大学生创新创业训练计划.docx

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大学生创新创业训练计划

项目申请书

项目名称：

人胎盘间充质干细胞移植对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢功能修复的实验研究

项目类型：

基础研究

负责人：

韩抒洁

学号：

院系专业：

临床医学院临床医学专业（全科医学方向）

指导教师：

张洪芹教授

企业导师：

（创业实践类项目填）

填表日期：

年月日

滨州医学院制表

项目名称

人胎盘间充质干细胞移植对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢功能修复的实验研究

申请　团队　情况

姓名

所在院系

专业

联系电话

－号

韩抒洁

临床医学院

临床医学

张滢泉

临床医学院

临床医学

杨辰欣

临床医学院

儿科

吴昊

临床医学院

临床医学

指导

教师

情况

姓名

张洪芹

职称

教授

电话

研究方向

生殖内分泌

企业

导师

情况

姓名

职务

电话

一.申请理由

（内容应包括自身具备的知识条件、自己的特长、兴趣和已有的知识基础、科研经历、创业经历等）

该创新项目研究团队在张洪芹教授的指导下，由四名本科生组建。

其中，团队指导教师张洪芹教授近年来一直从事不孕机制的相关研究，尤其在卵巢早衰方向的研究上，已取得了良好进展，并指导多名研究生顺利毕业，因而对本项目所涉及的科研思路及具体研究方法熟悉，能够把握该研究方向的前沿信息并为团队提供切实有力的指导意见。

同时，该项目负责人在张洪芹教授的指导下，自本科一年级起涉足有关卵巢早衰的研究。

在近三年的学习过程中，其主动利用寒、暑假期积极参与到文献查阅、课题讨论、实验操作等具体科研工作中去，科研思路现已初步养成。

该生行事沉稳、认真负责，得到了带教老师与共事研究生的认可，具备承担创新科研任务的能力。

此外，课题组主要成员工作认真踏实，勤奋上进，学习态度端正，对生殖医学，尤其是卵巢早衰的研究怀有热忱。

加之，团队成员组织学与胚胎学、免疫学、生理学等临床专业基础课程知识掌握牢固，英语水平较高，具备完成查阅文献、课题讨论等科研工作的能力。

在前期课题准备阶段，团队成员间坦诚沟通，配合默契，能够及时顺利地完成对科研思路的讨论与完善。

最后，该创新项目具有良好的前期研究基础和明确的研究目标。

前期诱导自身免疫性卵巢早衰小鼠模型已构建成功并进行了染色及免疫组化等预实验，明确了自身免疫性卵巢早衰小鼠模型卵巢组织、、等信号分子的表达。

在熟悉掌握了本实验所采用的实验方法及步骤的基础上，我们的创新项目研究将更为切实可行。

特此申请。

二.立项背景

（包括国内外研究现状、趋势、研究意义、参考文献和其他有关创新创业背景材料）

卵巢早衰（,）是指育龄期女性因性腺功能衰竭出现持续性闭经和性器官萎缩[]，其主要特点为患者体内雌激素水平低落，垂体卵泡刺激素（，）及黄体生成素（，）水平失去抑制而升高。

临床表现为原发或继发闭经，不孕，伴有潮热、出汗、阴道干涩等。

的患病率为，并且发病率有上升趋势，给患者及其家庭带来严重的生理、心理和社会问题。

信号通路是细胞增殖调控的重要通路,调节细胞发育的各个方面，如细胞凋亡、细胞周期进程和细胞分化[],主要是通过促进细胞增殖起到抗凋亡作用。

其抗凋亡机制主要是激活后的通过直接磷酸化凋亡机器组件或间接改变编码凋亡机器组件的基因表达水平控制凋亡过程[]。

近年来通过各种基因修饰小鼠或通过大鼠模型对通路在卵巢相关生理和病理过程进行系列研究，证实其参与调节卵母细胞生长、原始卵泡发育，颗粒细胞的增殖、分化及卵巢肿瘤的发生发展等过程。

而在人类卵母细胞中通路中各信号分子异常表达[]会导致原始卵泡生存和发育的缺陷，造成卵巢的病理状态，甚至引起；颗粒细胞内的信号通路对卵泡的生长和成熟有至关重要的作用。

