂还提供了新的选择性，进而提升了色谱柱的分离能力，主要是IA、IB和IC，其中IA对应AD-H，IB对应OD-H，IC是新开发的填料。
和反相柱的发展趋势一样，大赛璐的手性柱也通过减小粒径来获得更高的柱效，最新的手性柱填料粒径是3um。
另外大赛璐还有其它一些手性色谱柱，但是远不及上述几种。
关于大赛璐手性柱的详细资料官方网站上讲的很详细，大家有兴趣可以去看，这里主要讲我的使用经验。
最近大赛璐公司的销售和技术曾经来过我们公司做讲座，因为我们先后买了他们三四十只手性柱，一直是自己摸索着使用，理论上的东西懂得很少，非常希望专家的能给我们提供指导，提升我们的技术水平，这个讲座的ppt网上流传的很多，对初学者来讲确实非常不错，但是专家的水平让我们实在不敢恭维。
我们买了几十只手性色谱柱，但是型号相对很少，平时几乎只用两只色谱柱：
AD-H和IC，但是拿到手里的手性化合物除去溶解性和紫外吸收的原因之外，几乎所有的样品都能用这两只色谱柱分开，我们主要的手段是在流动相上下功夫，通过流动相的调整来达到只用一两只柱子去解决遇到的所有手性分析问题，而大赛璐的专家讲座时给我们提供的思路是流动相变化相对较少，更多的是分不开就换柱子。
细想一下也不难理解，厂家手里最不缺的就是柱子，为了分析一个样品他们可以试用所有型号的手性柱，但是对我们用户来说，一只柱子动辄一两万，相信没有哪个用户能有厂家那样的魄力和实力，一下子拿出那么多型号的手性柱来为一个样品的分离做筛选。
二、样品前处理
说到手性分析，样品的前处理非常重要。
首先是消旋体样品的普通液相纯度问题，样品的纯度低了，看到手性柱上分离开的几个峰让人无从判断究竟对映异构体有没有分离开，分离开的几个峰哪个是杂质峰哪个是对映异构体的峰，所以样品的纯度要尽量的高，一般我们的要求是样品的纯度能达到90%以上，纯度低的样品需要做进一步的纯化。
关于对映异构体峰的判断，现在比较好的手段是使用旋光检测器，在色谱图上可以直接看到分离开的两峰吸收一正一负，再有就是使用DAD检测器，通过看两峰的紫外吸收是否一致来做判断。
样品前处理的另外一项是稀释问题，这个问题最容易被忽视，处理不好会直接导致实验失败。
我们都知道反相样品稀释的时候需要尽量使用流动相做稀释剂，且稀释剂里水含量要尽量高一些，这个要求对于手性分析同样适用，正相的手性分析要求样品稀释溶剂尽量要求和流动相所采用的溶剂种类一致，且起洗脱作用的醇类溶剂含量尽量要低，最好不要超过流动相里醇类的含量，否则会导致有些样品的分离度降低，使原本能达到基线分离的样品不能基线分离，严重的甚至使样品峰分叉甚至不成峰，因为在手性分离里起洗脱作用的醇类能够促进样品在管路里的扩散，我做过一个化合物，手性分析的时候只能用正己烷做稀释剂，只要稀释样品添加了醇类的溶剂样品就不能达到基线分离。
有时候我们从实验室拿到的样品是溶液，使用的可能是DMF、甲苯、二氯甲烷或者乙酸乙酯等常见的溶剂，这些溶剂对于涂覆型的填料都不能使用，即使含量很低也会对固定相造成伤害，这样的样品必须除掉溶剂。
有时候样品不溶于流动相，我们又不得不使用这些溶剂，可以先用少量这类溶剂超声将样品溶掉，再加流动相稀释，对于键合相手性柱这样做完全没有问题，但有时我们不得以将此方法用到涂覆型手性柱上，就要牺牲手性柱寿命来换分离。
很多时候我们拿到手的样品比较难溶，毕竟乙醇和异丙醇不是非常好的溶剂，即便是二氯甲烷、四氢呋喃、DMF或者DMAC也会遇到溶解性比较差的样品，通常此类样品分子式都相对比较复杂，分子量偏大，结构中含有带N的显碱性基团和显酸性基团，此类样品可以通过稀释样品时加酸或者碱来促进其溶解，但是加入的酸或碱含量不宜太高，浓度不宜过大。
很多化合物为了增加其稳定性，都要做成盐来保存和转移，常见的包括盐酸盐、三氟乙酸盐、甲基磺酸盐、酒石酸盐以及其它更复杂的盐，这些盐类也是可以直接拿来做手性分析的，无论是正相还是反相都可以，只要样品能用合适的稀释剂溶解，当然样品游离出来做手性分析会更好。
