农药残留检测技术进展.docx

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农药残留检测技术进展

农药残留检测技术进展

我国是世界上农药施用量最大的国家， 每年在130万吨以上， 相当于世界平均水平的2倍[1]，其中70%为杀虫剂， 其次为杀菌剂和除草剂。

这些农药大量的使用， 以及由于部分生产者不按规定使用了禁用或限用农药， 或不按规定剂量或安全间隔期滥用， 或在产品运输、储藏等环节的污染，都可能造成蔬菜、水果等农产品的农药残留超标、食品及环境受到污染， 农残超标己经成为食品安全中的突出问题。

因此加强对农药残留的监测和环境毒理研究， 对于合理开发和正确使用农药， 保护生态环境， 保障人类健康， 避免和减少不必要的农业损失等， 具有重要的理论和实践意义。

近年来随着超高效农药的开发应用和待检样品的增加， 对农药残留分析技术的灵敏度、特异性和快速性提出了更苛刻的要求。

因此出现了一些新型的、先进的农药残留分析技术。

本文综述了农药残留检测的一些方法。

1 农药残留检测常规方法及其进展

实验室常用的农药残留分析方法有气相色谱法（GC）， 高效液相色谱法（HPLC）， 质谱法（MS）和红外光谱法（IR） 等， 以及这些方法的联用。

1.1 气相色谱法气相色谱法（GasChromatograph，GC） 气相色谱法是一种经典的分析方法。

利用试样中各组分在气相和固定液两相间分配系数的不同， 当气化后的试样被载气带入色谱柱中运行时， 各组分就在其中的两相间进行反复多次分配， 经过一定的柱长后便彼此分离， 按顺序离开色谱柱进入检测器， 其产生的电信号形成色谱峰。

该法具有操作简便、分析速度快、分离效能高、灵敏度高以及应用范围广等特点， 目前农药残留检测大部分可采用气相色谱法来完成。

使用气相色谱法， 多种农药可以一次进样，得到完全的分离、定性和定量， 再配置高性能的检测器， 使分析速度更快、结果更可靠。

1.2 高效液相色谱法高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography， HPLC） 是60年代末70年代初在气相色谱和经典液相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术，它具有高效、高速、高灵敏度的特点， 与气相色谱法相比， 具有应用范围更广的优点。

HPLC可用于高沸点， 相对分子质量大， 热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析， 因此也是农药残留物分析的常用方法。

1.3 色－质联用色－质联用作为一种发展相对成熟的检测手段， 尤其适合于多残留分析。

质谱法的优点是能在多种残留物同时存在的情况下对其进行定性定量分析， 仅用气相色谱法检测需要多个检测器， 而色－质联用一般只需一次提取和一次GC－MS 检测即可。

色－质联用法包括气相色谱－质谱联用（GC－MS） 和液相色谱－质谱联用技术（LC－MS）。

1.3.1 气相色谱－质谱联用技术（GC－MS） 农残检测过程中， 即使样品经过了净化,在残留浓度很低的情况下， 其本底对检测造成的干扰也是不容忽视的。

仅依靠保留时间进行定性分析是很困难的， 必须有质谱数据， 即化合物结构信息才能进行更准确的判断。

欧盟和美国要求农残的确认必须要有质谱数据， 由于气相色谱-质谱联用技术具有对样品当中不同种类的上百种农药残留同时进行快速扫描、定性、定量的优势。

因此使得它在农残检测中显的尤其重要，并已被很多国家研究者开发和应用。

Yu.L等[2]用气相色谱－质谱（GC－MS） 联用来检测水果和蔬菜中的邻苯基苯酚、二苯胺及克螨特等。

其残留用乙腈提取， 再转移至丙酮中， 邻苯基苯酚、二苯胺及炔螨特的检出限分别为10、8、15μg/kg， 且回收率比较高。

Papadopoulou-Mourkidou[3]报道说， 气相色谱－离子捕获质谱法（GC－ITMS） 是一种多残留的检测方法，可用来检测土壤中的有机氯、有机磷、三嗪、苯脲、N-乙酰苯胺、氨基甲酸酯及其它一些污染物。

