5基因和基因组的研究方法.docx
《5基因和基因组的研究方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《5基因和基因组的研究方法.docx（32页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
5基因和基因组的研究方法
第五章基因和基因组研究技术
从caterpillar发展成蝴蝶，基因表达谱发生了一系列显著变化。
用DNA芯片能同时检测成千上万个基因的表达水平。
右边是一张基因芯片，显示人的12000多种基因表达水平。
每个点的量度表示该基因的表达强度。
自从1970年代出现DNA重组技术以来，重组DNA技术给生物化学带来了革命性进步。
生物个体的遗传特征能够根据人类设计加以改造。
重组DNA技术是人类对DNA，RNA，和病毒研究进行了几十年研究的结晶。
该技术取决于酶切、连接、和复制DNA的酶和RNA反转录。
限制性内切酶能够将很长的DNA分子特异断裂成易于操作的DNA片段；DNA连接酶能够将DNA片段连接。
现在已经有很多限制性内切酶。
采用这种技术，研究人员能够将将DNA片段从一个DNA分子转移到另一DNA分子中。
因此重组DNA技术的基础是核酸酶学
第二个基础是碱基配对，即序列互补的核酸链相互间自动识别、自动结合形成核酸双链。
用互补DNA或RNA探针杂交检测特异核酸序列灵敏度高。
在重组DNA技术中，碱基配对用于重组DNA构建、检测和扩增特异核酸序列。
重组DNA技术也依赖病毒。
病毒能有效地将自身DNA（或RNA）供应宿主，挟持宿主复制病毒基因组、合成病毒蛋白质，或将病毒DNA整合到宿主基因组中。
质粒是细菌染色体外的遗传物质，这种遗传物质对重组DNA技术而言也是不可或缺的。
第三，已经建立了非常有效的DNA序列测定技术。
这些技术能够测定全基因组序列。
最先测定的是病毒基因组，随后是更长的细菌基因组，最后测定的是真核基因组，包括30亿碱基对长的人类基因组。
科研人员正在开始探讨这些基因组序列的海量信息。
这些新技术极大地促进了相关领域的科学研究。
即可以在天然环境中、也可以在其它条件下研究某个基因或基因产物的作用。
以某种方式改造基因，制造变异蛋白质能够详细了解蛋白质的功能。
重组DNA技术能够制造临床上有用的蛋白质，如激素；也能用来制造耐受病虫害或恶劣生长环境的农作物。
重组DNA技术提供的这些机会将产生更大的影响。
5.1基因研究的关键工具
生物技术的迅猛发展实际上是几个关键技术的产物
1.限制性内切酶分析。
限制性内切酶是精确的剪切DNA分子的手术刀，使研究人员能够操纵DNA片段。
2.印迹技术。
Southernblots和Northernblots能分别用来分离和鉴定DNA和RNA。
在前面介绍的Westernblots采用抗体鉴定蛋白质。
3.DNA序列测定。
该技术能够测定DNA分子的碱基序列。
DNA序列测定产生了大量的信息，这些信息涉及基因结构、基因表达调控、和蛋白质结构。
4.核酸固相合成。
能够化学合成所需序列的核酸分子用于鉴定或扩增其它核酸。
5.聚合酶链式反应（PCR）。
PCR能使特定DNA片段扩增上十亿倍。
PCR反应能够将一个DNA分子扩增到足以进行DNA鉴定和操作的产量。
该技术用于病原体鉴定和遗传病诊断、确定犯罪现场毛发来源、复活化石的基因。
6.最后的一套技术依赖计算机，将在第6章介绍。
