生物技术综合实验.docx
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生物技术综合实验
2007级生物技术专业
生物技术综合实验讲义自己打印
—从重组质粒的鉴定到目标蛋白的鉴定
生命学院生物工程系
2010年07月06日
研究内容简介及考核
一、实验部分（8月29日-9月3日）
内容一）：
重组质粒的分离、鉴定
培养携带有重组质粒的细菌，提取重组质粒，然后用限制性内切酶酶切和琼脂糖电泳的方法检测重组质粒的大小，同时回收酶切质粒，以便连接后导入细菌中。
实验1.重组质粒的分离、纯化及检测
实验2.质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收
内容二）重组质粒的转化及重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
将连接好的完整质粒导入细胞内即重组质粒转化感受态细胞（未携带有目标蛋白基因的细菌），得到重组子。
实验3.质粒连接、感受态细胞的制备与转化
实验4.细菌的大量培养及IPTG对重组蛋白的诱导表达
内容三）重组蛋白的提取、纯化与鉴定
采用超声波破碎法破碎细菌，并用亲和技术纯化目标蛋白
实验5.细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化
实验6.目标蛋白纯度的SDS-PAGE鉴定
内容四）巨噬细胞吞噬异物的观察
实验7.吞噬过程观察（视频观摩）。
二、实验讨论与总结
各组按要求提供全部结果并进行对比分析。
时间：
2011年9月4或5日，（具体时间待定）。
三、考核：
1）平时出勤及操作成绩（30%）
2）实验结果（30%）
3）实验报告（40%）
06120801班2011年秋季小学期
《生物技术综合实验》分组安排
5号楼6层627-2，601房间，第2周，周1-周日（全天）
序号
学号
姓名
分组
具体分工
考查1
考查2
考查3
考查4
汇总
1
20081890
仇银祥
第 1
组
2
20081891
丁良工
3
20081892
付婷钰
4
20081893
傅玉娟
5
20081894
贾邱添
第 2
组
6
20081895
李驰华
7
20081896
李明
8
20081897
李晟铭
9
20081898
彭广
第 3
组
10
20081899
申文伊
11
20081900
王炳
12
20081901
夏雨
13
20081902
谢欧洋
第 4
组
14
20081903
辛迪
15
20081904
徐进
16
20081905
晏晓阳
17
20081906
张祥
第 5 组
18
20081907
赵楠
19
20081908
朱许婷
1、分组为随机分组，如需调整，请本周4晚前反馈调整结果；
2、各组员除参与全部实验之外，还有具体的分工：
1）角色A，组长：
负责全面工作，实验安排、人员协调等；
2）角色B，阶段工作监督员：
核查、完善阶段性工作；
3）角色C，结果记录员：
记录结果（数据、图像等）；
4）角色D，结果记录核查员：
检查结果是否记录、是否完整等。
3、每个同学均独立写出各自完整的实验报告，包括实验目的、主要内容（对讲义的实验步骤进行简化）、结果与分析（重点部分）、感想（非必须项）。
4、提前做好预习：
熟知基因操作、转化子、质粒/载体、工程菌、诱导、限制性内切酶、连接、筛选、表达、超声波破碎、亲和层析、核酸电泳、SDS-PAGE等基本概念。
实验1质粒DNA的分离、纯化及检测
总时间：
约2天。
开始时间：
8月29日上午8：
30
一、目的：
对含有目标蛋白基因的质粒进行分离、纯化及检测。
二、目标蛋白简介：
第1种：
分子量约15kD，有重要的药用价值，pI不详，其对应的基因片段大小约400bp，质粒大小4.2kb。
第2种：
麦芽糖结合蛋白，分子量约43kD，pI在5-6之间，主要功能：
1）帮助细菌转运麦芽糖；2）细菌内部的区域化（如改变鞭毛的运动方向）；3）拟分子伴侣作用。
已经构建好的质粒pET-28a（+），约5.4kb；带有Histaq，可表达麦芽糖酶，载体抗性：
Kanamycin；基本培养基（LB培养基），37℃培养。
质粒的酶切位点如附图。
三、实验操作：
一）材料、试剂与设备
1、转化的细菌（菌液或平板）；
2、1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管）及对应的离心管架；
3）微量取液器（10μl、200μl、1000μl各一把）及对应的枪头盒；
4）试管：
30mL，2只；（复活细菌）；
5）三角瓶：
150mL及封口膜、200mL三角瓶
6）LB液体培养基（Luria-Bertani）：
称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20分钟。
7）LB固体培养基：
液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。
8）氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）母液：
配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备用。
9）质粒提取试剂盒。
10）核酸电泳用6×电泳载样缓冲液（0.25％溴酚蓝，40％（w/v）蔗糖水溶液），贮存于4℃。
11）50×TAE电泳缓冲液：
（242gTris碱；57.1ml冰乙酸；100ml0.5mol/LEDTA,pH8.0）；使用浓度为1×TAE。
12）琼脂糖若干；
13）DNA分子量标准（500-8000bp）；
14）核酸染料：
溴化乙锭（EB）溶液母液：
将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可；
15）凝胶成像系统或紫外透射仪；
16）一次性手套。
1）小型台式高速离心机；