信号通路在细胞稳态、神经发育、新陈代谢及其他过程中均发挥着关键作用。

的治疗极为困难，迄今尚无有效的保护和恢复卵巢功能的措施。

中医治疗主要运用经方、针灸或中西医结合[]治疗。

西医的治疗方法主要是激素替代治疗、卵巢移植、低温保卵技术、免疫疗法等，国内外干细胞与基因治疗的动物实验研究也有相应文献报道[]。

目前尚未发现特效抑制剂或直接治疗的病例报道，更多的是发现其参与肿瘤细胞抗凋亡[],究其机制或是通过不同靶点抑制信号传导通路，减少的活化，激活凋亡蛋白活性促进细胞凋亡。

干细胞治疗研究中，相比较骨髓间充质干细胞存在取材困难、伦理问题等问题，人胎盘间充质干细胞（）取材方便，相对纯净，与干细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率远低于骨髓移植，可在体外进行分离、培养扩增迅速，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以为实验和临床提供充足的细胞来源，在化疗所致卵巢早衰中的应用价值在动物实验中已得到证实。

因此，课题组通过构建自身免疫性小鼠模型，部分小鼠给予移植治疗及利用阻断剂阻断信号通路作用，检测各组小鼠动情周期、卵巢形态变化和性激素水平鉴定模型成功；同时原代培养，与分离纯化的卵巢颗粒细胞通过小室共培养，法检测卵巢颗粒细胞黏附及迁移；检测相关信号分子表达变化；检测信号分子蛋白表达变化；应用检测脾脏细胞亚群分化。

信号通路抑制剂检测修复小鼠卵巢功能与信号通路关系的研究，为进一步研究的免疫学发病机制，阐明有效治疗的分子免疫学机制，为卵巢早衰的免疫治疗提供新的思路。

主要参考文献

[]焦智慧,史惠蓉.卵巢早衰诊治进展[].国际妇产科学杂志,,（）:

[]吴成军,赵金龙,周志旭,等.选择性抑制剂的研究进展[].中南药学,（）:

[]张毅敏,于斌,陈佳,等.针刺治疗对卵巢早衰大鼠信号通路的影响[].中国针灸,,（）:

[],,,.[].,,（）:

[]洪丽华.中西医结合治疗卵巢早衰例临床疗效分析[].中外医学研究,,（）:

[],,,.[].,,（）:

[]刘炜,周围,童晓文,等.干细胞治疗卵巢早衰的实验研究进展[].山东医药,,（）:

[]王博.抑制剂诱导卵巢癌细胞凋亡机制的研究[].遵义医学院,.

[]袁犁,周琦,徐发良,等.特异性抑制剂对卵巢癌紫杉醇耐药细胞株逆转作用的研

究[].中国肿瘤临床,,（）:

三.项目研究方案

（包括研究目标、研究内容、研究方法、技术路线、可行性分析、商业前景分析等）

研究目标：

（）体内实验明确修复自身免疫性小鼠卵巢对相关因子的影响；

（）体外实验明确信号通路在修复自身免疫性小鼠卵巢中的作用。

研究内容：

第一部分：

体内实验探讨修复自身免疫性小鼠卵巢对相关因子的影响；

.雌性小鼠只，小鼠模型的构建及鉴定，给予治疗，将实验小鼠分为正常组、组、组、组和组；

.阴道涂片检测各组小鼠动情周期变化；

检测各组小鼠卵巢形态改变及卵泡计数；

.免疫组化检测各组小鼠卵巢中、、的表达；

.检测各组小鼠血清、、和的表达变化；

检测卵巢颗粒细胞凋亡；

检测脾脏、、、表达水平。

第二部分：

体外实验探讨信号通路在修复自身免疫性小鼠卵巢中的作用。

1.机械法分离小鼠卵巢颗粒细胞及培养；

.的原代分离及鉴定；

检测卵巢颗粒细胞、、分子表达水平；

.检测颗粒细胞、、蛋白表达水平；

检测颗粒细胞凋亡情况；

法检测颗粒细胞黏附及迁移情况。

研究方法：

1．实验分组：

雌性小鼠只，鼠龄周，级，购自济南朋悦实验动物中心。

体质量±，动物室温（±）℃，普通饲料喂养，自由饮水。

适应周后，每日点行小鼠阴道脱落细胞涂片，判断小鼠动情周期，筛选动情周期正常的小鼠进入正式实验。

根据实验设计，将小鼠随机分为正常组（）和模型组（）。

2．小鼠模型的构建

将鼠类透明带多肽溶解于双蒸水中，浓度为，再备等量的弗氏完全佐剂，完全混匀。

组小鼠后脚掌和腹部皮下进行注射两者混合物只；后等量溶于相同剂量不完全弗氏佐剂继续脚掌及腹部皮下注射。

后观察小鼠阴道脱落细胞涂片，以出现动情周期紊乱显示模型制备成功。

3．小鼠尾静脉移植及部分阻断信号通路

将模型组小鼠分为组和细胞治疗组，细胞治疗组又分为组、组、组。

细胞治疗组小鼠尾静脉注入×单细胞悬液，后组小鼠每日腹腔注射与的混合液，连续；组小鼠每日等体积注射作为对照组；组不做处理。

取材进行后续操作。

4．检测各组小鼠性激素、和的改变

各组小鼠眼球摘除取血，室温放置，离心后取上清，按照操作规程检测血清卵泡刺激素（）、黄体生成素（）和雌激素（）的水平。

5．检测小鼠卵巢形态改变及卵泡计数

取小鼠卵巢组织，经固定、包埋、切片后行染色，观察卵巢的组织形态学改变并计数各级卵泡。

6．免疫组化检测卵巢、、的表达

对卵巢组织行切片处理后，根据免疫组化试剂盒步骤进行试验。

7．检测颗粒细胞凋亡

卵巢石蜡切片脱蜡至水，按照试剂盒说明避光进行荧光染色。

8．检测脾脏组织、、、表达水平

小鼠脾脏组织研磨取脾细胞，离心后重悬破膜后，分别加入、、、行胞内染色，流式机检测（）和（）表达变化。

9．的原代分离及鉴定

取健康足月产妇的胎盘组织，将胎盘组织剪碎，加入型胶原酶，℃消化，。

目筛网充分研磨，收集细胞，细胞计数之后，接种于孔板中，℃，条件下培养。

半量换液，之后每全量换液，传代一次，选择生长良好的第代细胞，用胰酶和消化。

制成浓度为×的单细胞悬液，用于第一部分治疗组。

上述单细胞悬液，分别加入抗人、、、、、和等单抗各µ，为阴性对照，检测，进行细胞鉴定。

．法检测卵巢颗粒细胞黏附及迁移的情况

向检测板中加入培养基并设定背景阻抗值，收集对数期细胞并计数，调整细胞悬液浓度，放

入培养箱中检测台，自动获取细胞迁移黏附的曲线。

．检测卵巢颗粒细胞凋亡情况

胰酶消化卵巢颗粒细胞，经离心重悬等步骤，流式机检测对卵巢颗粒细胞凋亡的影响。

．检测

电泳分离目的蛋白，凝胶电泳，转膜后，脱脂奶粉封闭，液洗涤，滴加兔抗小鼠、、一抗，℃孵育过夜，液洗膜后，滴加二抗，洗涤、显色，测定吸光度，检测卵巢组织中、、的蛋白表达水平。

．检测：

法提取各组卵巢颗粒细胞，取等量，加入相应的引物和逆转录酶，反转录得到。

按照试剂盒说明书，取等量进行反应，检测卵巢组织中、、水平。

技术路线：

第一部分：

体内实验探讨修复自身免疫性小鼠卵巢对相关因子的影响

第二部分：

体外实验检测信号通路对卵巢颗粒细胞凋亡的影响

可行性分析：

（）具有良好的前期研究基础和明确的研究目标：

前期诱导自身免疫性卵巢早衰小鼠模型已构建成功并进行了染色及免疫组化等预实验，明确自身免疫性卵巢早衰小鼠模型卵巢组织、、等信号分子的表达。

另外熟悉掌握了本实验所采用的实验方法及步骤，有利于下一步实验的进行和完成。

该项目研究目标明确。

（）具有较强的研究队伍：

带教老师近年来一直从事不孕机制的相关研究，对本项目所涉及的研究方法熟悉。

课题组主要成员工作认真踏实，基础知识牢固，英语水平较高，能够及时完成相应的科研任务。

（）具有完善的实验条件：

学校的医药研究中心具有完成本项目所需要的各种实验设施，保证本实验的顺利进行。

四.研究进度安排

：

查阅文献，分析课题，确定研究思路。

：

建立自身免疫性卵巢早衰小鼠模型、细胞治疗模型及信号通路阻断模型。

：