没有计算机技术，我们不可能对大量信息（尤其是DNA序列信息）进行分类、检索、和鉴定。
而这些信息就是用前面提到的那些技术获得的。
限制性内切酶能够将DNA分子断裂成特异片段
限制酶也叫限制性核酸内切酶，能够识别双链DNA的特定碱基序列并在特定位点断裂DNA双链。
这种精确的分子手术刀是大自然馈赠给生物化学工作者的礼物。
分析染色体结构、测定非常长的DNA序列、分离基因、制造能被克隆的DNA分子都离不开限制性内切酶。
在1960年代后期，WernerAlber和HamiltonSmith发现了限制性内切酶，DanielNatherns首先应用限制性内切酶。
不同原核生物都有限制性内切酶。
限制性内切酶的生物功能是断裂外源DNA分子，但由于限制酶识别位点的碱基序列已被甲基化，因此限制酶不断裂生物自身的DNA分子。
很多限制酶识别的核酸序列长度是4~8个碱基对，这个区域两条核酸链都会被这个核酸内切酶水解。
这些酶识别序列的显著特征是多数限制酶识别位点具有二重旋转对称。
换句话说，使回文结构，或倒置重复。
限制性内切酶断裂位点也处于核酸链的对称位置。
例如，来源于Streptomycesachromogenes的限制性内切酶识别的核苷酸序列是
这个酶水解对称轴两侧的C-G磷酸二酯键。
在第9章所介绍的内容指出，限制性核酸内切酶酶切位点的对称性是由核酸内切酶自身结构决定的。
现在已经鉴定并纯化的限制性内切酶有几百种。
对这些限制性内切酶的命名方案是前面的三个斜写字母表示限制性内切酶的菌种来源（例如Eco表示限制酶来自Esterichiacoli,Hin表示限制酶来自Haemophilusinfluenzae，Hae表示限制酶来自Haemophilusaegyptius），后面是菌株名（如有必要）和罗马数字（如果同一菌株分离出一种以上的限制性内切酶）。
图5.1列出了几个限制性内切酶的酶切位点。
图5.1一些限制性内切酶的特异性。
这些酶识别序列有二重对称轴。
围绕该对称轴（绿色）旋转180度，序列与原始序列相同。
红色箭头标出限制酶的酶切位置。
右边是限制酶的缩写名称。
注意：
有些限制酶平切，有些限制酶错开切（产生粘性末端）。
限制性内切酶能够将DNA分子断裂成易于进行分析和操纵的特异片段。
例如长度为5.1kb的SV40是双链环状DNA，能产生肿瘤。
这个DNA分子有一个EcoRI切点，4个HpaI切点，和11个HindIII切点。
一个限制性内切酶酶切DNA的产物可以用另一个限制性内切酶酶切产生更小的DNA片段。
DNA分子为限制性内切酶酶切产生的DNA片段图谱可以作为该DNA分子的指纹。
实际上，用一些列限制型内切酶酶切产生的限制型内切酶图谱可以对复杂染色体进行作图（这样的染色体可能含有数亿碱基对）。
凝胶电泳分离、检测限制酶酶切的DNA片段
由于凝胶电泳能够分离、显示限制酶酶切的DNA片段，因此能够检测DNA分子间的细小差异。
凝胶电泳的种类很多，大多数凝胶电泳的迁移率与DNA分子式量的对数值呈负线性关系（在一定的分子式量范围内）。
聚丙烯酰胺凝胶的范围达到1000碱基对，而琼脂糖凝胶孔径更大，分子范围达到20kb。
这些凝胶电泳的一个典型特征是分辨率高有些凝胶电泳条件能够区分在几百个碱基对长的DNA分子间只相差一个核苷酸的DNA片段。
而且长度达到数百万碱基对长度的整条染色体也能用琼脂糖凝胶电泳分离。
此时采用的电场是在不同方向施加脉冲电场（即脉冲电场凝胶电泳，PFGE）。