再有就是很多样品因为液相没有紫外吸收、气相不能气化而不能直接做手性分析，这时就要衍生，衍生最多的样品可能就是氨基酸了。
氨基酸衍生方法可以是给氨基上衍生CBZ做液相，或者是用HCl（HBr）的乙醇（甲醇、异丙醇）溶液加三氟乙酸酐将羧基衍生成酯，氨基衍生成酰胺来做气相。
最近比较流行的氨基酸衍生方法是用苯异硫氰酸酯（也叫异硫氰酸苯酯）衍生氨基来做手性分析，此方法当然也可以用来做普通的氨基酸液相纯度分析，这个衍生方法要求化合物分子结构中的N原子上至少连接有一个H，所以只要是分子结构中含有带有至少一个H原子的N结构，化合物都可以用此方法衍生。
需要指出的是，做手性分析的原则是能不衍生就不衍生，因为衍生有可能会引起样品手性纯度下降，即消旋。
总结一下，手性分析中使用的消旋体纯度一定要好，最好能配合DAD检测器或者是旋光检测器来做分析方法开发。
样品在稀释时尽量用流动相相同种类的溶剂做稀释剂，稀释剂中醇类的含量不宜超过流动相中醇类的含量，难溶的样品尽量不要用其它的溶剂，一方面可能会伤害柱子，另一方面容易导致峰形变差，但实际操作过程中很多时候为了达到分析目的，还不得不牺牲柱子的寿命，而且即便是使用纯的乙醇或者是异丙醇做稀释剂也不是不可以，只要是稀释剂和流动相能够互溶就行。
三、流动相
手性分析很关键的一项是流动相的选择，手性分析一般都采用正相，使用最多的流动相是正己烷、正庚烷、乙醇和异丙醇这四种，其中起洗脱作用的流动相是乙醇和异丙醇，正己烷和正庚烷用来调节流动相的洗脱强度。
正己烷和正庚烷对于样品分离没有什么太大的影响，不会改变选择性和分离度，通常都可以混用，不过正庚烷比正己烷对人体的伤害要小很多，但价格是后者的一倍，所以欧美的很多大制药公司多使用正庚烷，而国内多使用正己烷。
乙醇和异丙醇对样品的分离起关键的作用，不同的醇有不同的选择性，改变醇的种类可以改变选择性，常用的醇类是乙醇和异丙醇，甲醇不能使用是因为它和正己烷、正庚烷不互溶，叔丁醇粘度太大，一般作为添加剂配合乙醇或者异丙醇少量使用，提供特殊的选择性，通常能起到意想不到的效果。
一般情况下分析手性样品，很多人推荐首选异丙醇，但是我喜欢首选乙醇，因为乙醇气味比异丙醇好一点，且乙醇做流动相压力要低一些，实际上二者差别不是太大。
流动相里经常需要添加酸或者是碱来调节峰形，常用的酸有三氟乙酸、乙酸和甲基磺酸，碱一般是二乙胺和三乙胺，也有用乙醇胺和异丁胺的，流动相里添加酸和碱的浓度一般要求控制在0.2%（体积比）以下，我们一般用0.1%，使用的原则一般是酸性样品加酸，碱性样品加碱，但实际上很多样品是即含酸性基团又含碱性基团，这就要看哪个基团作用强了，对于某些含氨基的两性样品，例如苯甘氨酸，甲基磺酸是一个非常好的选择，磺酸基能够抑制氨基的碱性，又能提供一个酸性的流动相环境，使样品既能得到很好的分离又能获得对称的峰形。
一般做纯度分析检测杂质含量时我们要求尽量的采用低波长来让尽可能多的杂质有紫外吸收，而做手性分析时我们需要采用尽可能高的波长来去除在低波长下才有吸收的杂质的干扰，一般原则还是尽量选择样品紫外吸收最好的地方来获得较高的灵敏度，但流动相里添加二乙胺会导致在低波长下基线波动变大，系统难以平衡，这种情况下一般要提高检测波长，实际操作过程中有些样品在高波长下吸收非常差，只能用低波长检测，这样的样品可以尝试在样品稀释的时候加入过量的二乙胺（但不宜太多），而流动相用中性，从而获得满意的分析结果。
有些样品只添加碱或者酸效果不好，可以尝试在样品里同时添加酸或者碱，这样的样品我曾经遇到过，只添加酸或碱样品都拖尾，不能达到基线分离，这种情况下通过酸碱同时加入，最后获得了非常漂亮的峰形和良好的分离度。
实际操作中有些样品碱性太强，进样以后根本不成峰，低波长下细看似乎能感觉到基线一直在漂，开始时怀疑样品浓度不够，加大样品浓度以后仍看不到样品峰，流动相加入二乙胺或三乙胺以后再进样，得到比较漂亮的样品峰。
