一代测序常见问题及解决策略.docx
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一代测序常见问题及解决策略
测序常见问题及解决策略
一、PCR常见问题
1.假阴性，不出现扩增条带
PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：
1）模板：
①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：
酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：
Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：
变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：
靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性
假阳性：
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：
1）引物设计不合适：
选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：
这种污染有两种原因：
一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：
操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：
必要时重新设计引物。
减低酶量或调换另一来源的酶。
降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
适当提高退火温度或采用二温度点法。
4.出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：
减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2+浓度。
增加模板量，减少循环次数。
二、一代测序结果常见问题及分析
原始数据图片为：
图1
分析后无干扰峰的常规序列图为：
图2
常见问题有：
1.钉子峰
图3
产生原因：
样品或毛细管内有气泡或灰尘、结晶等固体小颗粒反射激光，所以信号很高，而且所有波长（4色）都有。
解决办法：
灌胶时不要产生气泡；使用过的毛细管在取下一段时间后，重新安装前要清洗；要经常擦去灰尘；样品纯化干净。
2.PCR产物测序时出现重叠峰
1）单一位点（图4）或两个位点（图5）的碱基缺失导致测序结果移码
图4
图5
产生原因：
碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，如上图所示，单一位点或两个位点的缺失会导致测序结果移码，影响碱基的判读。
解决策略：
①将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。
或使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。
②如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。
2）测序引物碱基缺失
图6
产生原因：
测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决策略：
重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。
3.克隆测序时出现峰形重叠
图7
产生原因：
所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是送测序的菌液污染。
解决策略：
重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。
4.样品有杂合/突变位点
图8
产生原因：
范本中有杂合型突变，也就说范本本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。
如果范本有杂合突变或缺失，那么测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个点出现重叠峰（如图中箭头所示）。
解决策略：
建议将DNA片段克隆到载体再测序。
5.PolyA/T结构
图9
图10
产生原因：
如图9、10所示，在PolyA/T结构出现后，测序酶容易在模板上滑动，导致PolyA/T结构后的峰形变得杂乱，出现移码现象。
解决策略：
使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。
6.G/C特殊结构区
图11
产生原因：
序列中存在一个GC特殊结构区，在该区域后，信号迅速减弱。
上图的下半部分是对测序反应进行优化后的测序结果，在GC特殊结构后，测序信号得到一定程度的改善，但是离一般的测序结果还是相差甚远。
解决策略：
针对该类型的模板，一般应从反向进行测序，然后在该特殊结构区附近将两个方向的测序结果拼接起来，得到完整的序列。
7.基因中含有重复序列
图12
产生原因：
样品中含有重复序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致复制框滑动，较短的重复序列会导致测序结果出现移码；而较长的重复序列会使信号衰减。
解决策略：
反向测序有时能够顺利的通过重复序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。
8.背景峰杂
1）模板杂
图13
产生原因：
与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。
但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。
如上图所示，该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。
解决策略：
改变PCR条件，重新扩增。
或者可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。
2）引物不纯
图14
产生原因：
引物不纯造成移码现象，与模板杂在峰图上均表现为背景峰杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前都有一个同一碱基的小峰。
解决策略：
重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。
9.模板不单一
1）菌液为非单克隆
图15
产生原因：
上图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即测序结果在载体部分很准确，而进入插入片段后出现双峰的情况。
这是由于在接种时没有挑单菌落导致的，当两个以上的正常的克隆（插入片段方向相反），或正常克隆与空载体混在一起，而通过酶切和PCR鉴定很难看出异常，尤其在T-A克隆时经常碰到。
解决策略：
重新涂平板挑单菌落测序。
需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。
2）PCR产物不纯
图16
产生原因：
在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。
（注：
PCR产物测序都是以A高峰终止。
）
解决策略：
对PCR产物切胶纯化，再进行测序。
10.回文结构
图17
产生原因：
位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。
解决策略：
使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。
11.酒精峰和染料峰
图18
产生原因：
Bigdye测序反应试剂盒（BDT）中的bigdyemix稀释过度出现染料峰，纯化的酒精没有挥发干净则会出现酒精峰，一般情况下这样的峰形出现在前200bp的某部分，大部分情况下是不影响测序结果的。
解决策略：
重新安排反应。
12.测序一开始就出现双峰
图19
产生原因：
①样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。
当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形。
②样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。
通常PCR样品含非特异性扩增，存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时容易发生这种情况。
③样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。
当引物恰好设计在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现双峰的情况。
解决策略：
①划平板挑取单克隆测序；②优化PCR体系或者克隆后测序；③选用特异性引物。
13.PCR测序结果出现N值
图20
产生原因：
该结果信号很强，峰型整齐，但是在该测序结果中有多个位置有重叠峰，出现N值。
造成该情况的主要原因很可能是该PCR产物中有突变体的存在。
在每个突变位点上有一个重叠的峰，由于仪器无法正确识别该处的碱基，就只能以N值代替。
解决策略：
暂无较好地解决办法
14.瀑布效应
图21
15.大分子荧光物质污染
图22
16.轻微荧光污染
1）
图23
2）
图24
17.宽峰
图25
18.测序结果无信号
图26
产生原因：
在确认引物、质粒抽提浓度、反应安排等条件无问题的情况下，测序结果峰型杂乱且信号值小于100的结果；此时则判定结果为测序无信号。
两次测序无信号，则会取消实验。
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