染色体在拉伸和松弛方面有差异，因此短期内施加和切断电场能够在琼脂糖凝胶上分离染色体。
放射性自显影能够显示凝胶上同位素标记的DNA样品条带或点。
另外，用溴化乙锭染色也能显示凝胶上的DNA分子。
当溴化乙锭插入DNA双螺旋，DNA分子显示强烈的橘红色荧光（图5.2）。
一个条带只有50ng的DNA量就足以用溴化乙锭显色观察。
图5.2限制性核酸内切酶酶切SV40DNA分子的凝胶电泳图谱。
每孔相应于一种核酸内切酶。
DNA片段用溴化乙锭染色显示出荧光。
限制片段长度多态性（RFLP）
Southernblotting能用来跟踪特定基因的遗传情况。
如果限制性酶切位点发生变异，限制性内切酶酶切DNA片段的长度就会发生改变，导致Southernblot分析显示的DNA条带位置发生改变。
人群存在的遗传差异性叫多态性。
这种突变可能本身就是致病变异，也有可能与致病变异紧密连锁。
遗传疾病如镰刀性贫血症、囊性纤维病变、Huntingtonchorea可以用RFLP分析鉴定。
用标记的核酸探针杂交凝胶分离的限制型内切酶酶切条带，能够鉴定序列与探针互补的DNA片段（图5.3）。
限制性酶切产物用琼脂糖凝胶分离后，变性转化成单链DNA，转移到硝酸纤维素膜上。
DNA片段在硝酸纤维素膜的位置与原来琼脂糖凝胶的位置相同。
然后将
硝酸纤维素膜置于32P-标记的DNA探针溶液杂交，探针能够结合与探针序列互补的DNA片段，放射性自显影能够显示这条DNA片段所在的位置。
这种方式能够从成千上万种DNA片段中找出某一特定DNA片段（就像大海捞针）。
这个技术是EdwinSouthern设计的，因此成这种检测技术是Southernblotting（印迹）。
图5.3SouthernBlotting.先用电泳将DNA片段混合物分离，转移到硝酸纤维膜上，与32P-标记的DNA探针（序列与目标DNA序列互补）杂交。
然后用放射性自显影观测目标DNA条带。
也可以用类似的技术鉴定RNA分子。
RNA分子也可以用凝胶电泳分离、转移到硝酸纤维素膜上后也可以用杂交的方法鉴定。
这种方法叫Northernblotting。
Westernblotting是用特异抗体检测特定蛋白质的技术。
Southern,Northern,和Westernblots也称为DNA,RNA，和Proteinblots.
选择性终止复制能测定DNA序列
DNA序列测定技术也极大地促进了DNA结构和功能的研究。
DNA序列测定的关键是产生一组DNA片段，其长度取决于DNA序列最后一个核苷酸。
FrederickSanger及其同事建立了Sanger双脱氧方法（即选择性终止复制）测定DNA序列的技术。
与其他技术相比，Sanger双脱氧法简便，能够同时进行四种终止反应。
在这些混合物中，DNA聚合酶用来制造DNA单链模板的互补DNA序列。
合成引物是化学合成的DNA片段，与模板分子的序列已知区互补。
除了四种脱氧核苷三磷酸（同位素标记）外，每个反应混合物都含有少量的一种2',3'-双脱氧核苷三磷酸类似物，各个混合物所含的类似物不同。
图5.4链终止法测定DNA序列的策略。
一种2'3'-双脱氧核苷三磷酸加入DNA聚合酶促反应混合物产生一组DNA片段，其3'-末端就是这种2'3'-双脱氧核苷三磷酸。
例如ddATP（红色）产生的DNA片段，其末端都是ddA。
由于缺乏3'-OH，这种链不能继续延伸。
由于核苷类似物3'-末端缺乏OH，这种类似物的参入能够阻止生长链进一步延长。