流动相里添加酸或者碱以后，基本上不会提供额外的选择性，但是却能提高分离度，因为峰形好了，相同的保留时间两个峰之间的分离度自然就好了。
但是流动相里添加酸或者碱以后，会在柱子上残留，即使长时间用中性流动相冲洗也不会有什么效果，这一点在键合相手性柱上表现的尤为明显。
有时我们发现原来用中性流动相分离很好的一个偏酸性的样品，柱子用过碱性流动相以后再用中性流动相去做，发现样品峰不能达到基线分离，拖尾严重，甚至不成峰，这时可以往流动相里添加一滴酸，或者柱子用酸性流动相冲洗一下再用中性的流动相，一切又正常了，同理，用过酸性流动相的柱子去做弱碱性的样品会有一样的问题。
残留在柱子上的酸或碱最好是用碱或酸性的流动相来清洗，有条件的话尽量固定一只柱子只用酸性流动相或只用碱性流动相。
还见过一些国外客户提供的正相手性分析方法，需要在流动相里加入0.5%的水，估计是用来改变流动相的选择性，但是据说加水以后方法重复性不好，且水对固定相有伤害，我本人没有开发过这样的分析方法，也不做推荐，这份客户分析方法拿到我手里的时候最终还是被我改了。
四、方法优化
做手性分析时我一般选用两只柱子：
AD-H和IC，基本上这两只柱子可以解决我遇到的所有的手性化合物，AD-H是早期我们一直在使用的，后来的IC可以使用更多的溶剂从而提供了更多的选择性，但是我还是习惯先用AD-H做手性分析方法开发，因为这个型号的柱子我们买了好多只。
手性分析基本上都用恒流来做，溶剂一般也都是提前混合好再放到仪器上用，主要是因为正相溶剂在仪器上混合效果不好。
如前边所述，一般情况下拿到一个样品，我首先选择的是用正己烷和乙醇做流动相，根据化合物分子结构式来判断其极性的大小，进而来选择流动相的比例，极性大的选择使用的乙醇比例大一点，极性小的选择使用的乙醇比例小一点，乙醇比例一般是从大到小，根据分离情况以5%或10%的比例递减，一般要求第一针至少能把样品在相对较短的时间内从柱子上洗脱下来，然后再去做调整，如果开始的时候醇的比例选的过小，样品可能在柱子上一两个小时都洗不下来。
消旋体出峰以后如果是一个峰，可以将峰放大，观察有没有分叉的迹象，有的话，可以通过适当的降低醇类的比例来进一步提高分离度，如果分得太开，可以适当的提高醇类的比例来缩短分析时间，通过对流动相比例的调整，使分析时间和分离度都能满足手性分析的要求。
如果样品在使用一种醇类时没有选择性，即无论怎样减小醇的比例样品都没有分离的迹象，可以换一种醇来试，通常乙醇和异丙醇会有不同的选择性，很多样品乙醇分不开，异丙醇能分离的很好。
异丙醇也不行的时候可以尝试在乙醇或者异丙醇里加入合适浓度的叔丁醇或者是甲醇，对于IC色谱柱可以尝试其它如二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯等其它溶剂，每一种溶剂都能为手性分析提供独特的选择性，一般除了乙醇、异丙醇之外我使用最多的还是叔丁醇，其次是甲醇，叔丁醇可以单独和正己烷做流动相，甲醇必须结合乙醇或异丙醇混合使用。
需要着重强调的是，更换醇的种类，有可能会导致对映异构体出峰顺序的改变，使用乙醇的流动相，如果R构型先出峰，更换为异丙醇以后，有可能（不是一定）R构型会后出峰，S构型跑到前边去了。
虽然提高柱温能够使峰形变窄变细，但是会降低分离度，而且大赛璐的手性柱温度上限就是40度（这一点在超临界流体色谱应用上受限尤为明显），所以优化分析方法时很少有人在柱温上下功夫。
另外手性柱分析样品的保留时间受室温变化的影响特别大，通常大家都习惯用消旋体图谱计算对映异构体相对保留时间的方法根据主峰的保留时间来计算异构体的出峰位置。
五、写在最后
大赛璐的手性色谱柱还包括反相的系列，同时键合相的手性柱正相和反相都能用，只是要求在正相和反相流动相之间进行切换的时候要用异丙醇小流速的过渡，因为大赛璐手性柱压力都不能超过100bar，另外需要注意的是键合相手性柱的记忆效应，即流动相使用不同种类的溶剂切换时，柱效可能会下降，解决方法就是用DMF做溶剂对色谱柱进行清洗。