样品用乙腈－水提取， 再溶到石油醚-乙醚中以在GC－ITMS上直接分析， 质谱在电子电离模式下运行。

当样品中农药的含量在20~1000μg/kg 时， 其回收率一般>80%。

对绝大多数农药来说其检出限为1~10μg/kg。

该法可用来检测土壤中的痕量农药适合于研究污染源在环境中的行为。

气相色谱－化学电离质谱法（GCCIMS）[4]可用来分析水果和蔬菜上多种致癌农药的残留量， 如：

 乙酰甲胺磷（acephate）、甲草胺（alachlor）、保棉磷（azinphosmethyl）、敌菌丹（ captafol）、克菌丹（ captan）、杀虫脒（chlordimeform）、百菌清（chlorthalonil）、禾草灵（diclofopmethyl）、乙丁烯氟灵（ethalfluralin）、异丙甲草胺（ metolachlor）、噁草灵（oxadiazon）、特丁净（ terbutryn） 等。

1.3.2 液相色谱－质谱联用技术（LC－MS） 大部分农药可用GC－MS检测， 但对极性或热不稳定性太强的农药（及其代谢物） 不适用（如：

灭菌丹、利谷隆、黄草消等）， 可采用高效液相色谱－质谱法（HPLC－MS） 来检测。

据统计， 液相色谱可以分析的物质约占世界上已知化合物的80%以上， 内喷射式和粒子流式接口技术可将液相色谱与质谱连接起来， 已成功地用于分析一些对热不稳定、分子量较大、难以用气相色谱分析的化合物。

且具有检测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等优点。

如果对一种用于毛细管电泳的新型电喷射接口加以改进使其适用与液质联用仪， 将可大大提高分析灵敏度。

另外， 研究开发毛细管液相色谱与离子捕获检测器的配合将会大大拓宽液相色谱用于高灵敏度分析的范围。

虽然液质联用对分析技术和仪器的要求高， 但它是一种很有利用价值的高效率、高可靠性分析技术。

色质联用一般在0.5mg/kg添加水平上的回收率为70~123%， 平均变异系数为13%。

灵敏度实验表明， 大多数农药在农作物中的检测极限为0.05mg/kg或0.10mg/kg， 个别农药为0.25mg/kg或更高。

1.4 直接光谱分析技术近红外衰减全反射光谱（ AttenuatedTotalReflectanceNearInfraredSpectroscopy， NearIR-ATR） 和表面增强拉曼光谱（ SurfaceEnhancedRamanSpectroscopy，SERS） 使光谱分析的灵敏度提高102~107倍。

这些快速直接的光谱技术， 只需要极少量的样品，具有很大的应用潜力。

一系列激光光谱技术，如激光拉曼光谱等使光谱分析的灵敏度几乎达到极限－一个分子或原子的水平。

这将为开发高灵敏度的检测器提供可能的技术基础。

目前，这些灵敏度极高的光谱技术还需要进一步研究开发才能进入广泛应用阶段。

1.5 毛细管电泳毛细管电泳技术（CapillaryElectropheresis， CE） 是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术。

其工作原理是使毛细管内的不同带电粒子（离子、分子或衍生物） 在高压场作用下以不同的速度在背景缓冲液中定向农药残留迁移， 从而进行分离。

根据样品组分的背景缓冲液中所受作用的不同， CE又被分为毛细管区带电泳（CZE）、毛细管凝胶电泳（CGE）、等电聚焦（IEF）、胶束电动色谱（MEKC）， 等速电泳（ITP） 等几大类。

自80年代Jorgenson把CE应用于分析化学以来， 这一技术已发展成为分离科学中最活跃的领域之一。

它具有灵敏度高、耗资少、样品消耗量很小（每次进样只是纳升级）、分离柱效高、使用方便等优点， 非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析， 其分离效率可达数百万理论塔板数。

目前， 毛细管电泳尚缺乏灵敏度很高的检测器。

因此， 只有研究开发灵敏度更高的检测系统， 该技术的优势才能充分发挥出来。

1.6 超临界流体色谱超临界流体色谱（SupercriticalFluidChromatography， SFC） 就是以超临界流体作为色谱流动相的色谱（超临界流体本质上是处于临界温度以上的高密度气体， 既具有气体粘度小、扩散速度快、渗透力强的特点， 又具有液体对样品溶解性能好、可在较低温度下操作的特点）。

SFC可在较低温度下分析分子量较大、对热不稳定的化合物和极性较强的化合物， 可与各种气相、液相色谱检测器匹配； 还可与红外、质谱联用， 它能通过调节压力、温度、流动相组成多重梯度， 选择最佳的色谱条件， 它综合了气相色谱和高效液相色谱的优点， 克服了各自的缺点， 成为一种强有力的分离和检测手段。

2 农药残留快速检测方法及进展

常规实验室仪器检测虽然可以检测目前绝大多数农药残留， 而且灵敏度和精度都很高， 但仪器复杂、价格昂贵、操作繁琐， 常需液－液萃取或固－液萃取等前期处理过程， 因而难以现场使用，更不能满足现场快速检测需要。