双脱氧类似物浓度要足够低，使生长链偶尔参入一个双脱氧核苷酸导致DNA合成终止。
DNA聚合酶有时参入正常的核苷酸，有时参入双脱氧核苷酸导致反应终止。
例如，反应混合物含有ddATP产生的合成DNA链长度不同，但是3'-端都是ddA（图5.4）。
ddA参与的位点就是待测核酸链的T。
因此根据合成核酸链长度就能确定待测核酸链T的位置。
一套（四种终止混合物）双脱氧终止反应后，上样到凝胶的四个孔中电泳分离，从放射性自显影图谱能读出待测核酸序列。
荧光检测的灵敏度很高，能够替代放射性同位素。
每个双脱氧核苷酸连接一个荧光标签，这样每种链终止反应就带有一种特异的荧光标签（例如蓝色荧光表示ddA,红色荧光表示ddC）。
此时能够将四种终止反应混合物混在一起，进行聚合酶链终止反应。
产物在一个上样孔中进行凝胶电泳分离。
条带泳动的先后次序表示DNA链的长度，条带的荧光颜色表示DNA链的终止核苷酸，由此测定DNA链的核酸序列（图5.5）。
这种方式能够测定长度达到550核苷酸的DNA序列。
荧光检测更好，这种方法不用放射性同位素，易于自动化检测。
实际上，现代DNA测序仪器采用这种方法每天能够测定的DNA序列超过100万碱基。
图5.5荧光检测双脱氧法产生的寡核酸片段。
四个链终止双脱氧核苷酸用不同颜色的荧光标签标记（如红色标记T）。
色谱图中一种颜色表示一种核苷酸。
固相自动法能合成DNA探针
如同多肽，依次添加活化单体至不溶性载体交联的生长链能够合成DNA链。
活化单体是质子化的脱氧核苷3'-亚磷酰胺。
第1步，加入的脱氧核苷3'-亚磷酰胺的3'-磷原子与生长链的5'-O原子连接，形成亚磷酸三酯（图5.6）。
加入的脱氧核苷3'-亚磷酰胺5'-OH被二甲氧三苯甲基（DMT）保护，不参与这个连接反应。
3'-磷酰基与β-氰乙基（β-CE）结合，没有反应活性。
类似地，嘌呤和嘧啶碱基环上的氨基也需要保护。
在无水条件下进行缩合反应（因为水能够与亚磷酰胺发生反应）。
第二步，用碘氧化亚磷酸三酯，生成磷酸三酯（五价磷）。
第三步，二氯乙酸脱去生长链5'-OH的保护基团DMT，但不影响其它保护基团。
现在DNA合成已经完成一个核苷酸延长，可以进行下一轮操作。
每延长一个核苷酸耗时10分钟，延伸效率超过99%。
图5.6亚磷酸三酯法固相合成DNA链。
加成到生长链的活化单体是脱氧核苷3'-亚磷酰胺，其5'-OH用DMT保护，3'-磷氧原子用β-CE保护，还有一个保护基团保护碱基环上的胺基。
由于所需产物连接在不溶性支持物上，只是在延伸结束后才从支持物释放出来，因此固相方法是化学合成DNA、多肽的理想途径。
所有反应都在一个反应器中进行，可以加入过量试剂驱使化学反应彻底进行。
每步反应之后，可以洗去溶剂和副产物。
反应结束后，用氨水处理能够释放合成的寡核苷酸，并除去所有的保护基团。
由于延伸反应不能超过100%，合成链的长度不一致。
最长的寡核苷酸分子就是我们需要的合成产物。
合成产物可以用HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
用固相方法曾经合成了长度达到100核苷酸的DNA链。
能够迅速合成各种序列的DNA链使我们能够开展很多研究。
例如合成寡核苷酸的末端用32P或荧光基团标记可以用来搜寻很长DNA分子或含有很多染色体的基因组中某段互补的DNA序列，用标记寡核苷酸作为探针使用很有效，也很普及。
例如，能够与人色体上某段序列互补的DNA探针可以用来探讨染色体上相邻DNA。