2）恒温振荡摇床；
3）高压蒸汽消毒器（灭菌锅）；
4）涡旋振荡器；
5）电泳仪及琼脂糖平板电泳装置；
6）恒温水浴锅；
7）超净台（内含酒精灯、棉球、火机、接种环、废料容器等）
二）操作步骤
1.细菌的培养和收集
取含有重组质粒的冻存菌，在固体培养基上划线，37℃倒置培养过夜。
然后用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到2-5mlLB液体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
2.取液体培养物1.2mL于Eppendorf管中，然后6000g/min离心2min，彻底弃上清。
如菌体浓度过低，可重复此操作，以便得到合适的菌体。
3.以下步骤见质粒提取试剂盒说明。
A）向上述含有离心管中加入250μL溶液I，使用取液器或涡旋振荡器彻底将细菌悬浮。
B）向上述离心管中加入250μL溶液II，温和地上下翻转6-8次，使细菌充分裂解（时间不超过5min）。
C）向上述离心管中加入350μL溶液III，立即温和地上下翻转6-8次，以使溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
13000rpm离心10min，用取液器小心将上清液移到另一个干净的离心管中，尽量不吸出沉淀。
D）将上步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温（实际温度：
℃）放置1-2min，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
E）向吸附柱中加入700μL漂洗液（必须含有乙醇），13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
F）向吸附柱中加入500μL漂洗液（必须含有乙醇），13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，继续离心2min，最后将吸附柱室温（实际温度：
℃）放置1-2min。
此步2min的离心过程和室温放置过程很重要，目的是尽量彻底除去残存的乙醇，以免影响后期的酶切或PCR操作。
G）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100μL经过65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置2min，然后13000rpm离心2min，将收集液收集到离心管中（内含要提取的质粒）。
为增加质粒的收率，得到的离心液可重新放回吸附柱中进行第二次离心。
注意所用洗脱液的pH在7-8.5范围内。
所得的质粒可在-20℃保存。
所得质粒于-20℃保存或直接用于电泳检测。
4.0.8%琼脂糖电泳检测
目的是对提取到的质粒的大小进行检测以初步判断是否与理论值相符并确定浓度以为酶切提供参考。
检测的样品至少包括：
Marker、提取得到的质粒（可以有几个重复）。
A）取50×TAE电泳缓冲液缓冲液4mL加水之200mL，配制成1×TAE缓冲液，待用；
B）配制0.8%琼脂糖凝胶：
称取0.4g琼脂糖，置于200mL三角瓶中，加入50mL1×TAE缓冲液，轻摇、溶胀30min后，放入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，总时间约1min，分多次加热（切记）。
C）胶板的制备：
将有机玻璃胶槽放好，插上样品梳子。
将冷却至50-60℃的琼脂糖胶液小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，将胶放入电泳槽。
D）加样：
取10μl酶解液与2μl6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。
若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
E）电泳：
加样结束后，盖上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
F）染色观察和拍照：
取出胶放入EB池中染色，30分钟后取出。
在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。
DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
照相并保存。
结果记录格式见附录（下同）。
实验2质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收
总时间：
1天。
预计开始时间：
8月30日
目的：
对含有目标蛋白基因的质粒进行酶切、电泳并回收。
一、材料、试剂及仪器
1）质粒（前面实验提取到的质粒）；
2）微量取液器（10μl、200μl、1000μl各一把）及对应的枪头盒；
3）限制性内切酶EcoRI或HindⅢ酶及其酶切缓冲液：
购买成品；
4）琼脂糖（Agarose）：
进口或国产的电泳用琼脂糖均可。
5）50×TAE电泳缓冲液：
（242gTris碱；57.1ml冰乙酸；100ml0.5mol/LEDTA,pH8.0）,使用浓度为1×TAE。
6）6×电泳载样缓冲液：
0.25％溴酚蓝，40％（w/v）蔗糖水溶液，贮存于4℃。
7）溴化乙锭（EB）溶液母液：
将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
1）小型台式高速离心机；
2）电泳仪及琼脂糖平板电泳装置；
3）高压蒸汽消毒器（灭菌锅）；
4）涡旋振荡器；
5）低温摇床
二、操作步骤
一）DNA酶切反应
1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管（1.5ml）编号，用微量移液枪分别加入质粒1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。