农药残留快速检测方法大致可分为生物测定法和理化分析法两大类。

生物测定法又因原理和操作方法的不同而分为活体生测法、免疫分析法和生物传感器等。

2.1 活体生测法活体生测是以大量敏感性活体生物作为实验材料， 以家蝇接触供检样品后的中毒反应程度来表示农药残留的程度。

60年代后期， 台湾农业试验所采用生物测定法进行农药残留检验， 其原理是放饲高敏感性的家蝇于菜汁中， 4~5h后家蝇死亡率在10%以下即为合格[5]。

中国农业大学和中国农科院的科研人员也做了这方面的工作， 他们在蔬菜采收前， 先取采收量的一小部分，捣碎、置入检测瓶中， 每瓶用量5g， 让家蝇和样品菜经过一定时间的充分接触， 然后加以统计分析[6]。

该方法的优点是过程简单、无须复杂仪器检测， 缺点是检测时间较长， 仅适于田间未采收的蔬菜， 且该法只对少数药剂有反应，无法分辨残留农药的种类， 准确性较低[7]。

2.2 免疫分析法免疫分析法（Immunoassay，IA） 是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。

免疫是机体识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性应答反应。

近年来， 免疫分析法尤其是酶免疫分析（EIA） 的研究十分活跃， 应用领域也取得了较大的扩展。

IA被称为使用抗体作为“生物化学检测器” 的分析技术， 是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法。

大分子量的农药（如苏云金杆菌毒素等） 可以直接作为抗原免疫脊椎动物， 动物的免疫系统对进入体内的异源大分子量物质发生保护性应答反应。

小分子量农药（MWQ500） 一般不具备免疫原性， 不能刺激动物产生免疫反应， 但有与相应抗体在体外发生吸附反应的能力， 即有反应原性， 这类小分子物质在免疫学上称为半抗原。

将农药小分子通过一定碳链长度的连接分子与分子量大的载体（一般为蛋白质） 以共价键相偶联制备成人工抗原， 以人工抗原免疫动物， 使动物的免疫系统发生应答反应， 产生对农药具特异性的活性物质（免疫球蛋白或称抗体） 来识别该农药分子并与之结合。

这种结合反应不仅可在体内进行， 也可在体外进行， 符合质量作用定律，这就是免疫分析的基础。

通过对半抗原或抗体进行标记（放射性核素、酶、荧光素标记等），利用标记物的生物或物理或化学放大作用来进行工作， 它集测定的高灵敏性和抗体反应的强特异性于一体， 在某些重要生物活性物质（如蛋白质、激素、药物等） 的痕量检测方面取得农药残留了很大成就。

它的开发过程需要投入较多资金和较长时间， 但具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、价廉、样品所需量少等优点， 将会迅速发展成为现代生物化学、医学、临床化学和药物化学等研究领域的重要工具[8~12]。

2.3 生物传感器生物传感器是利用生物活性物质， 如酶、抗原、抗体、细胞、组织等作为传感器的识别元件， 与样品中的待测物质发生特异性反应， 通过适当的换能器将这些反应（形成复合物、发色、发光等） 转换成可以输出检测的信号（电压、频率等）， 通过分析信号对待测物进行定性和定量检测。

目前在农药残留分析中， 除酶生物传感器、免疫传感器等传统生物传感器外， 还出现了一些新型生物传感器。

2.3.1 酶生物传感器酶生物传感器通过测定固定于电极表面的酶的活性被农药抑制的程度，来推算样品中农药残留水平。

酶生物传感器的关键在于酶源的选择和酶敏感层的制备。

不同来源酶制作的传感器， 灵敏度和稳定性可能相差很大。

Streffer等发现链霉菌antibioticus的酪氨酸酶的活性是蘑菇来源酶的200多倍[13]。

Jeanty等用流动注射乙酰胆碱酯酶生物传感器检测有机磷农药毒死蜱及其衍生物， 检测范围为7.3×10-10mol/L～7.2×10-5mol/L， 通过程序自动控制进样、测定和酶活化过程， 得到很好的重现性[14]。

在某些测定中， 被抑制的酶的活性很难逆转， 因此，研制廉价的一次性酶生物传感器也有其实用价值。

AlbaredaSirvent 等用戊二醛交联法将乙酰胆碱酯酶固定在铜丝碳糊电极表面， 所构成传感器可检测10-10mol/L的对氧磷和10-11mol/L的克百威，检测加标的自来水和果汁， 回收率接近100%，可用于直接测定这两类样品中两种农药的残留[15]。