我感觉做反相的手性分离时，我们可以更多的当作使用一只比较特殊的柱子做普通的样品一样来看待，仔细的阅读一下柱子的说明书就好，其它的和最常用的反相液相都一样。
反相常用的溶剂包括水、甲醇、乙腈和乙醇，每种溶剂都为样品分离提供了独特的选择性。
大赛璐还有其它一些手性色谱柱，他们的手册上说是要用这些色谱柱才能分离的样品我遇到过很多，用手头的AD-H也都解决了。
其它公司也有做手性柱，我们手头也有几只，但是使用不多，没觉得有什么优点。
总的来讲，我感觉做手性样品分析没有什么葵花宝典，让人看上几眼就能所向披靡，更多的还要自己去试，动手多了，及时总结，多积累点经验，才能做到事半功倍。
手性色谱柱（ChiralHPLCColumns）是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相（ChiralStationaryPhases）。
通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。
要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。
这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用。
手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。
这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。
由于这种作用力较微弱，因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。
。
在手性拆分中，温度的影响是很显著的。
低温增加手性识别能力，但可能引起色谱峰变宽而导致分离变差。
因此确定手性分析方法过程中要考虑柱温的影响，确定最优柱温。
迄今为止，尚没有一种类似十八烷基键合硅胶（ODS）柱的普遍适用的手性柱。
不同化学性质的异构体不得不采用不同类型的手性柱，而市售的手性色谱柱通常价格昂贵，因此如何根据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱是非常重要的。
根据手性固定相和溶剂的相互作用机制，IrvingWainer首次提出了手性色谱柱的分类体系：
第1类：
通过氢键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。
第2类：
既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。
此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱。
第3类：
基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。
这类手性色谱柱中最典型的是由Armstrong教授开发的环糊精型手性柱[2]，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色谱柱也属于此类。
第4类：
基于形成非对映体的金属络合物，是由Davankov开发的手性分离技术，也称为手性配位交换色谱（CLEC）。
第5类：
蛋白质型手性色谱柱。
手性分离是基于疏水相互作用和极性相互作用实现。
但由于市场上可选择的手性色谱柱越来越多，此分类系统有时很难将一些手性柱归纳进去。
因此参考IrvingWainer的分类方法，根据固定相的化学结构，将手性色谱柱分为以下几种：
刷（Brush）型或称为Prikle型
纤维素（Cellulose）型