用该探针作为引物进行PCR扩增能获得相邻的DNA片段。
DNA化学合成技术能够制造新基因。
已经有很多实例利用合成基因表达生产具有新特性的蛋白质。
聚合酶链式反应（PCR）能选择性扩增DNA序列
1984年KaryMullis设计了聚合酶链式反应（PCR）扩增特意的DNA序列。
DNA分子是连续的DNA双链。
我们所要扩增的DNA序列（即目标序列）两侧有非目标DNA序列。
如果目标序列两侧的DNA序列已知就能用PCR扩增制造大量的目标序列。
在含有目标序列的溶液中加入：
（1）能够与两侧序列杂交的一对引物，
（2）四种脱氧核苷三磷酸，和（3）热稳定的DNA聚合酶。
一轮PCR反应含有三个步骤（图5.7）。
1.链分离。
将DNA溶液在95℃加热15s，亲本DNA分子双链分开，成为单链DNA。
2.引物杂交。
将DNA溶液迅速冷却至54℃，使引物与DNA链杂交。
一种引物与其中一条DNA链目标序列的3'-端结合，另一种引物与另一条DNA链的3'-末端结合。
由于引物量比亲本DNA多很多，因此不会形成亲本DNA双链。
3.DNA合成。
溶液加热至TaqDNA聚合酶最适温度，即72℃。
TaqDNApolymerase是从温泉生长微生物thumusaquaticus分离的。
两条引物发生延伸（方向是5'-3'）。
两条引物的延伸会超出目标序列。
图5.7第一轮PCR扩增反应。
一轮PCR反应含有三个步骤：
链分离，引物杂交，和引物延伸（DNA合成）。
这三个步骤—链分离、引物杂交、和链延伸—构成一轮PCR扩增。
改变混合物的温度恩能够重复上述操作。
DNA聚合酶的热稳定性是PCR反应在一支密闭试管内执行PCR操作，每轮反应后不必添加试剂。
第一轮扩增反应完成后，加热启动第二轮扩增，产生4个双链。
接着启动第三轮扩增（图5.8）。
第三轮扩增的产物有两个短链（只含有目标序列和两侧的引物序列）。
后续扩增是目标序列的对数扩增，而更长些的DNA链只能算术扩增，并充当一些短链（由目标序列和两侧引物序列构成）合成的模板。
理想状态下，经过n轮PCR扩增后目标序列的产物是2n倍。
经过20轮扩增，目标序列达到数百万倍数量级，30轮能够达到数十亿数量级。
这些扩增可以在1小时内完成。
图5.8多轮PCR反应。
第三轮扩增的产物是两分子的短DNA双链（相伴产生的两分子的长DNA双链没有画出）。
短DNA双链就是目标序列。
后续的PCR反应能对数扩增目标序列，而亲本DNA序列只能算术扩增。
这种扩增有几个显著特征值得注意。
第一，不必知道目标序列，只需要目标序列两侧的DNA序列。
第二，目标序列比两侧的引物长很多。
PCR扩增能够扩增长度超过10kb的目标序列。
第三，引物与两侧序列并不必要100%配对。
用序列已知基因设计的引物，PCR能够检测基因变异，发现基因家族。
第四，提高杂交温度能够提高PCR扩增的严谨性。
严谨性是引物与目标接触（二不是与其它区域接触所需要的）。
目标与引物接触受温度、和溶液盐浓度的影响。
温度高，只有两个引物杂交序列之间的DNA才能被扩增。
用PCR技术能够扩增高等生物的某一基因，虽然该基因在总DNA的含量还不到百万分之一。
PCR能够扩增、检测单DNA分子。
PCR是医学诊断、法医和分子进化研究的重要工具
PCR能够提供有价值的医学诊断结果。
用特异引物进行PCR能够检测细菌和病毒。
例如，PCR能查出没有症状但是已经感染HIV的人群（这类人群用抗体免疫检测会漏检）。