酶生物传感器一般只能检测对酶有抑制作用或作为酶底物的一类化合物， 作为农药残留初步筛检的方法， 具有简便、快速的优点。

但所用酶几乎都是从自然界筛选， 来之不易， 成本较贵， 不易保存， 难以多次反复使用。

2.3.2 微生物传感器利用环境中有毒化合物对细胞的代谢过程产生干扰的原理， 将微生物固定在电极上构成微生物传感器。

Han等将假单胞菌固定在氯离子电极上， 实时监测工业废水中三氯乙烯， 检测范围0.1～4mg/L， 检测时间在10min内[16]。

微生物生物传感器制作简单， 稳定性较好，使用寿命长、成本低， 但灵敏度较低，主要用于一些大范围的环境监测工作中。

2.3.3 免疫传感器免疫传感器是将抗体或抗原固定在电极上， 抗原抗体的结合反应通过换能器产生可测定的信号， 它结合了免疫反应灵敏、特异和传感器实时、快速的优势， 在农药残留分析中受到较多的关注。

Starodub等用葡萄球菌A蛋白将抗西玛津的多克隆抗体连接在离子选择性场效应转换器（ISFET） 上， 通过两种方式检测待测液中的西玛津[17]。

一种是待测液中同时存在已知量的过氧化物酶标记的西玛津和未知量的待测西玛津， 二者竞争与ISFET上的抗体结合， 通过测量结合在ISFET上的酶活性确定待测西玛津的浓度， 此方式的检测限为1.25μg/L，线性范围5～175μg/L。

另一种方式是先将ISFET插入待测液中， 使抗体与其中存在的西玛津充分结合， 然后再将此ISFET插入含有酶标记的西玛津液中， 使未被结合的抗体与酶标记的西玛津结合， 测量结合在ISFET上的酶活性确定待测西玛津的浓度， 此方式的检测限为0.65μg/L， 线性范围1.25～185μg/L。

2.3.4 其他生物传感器利用分子印迹聚合物（MIP） 制作的仿生生物传感器， 也引起人们的兴趣。

Sergeyeva等以莠去津为印迹分子制备的MIP-电导传感器， 可检测低至5nmol/L莠去津，响应时间在6min到15min之间， 传感器存放6个月后， 仍显示相同的识别特性， 与莠去津结构相似的三嗪、西玛津和扑草净在1～100nmol/L浓度对测定的没有干扰[18]。

Luo等制作的检测莠去津的MIP-石英晶体微天平传感器， 检测限是2.0×10-6mol/L[19]。

双层脂膜（ bilayerlipidmembrane， BLM）是结构与生物膜相似的人工膜， 具有良好的生物相容性， 是构建生物传感器的理想敏感膜[20]。

Nikolelis等的研究显示， BLM-传感器在分别接触久效磷3min、克百威5min后出现电流信号， 信号强度随农药浓度的增加而增大， 检测限分别为45nmol/L和480nmol/L[21]。

MIP-和BLM-生物传感器是新型生物传感器的发展方向， 目前这方面的研究仍处于起步阶段。

2.3 蛋白芯片技术生物芯片上可以集成的成千上万的密集排列的基因探针或免疫探针， 能够在同一时间内分析大量的样品。

蛋白质芯片是生物芯片的一种， 是在固相载体上包被蛋白质（抗原、抗体或酶等） 的微点阵， 研究抗原和抗体、抗体和小分子半抗原等相互作用的技术方法， 基于其反应原理， 可适用于环境、食品中农药残留的测定。

2.4 酶分析技术除酶联免疫和酶生物传感器外， 直接利用农药对酶活性抑制原理， 检测农药残留的技术还有酶片和酶速测仪（箱、盒）等。

酶片等是固定化有敏感酶类的滤纸片或类似载体物质， 检测时不需仪器， 便于携带和现场操作。

韩承辉等从面粉中提取植物酯酶制作酶片， 可在5～10min 检测蔬菜中常用的几种有机磷农药， 检测限为0.04～10.0mg/L[22]。

3 小结

农残检测发展的方向是更快速、更准确、更环保； 一方面要求尽量减少分析过程所花费的时间， 另一方面要实现操作自动化， 增加样本测定量； 更准确， 就是要尽可能减少人为操作的误差；更环保， 就是要减少溶剂的使用量，减轻对环境的排放和污染。

何玲1， 王李斌2（1. 陕西省农药管理检定所， 陕西西安710003； 2. 咸阳市农产品质量安全中心， 陕西咸阳712000）

PesticideScienceandAdministration2012，33

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