环糊精（Cyclodextrin）型
大环抗生素（Macrocyclicantibiotics）型
蛋白质（Protein）型
配位交换（|Ligandexchange）型
冠醚（Crownethers）型
刷型：
刷型手性色谱柱的出现和发展源于BillPrikle及其同事的卓越工作。
六十年代，BillPrikle将手性核磁共振中的成果运用到手性HPLC固定相研究中，通过不断实践，发明了应用范围较广、柱效很好的手性色谱柱。
刷型手性色谱柱是根据三点识别模式设计的，属于IrvingWainer分类中的第一种类型。
刷型手性固定相分为π电子接受型和π电子提供型两类。
最常见的π电子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸键合到γ-氨丙基硅胶上的制成。
此类刷型手性色谱柱可以分离许多可提供π电子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等对化合物进行衍生化后进行手性分离。
π电子供给型固定相常见的是共价结合到硅胶上的萘基氨基酸衍生物，这种固定相要求被分析物具有π电子接受基团，例如二硝基苯甲酰基。
醇类、羧酸类、胺类等，可以用氯化二硝基苯甲酰、异腈酸盐、或二硝基苯胺等进行衍生化后，用π电子供给型固定相达到手性分离。
刷型固定相的优势在于其易于合成。
合成方法在BillPrikle的著作中有详细的说明。
另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的选择因子。
它的不利之处在于它仅对芳香族化合物有效，有时不得不进行衍生化反应。
但值得一提的是，这种衍生化反应是非手性衍生反应，所以不存在手性衍生的问题。
刷型手性色谱使用的流动相基本是极性弱的有机溶剂，这对于制备色谱来讲未必是缺点。
近来，刷型固定相出现了π电子供给和接受基因的混合固定相。
如：
WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。
α-BURKE-Ⅱ相十分适用于β-阻断剂的手性分离。
典型的流动相为二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例为85：
10：
5。
加入10mM醋酸铵可以调整保留时间。
SSBLAMOⅡ，同时具有π电子供体区和受体区，形成手性裂缝，因此对于某些分子具有很高选择性。
纤维素型：
纤维素型手性色谱柱的分离作用包括相互吸引的作用及形成包埋复合物。
它们属于Wainer分类中的第2种类型。
市售的手性色谱柱为微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸盐纤维素固定相。
很多化合物可通过此类型的色谱柱得到分离。
这种类型的手性色谱柱种类也很齐全。
流动相使用低极性溶剂，典型的流动相为乙醇-己烷混合物。
但特别要注意由于氯可以使纤维素从硅胶上脱落，因此要确保流动相中无含氯溶剂。
这种类型的手性色谱柱主要的制造商之一是日本的Daicel公司，他们生产的纤维素酯和氨基甲酸纤维素柱可以分离多种生物碱和药物。
特别值得一提的是OD柱。
在某手性化合物异构体的分离中，分离度超过了25，这意味着载样量可以很高，对于制备十分有利。
纤维素固定相的每个单元都为螺旋型，而且这种螺旋结构还存在极性作用、π-π作用及形成包埋复合物等手性分离因素。
淀粉代替纤维素制成的此类手性柱显示了和纤维素柱不同的选择性，但是稳定性较差。
因为淀粉是水溶性的，因此流动相中必须绝对无水才能保证柱子寿命。
目前此类型的柱子能分离80%左右可能面临到的所有手性化合物。
此类柱子通常用于正相系统，用正己烷-乙醇，正己烷-异丙醇混合溶剂为流动相。
OD柱也可用于反相的情况，但流动相必须含有高浓度的高氯酸盐缓冲液，以防止固定相溶解。