用组织培养检测结核杆菌速度慢、劳动量大。
用PCR检测，一百万个人细胞中只有10个结核杆菌就能够检测出来。
PCR能够坚定一些生长控制基因的（如ras）的基因突变。
选择性扩增特定区域的DNA序列在检测癌症治疗效果方面也有用。
如果PCR检测结果显示癌细胞已被消除，化疗就可以停止。
PCR检测发现停药后癌细胞又出现了，就要恢复用药。
PCR检测染色体重排导致白血病是非常灵敏准确的。
在法医领域PCR也非常有用。
在人群中很多遗传基因是高度可变的，因此这些为点的个体DNA谱有个体专一性。
例如人白细胞表面抗原（HLA）就是高度可变的，PCR能够确定个体的HLA类型。
若供体和受体的HLA类型不匹配，器官移植后悔产生免疫排斥反应。
多基因PCR扩增还用于亲子鉴定。
PCR分析嫌疑人血迹或精液能够找出真正的强奸或杀人凶犯。
犯罪现场留下的一根发根含有足量的DNA进行PCR分型（图5.9）。
DNA分子稳定，尤其是在避光、无水、和隔绝空气的情况下DNA分子就更为稳定。
在这样的条件下，大的DNA分子在几千年的时间内不发生断裂。
PCR是扩增古代DNA分子的理想方法。
扩增之后才能进行鉴定和检测。
PCR还能扩增那些无法培养微生物的DNA。
下一章将介绍PCR产物的DNA序列能够跟踪不同生物的进化关系。
图5.9DNA与法医。
从嫌疑人裤衩和衬衫的血迹分离的DNA用PCR扩增，与嫌疑人和受害人的DNA样品进行比较，凝胶电泳后放射性自显影。
嫌疑人衣服上的血迹DNA与受害人一致，但与嫌疑人不同。
DNA类型偶尔相同的概率大约330亿分之一，因此用这种技术鉴定的结果非常准确。
上样孔分别是：
λ，1kb，TS（对照DNA）,D（嫌疑人DNA）,jeans和shirt（来自嫌疑人衣物的血迹），V（受害者DNA）.
5.2重组DNA技术使生物学各个领域发生了革命性变化
在1970年代PaulBerg,HerbertBoyer,和StanleyCohen的开创性工作建立了重组DNA技术，使生物学从纯粹的分析科学发展成合成科学。
采用重组DNA技术，再实验室能够将无关基因组合起来。
新的基因组合能够克隆、扩增、并能被引入适当细胞（在这种细胞内，宿主DNA合成机器能合成引入的组合基因）。
宿主细胞能够转录外源基因，并翻译合成外源基因所编码的蛋白质产物。
最显著的特征是这种技术能永久性改变宿主的遗传特征。
限制性内切酶和DNA连接酶是形成重组DNA分子的关键工具
现在我们介绍实验室如何构建新DNA分子。
目标DNA片断必须与DNA载体共价交联。
载体的必需特性是它能够在适当宿主中能自主复制。
质粒是细胞体内存在的染色体外的遗传物质，是环状双链DNA。
λ噬菌体是大肠杆菌的病毒。
质粒和噬菌体是大肠杆菌的基因克隆载体（vector）。
载体可以用限制性内切酶酶切，酶切后可以接受一个新DNA分子。
例如，质粒pSC101是一个9.9-kb的双链环状DNA分子，有一个单一切点EcoRI。
用EcoRI酶切后，产生粘性末端。
任何DNA片段，只要两端的粘性序列与EcoRI酶切产生的粘性末端相同（用相同的限制性内切酶断裂大DNA分子能够获得）就能与载体结合（图5.10）。
DNA片段末端的单链区与质粒酶切后产生末端的单链区互补，退火配对后用DNA连接酶连接。
DNA连接酶需要3'-OH和5'-磷酸，将缺口连接成磷酸二酯键。
DNA连接酶要求DNA分子是双链，连接反应需要ATP或NAD+提供能量。