使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
反应体系组成（按说明书进行）：
10×Buffer5μL
HindIII1μL
Plasmid20μL
H2O24μL
2.混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温1-2小时，使酶切反应完全。
3.停止反应，置于冰箱中保存备用。
二、琼脂糖凝胶电泳
1.取50×TAE缓冲液4ml加水至200ml，配制成1×TAE稀释缓冲液，待用。
2.胶液的制备：
称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml1×TAE稀释缓冲液，轻轻摇匀，溶胀30min，放入微波炉里（或电炉上）加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
3.胶板的制备：
将有机玻璃胶槽放好，插上样品梳子。
将冷却至50-60℃的琼脂糖胶液小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀,速度也不可太快，否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶,将胶放入电泳槽。
4.加样：
取10μl酶解液与2μl6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。
若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
检测的样品至少包括：
Marker（同实验1）、提取得到的完整质粒、酶切后的质粒。
5.电泳：
加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
6.染色观察和拍照：
取出胶放入EB池中染色，30分钟后取出。
在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。
DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
7.回收条带，用回收试剂盒。
步骤参见试剂盒说明书。
保存好回收的酶切样品。
实验3连接质粒、感受态细胞的制备与转化
总时间：
1-2天。
预计开始时间：
8月31日
目的：
用前面的质粒转化处于感受态的细菌，获得重组子。
一、材料、设备及试剂
1）E.coliBL21/DE3菌株:
Amp-；
2）无菌eppendorf管。
3）质粒酶切片段:
自行制备的带限制性末端的DNA溶液，浓度已知；
4）宿主菌:
E.coliJM110等。
5）微量取液器（10μl、200μl、1000μl各一把）及对应的枪头盒；
6）LB液体培养基（Luria-Bertani）：
称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20分钟。
7）0.1mol/LCaCl2溶液：
称取0.56gCaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。
8）T4DNA连接酶（T4DNAligase）；连接反应缓冲液（5×）；购买成品。
9）氨苄青霉素：
50mg/ml的母液，过滤除菌后分成约1ml的小份，-20℃冻存备用。
10）含Amp的LB固体培养基：
将配好的LB固体培养基（LB液体培养基中每升加12g琼脂粉）高压灭菌后冷却至60℃左右（用手摸瓶不烫手），加入氨苄青霉素至终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板。
1）全温摇床（0-45℃）；
2）低温冰箱；
3）分光光度计；
4）琼脂糖凝胶电泳装置。
二、操作步骤一（感受态细菌的制备/购买）
一）受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E.coliBL21/DE3单菌落，接种于10mLLB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
将该菌悬液以2%的比例接种于20mLLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。
二）感受态细胞的制备（CaCl2法）
1.将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。
2.弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后，4℃下3000g离心10分钟。
3.弃去上清，加入6mL预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。
4.感受态细胞分装成200μL的小份，贮存于4℃备用。
三、操作步骤二（转化实验）
一）连接反应
1.取新的经灭菌处理的1.5mleppendorf管,编号。
2.体系组成：
共10μlBuffer1X
回收的DNA片段100ng
T4DNAligase1μL
去离子水
3.顺序：
去离子水、回收的DNA片段、回收的DNA片段、T4DNAligase。
4.混匀后用小离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24h或者4℃冰箱内过夜。
二）E.coli感受态细胞转化
1.从4℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，立即置冰上。
（80-200uL感受态细胞均可，试感受态细胞的状态而定）。
2.加入连接产物溶液（体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