即使这样，使用较长时间以后色谱柱也难免要受到损害，但是在某些情况下使用反相系统分离效果要优于使用正相系统。
环糊精型：
环糊精是通过BacillusMacerans淀粉酶或环糊精糖基转移酶水解淀粉得到的环型低聚糖。
通过控制环糊精转移酶的水解反应条件可得到不同尺寸的环糊精。
市售的环糊精主要是α、β、γ三种类型，分别含6、7、8个吡喃葡萄糖单元。
环糊精分子成锥筒型，构成一个洞穴，洞穴的孔径由构成环糊精的吡喃葡萄糖的数目决定。
环糊精类型及洞穴的孔径等见下表：
环糊精糖元数目洞穴孔径可进入洞穴的分子类型手性中心数目
α64.5-6.05-6元环的芳香族化合物30
β76.0-8.0联苯或萘35
γ88.0-10.0取代芘和类固醇40
2，3位仲羟基分布在环糊精洞口，6位伯羟基在环糊精分子的外部，这意味着洞穴内部是相对疏水的区域。
用环糊精手性固定相产生手性识别要求被拆分物的疏水部分能嵌入环糊精洞穴中，形成可逆的、稳定性不同的包合物，环糊精洞口的羟基和被拆分物的极性基团相互作用。
由于形成包合物速度较慢，因此可能导致色谱峰峰形较差，同样也影响了其在制备色谱中的应用。
环糊精固定相的选择性取决分析物的分子大小;α-环糊精只能允许单苯基或萘基进入，β-环糊精允许萘基及多取代的苯基进入，γ-环糊精仅用于大分子萜类。
β-环糊精手性固定相应用范围最广。
Ibuprofen通过β-环糊精色谱柱得到分离，说明了pH值对氢键的影响。
当流动相的pH=7时，观察不到拆分的迹象。
pH=4时，可达到好的分离效果。
通常分离氨基酸时，常采用低的pH值，以抑制酸性基团的离子化，同时也增强氨基的质子化。
磷酸三乙胺盐、乙酸三乙胺盐证明对β-环糊精色谱柱来说是很好的缓冲液。
通常缓冲液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸调节到合适的pH值。
高的流速会降低形成复合物的能力，低流速分离效果较好，0.5-1ml/min的流速最好。
另外，增加缓冲液的浓度可以克服流速的影响，因为它可以增加环糊精洞穴和流动相的吸引力
常用缓冲液及其使用浓度如下表所示：
缓冲液浓度目的
TEAA（乙酸三乙胺盐）0.01-2%
NH4NO310-500mM（用于减小包埋）
柠檬酸盐10-200mM（特别适合于酸性化合物）
醋酸铵10-200mM
pH值选择见下表:
醇和胺pH4（加强NH的离子化）
酸pH7
优化手性分离条件要考虑的方面有：
pH值对分离度的影响;流速对分离度的影响;柱温、有机相比例、缓冲盐浓度对分离度的影响。
环糊精的修饰：
最近，对环糊精的修饰使环糊精型手性色谱柱可以分离更多的化合物，并可用于气相手性色谱分离。
衍生化是通过将不同的基因键合到环糊精洞穴表面的羟基上。
衍生化反应包括乙基化、S-羟基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸盐、3，5二甲基苯基氨基甲酸盐和环状对甲苯酰酯。
这些新型的环糊精固定相有许多优点，它们可以分离更多化合物，价格上也有竞争力，由于改进了手性识别能力使其更适用于制备色谱。
配位交换型：
手性配位交换色谱（ChiralLigandExchangeChromatography，CLEC）由Davankov发明，是通过形成光学活性的金属络合物而达到手性分离，属于IrvingWainer分类中的第4类手性固定相，主要用于分离氨基酸类。
由于此类固定相是由手性氨基酸—铜离子络合物键合到硅胶或聚合物上形成，因此流动相中必须含有铜离子以保证手性固定相上的铜离子不至流失。
其它的过渡金属元素也已用于手性配位交换色谱，但铜离子应用最广。
形成络合物的过程十分缓慢，因此有时需提高柱温，最佳温度约50℃。
手性配位交换色谱仅对α-氨基酸和
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