图5.10粘性末端将DNA分子结合。
两个DNA分子用同一限制性内切酶酶切，产生的DNA片段用DNA连接酶连接生成重组DNA分子。
可以用化学合成的DNA接头（linker）制造这种粘性末端。
首先将这种化学合成的接头与平端的DNA片段连接。
例如十聚核苷酸的接头用多核苷酸激酶将5'-末端磷酸化，然后用T4-DNA连接酶连接（图5.11）。
这种连接酶能够将平端DNA分子共价连接。
接头部分有限制性切点，用限制性内切酶酶切产生粘性末端。
因此任何DNA分子都可以用这种方法制造粘性末端。
将化学合成和酶学方法结合制造新DNA分子。
图5.11粘性末端的形成。
添加化学合成的接头，然后用限制性内切酶酶切，形成粘性末端。
质粒和λ噬菌体是在大肠杆菌进行DNA克隆的选择性载体
基因工程用的很多质粒和噬菌体已经被修改，目的是促进重组DNA分子进入细菌或易于选择携带这种载体的细菌。
质粒是一些细菌中天然存在的染色体外遗传物质，使双链环状DNA分子，长度在2kb到几百kb之间。
质粒携带的基因能失活抗生素、制造毒素、分解天然产物。
质粒能独立于细菌染色体的方式进行复制。
与宿主基因组不同，在一定条件下，质粒是细菌不可或缺的。
每个细菌可以完全没有质粒，也可以有20拷贝的质粒。
pBR322质粒.第一个用于基因克隆的质粒是pBR322。
这个质粒有两个抗生素基因，分别是四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
不同限制性内切酶能够在该质粒的不同位点发生酶切。
这些限制性酶切位点可以插入外源DNA片段。
在EcoRI位点插入外源DNA片段不影响质粒的两种抗生素抗性基因。
在SalI或BamHI位点插入外源DNA导致四环素抗性基因失活（图5.12）。
DNA片段插入导致基因失活得现象叫插入失活。
细胞携带的在SalI或BamHI位点插入外源DNA的pBR322能够耐受氨苄抗生素，但不能耐受四环素，因此可以利用抗生素来选择重组质粒。
没有摄取质粒的大肠杆菌对四环素、氨苄青霉素都敏感。
图5.12质粒pBR322的遗传图谱。
该质粒携带两个抗生素抗性基因。
与其它质粒一样，该质粒是双链环状DNA分子。
pUC18质粒。
与pBR322质粒相比，更新的质粒载体已经被改造使之易于使用。
pUC18就是这类质粒的代表（图5.13）。
与pBR322一样，该质粒有一个复制起点，有一个氨苄青霉素抗性基因座位选择标记。
但是这个质粒有一个β-半乳糖苷酶编码基因。
β-半乳糖苷酶能够降解一些糖。
因此能够将无色底物x-Gal转化成可见的蓝色产物。
通过基因工程的方法使β-半乳糖苷酶编码区带有多接头序列（polylinkersequence），可以用很多限制性内切酶酶切，增加了质粒适应各种末端DNA插入的能力。
DNA片段的插入导致β-半乳糖苷酶失活，不能产生蓝色产物。
因此利用颜色能够鉴定携带重组DNA的大肠杆菌细胞。
图5.13质粒pUC18的遗传图谱。
该质粒的β-半乳糖苷酶基因（也称为lacZ基因）有多接头序列（polylinker）。
DNA片段插入该区域的限制性内切酶切点导致β-半乳糖苷酶失活。
λ噬菌体。
另一个广泛使用的载体是λ噬菌体。
λ噬菌体生活周期有两种模式，即溶原（lyogenic）途经和溶菌（lytic）途经（图5.14）。
在溶菌途经病毒功能彻底展示出来，迅速合成病毒DNA和病毒蛋白质、包装成病毒颗粒、导致宿主细胞崩溃（每个细
升级会员 