3.42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4.向管中加入0.8mlLB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃低转速振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。
5.将上述菌液（可先经过离心，弃去部分上清液，使菌液变浓）摇匀后取200μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置5-10min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做二个对照：
对照组1：
（—）感受态细胞，仅仅涂布感受态细胞。
对照组2：
（+）原质粒，涂布转化后的细菌。
实验组：
自己连接的质粒并转化的细菌。
实验四细菌的大量培养及IPTG对重组蛋白的诱导表达
总时间：
1-2天。
预计开始时间：
9月1日。
目的：
对上述得到的转化子进行筛选、大规模培养并诱导目标蛋白产生。
一、材料、试剂及设备
1、可诱导表达目的蛋白的重组大肠杆菌BL21
2、30mL试管，2只；
3、200-250mL三角瓶，2只；
4、微量取液器（10μl、200μl、1000μl各一把）及对应的枪头盒；
5、胰蛋白胨（Tryptone）
6、酵母抽提物（Yeastextract）
7、异丙基硫代－β－D－半乳糖（IPTG）
8、氯化钠（NaCl）
1、超净工作台；
2、分光光度计；
3、全温摇床；
二、操作步骤
一）培养基配制
1.LB培养基
称取Tryptone1g，Yeastextract0.5g和NaCl1g，加入蒸馏水定容至100mL，1mol/LNaOH调节pH值至7.0，121℃高压灭菌20min。
于灭菌的LB液体培养基中，按终浓度50μg/mL加入Amp贮存液
2.100mmol/LIPTG贮存液
IPTG 0.238g溶于10mL双蒸水中，过滤除菌，分装，－20℃冻存备用。
二）种子培养液的准备和外源蛋白的诱导表达
1.取冻存的菌种，接种入装有5-10mlLB培养基的瓶中，37℃，200rpm/min过夜培养后接入100mlLB培养基，接种浓度为2%。
2.37℃，200rpm/min培养3小时后，将摇床温度调节到诱导温度20℃并平衡30min，然后加入IPTG至终浓度0.4mM，继续培养过夜。
实验五细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化
总时间：
1天。
预计开始时间：
9月2日
目的：
对上步培养得到的大量菌液进行收集、破碎、纯化目标蛋白
一、材料、设备及试剂
1、经诱导表达目的蛋白的大肠杆菌菌液；
2、Ni-NTA介质（Ni亲和介质）
3、MCAC－0缓冲液:
20mmol/LTris-HCl，pH8.0；
4、用MCAC－0缓冲液配制10mM、50mM、100mM、250mM咪唑。
5、层析柱（具胶管、夹子）；
6、微量取液器（1000μl一把）及对应的枪头盒；
7、铁架台及夹子；
8、100mL烧杯1个；
9、10mL离心管8个
1、高速低温离心机；
2、细胞超声破碎仪；
3、4℃/-20℃冰箱。
二、操作步骤
一）细菌破碎
1、将菌液转入大离心瓶中，离心收菌，4000rpm，10min；
2、倒掉上清，将菌体悬于10mL缓冲液中（用MCAC－0），超声破碎细菌；
3、将破菌产物离心，12000rpm，15min；
4、另对上清液留样（150uL），通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达情况和蛋白可溶情况。
二）目标蛋白纯化
1、处理介质：
向柱中加入0.5mLNiTA介质后，用5倍柱体积的去离子水洗涤介质；再用5倍柱体积的MCAC－0洗涤介质；以下步骤根据蛋白性质在4℃或16℃下进行操作；
2、加入蛋白样品：
加入超声破菌或高压破菌后的蛋白上清样品，反复加入4-5次，对穿过液留样检测，流速约0.2mL/min（下同）；
3、冲洗杂蛋白：
用5倍柱体积的10mM咪唑洗涤介质，保留洗脱液；
4、洗脱目标蛋白：
用50mM、100mM、250mM不同浓度的咪唑各5.0ml，梯度洗脱介质，回收流出液，保存于4℃，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
保存好上述样品，至少包括：
上样液（原液）、上样后的穿透液、10mM咪唑冲洗液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。
5、回收介质：
用5倍柱体积的20％乙醇洗涤介质，加入20％乙醇，封口，保存于4℃。
实验六 目标蛋白纯度的SDS-PAGE鉴定
总时间：
1-2天。
预计开始时间：
9月3日
目的：
用SDS-PAGE方法鉴定得到的目标蛋白。
一、材料、设备及试剂
1、样品：
上述MCAC-0~MCAC-250不同浓度洗脱的蛋白样品；
2、蛋白电泳marker；
3、微量取液器（200μl、1000μl各一把）及对应的枪头盒；
4、微量注射器；
5、12cm培养皿；
6、蛋白电泳所需的各种试剂：
1）丙稀酰胺和N,N`-亚甲双丙稀酰胺配制的29％（w/v）丙稀酰胺和1％（w/v）N,N`-亚甲双丙稀酰胺的贮存液，置于棕色瓶中贮存于室温。
小心：
丙稀酰胺和N,N`-亚甲双丙稀酰胺具有很强的神经毒性并容易被皮肤吸收。
2）10％十二烷基硫酸钠（SDS）贮存液。
3）浓缩胶缓冲液1MpH6.8的Tris缓冲液和分离胶缓冲液1.5MpH8.8的Tris缓冲液。
4）10%过硫酸铵（现用现配，配好的在4℃冰箱中可放置最长一周）。
5）TEMED（N,N,N`,N`-四甲基乙二胺）。
6）Tris-甘氨酸电泳
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