灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的阻碍.docx

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灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的阻碍

灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的阻碍

盛艳梅　孟宪丽　张艺　龙怡

【摘要】　　目的考察灯盏花素对体外高压诱导的视网膜神经节细胞（retinalganglioncells,RGCs）凋亡的阻碍，探讨灯盏细辛视神经爱惜作用的物质基础。

方式用胰酶消化法将20只诞生2～3d的SD（Sprague-Dawley）乳鼠视网膜制成细胞悬液，接种于经多聚鸟氨酸（HA）和层粘连蛋白（LN）包被的血盖片中。

培育72h后，将覆有细胞的血盖片转入加压装置中，加入灯盏花素溶液，继续培育24、48h，采纳Caspase-3蛋白免疫组化染色法及原位结尾脱氧核苷酸转移酶标记（Tunel-POD）法进行检测，天天观看细胞形态，同时对部份细胞行NSE染色检查。

结果细胞生长良好，NSE染色说明，85%以上的细胞为RGCs。

给药组的Caspase-3蛋白阳性表达指数和凋亡指数均明显低于模型组（P＜，Ｐ＜）。

结论灯盏花素能对抗压力诱导的RGCs凋亡，为灯盏细辛视神经爱惜的有效组分。

【关键词】灯盏花素；视网膜神经节细胞培育；高眼压模型；细胞凋亡

Abstract：

ObjectiveToinvestigatetheeffectsofBreviscapineonapoptosisofretinalganglioncellsbyhighintraocularpressureinvitroandexplorethesubstantialfoundationwithneuroprotectiveeffectsinglaucomaofTheretinalof20post-natal2-3daysSprague-Dawleyratsweredissociatedintocellsuspensionwithtrypsincellsuspensionwasimplatedin6-wellcultureplatescoveredwithhyaluronicacidandlamininineachculturingfor72hours，glasscoverwereputtedintothehighintraocularpressuredeviceandtheBreviscapinewereaddedtothedyeingvats,continuetoculture24/48theexpressionofCaspase-3proteinbytheimmuneohistochemistrymethodandapoptoticcellsweredetectedbyTUNEL-PODsomeofthe5-dayculturecellswereidentifiedbyNSEThecellsgrewverywell，over85percentofthelivingcellswereretinalganglioncellsbyNSEpositivemyocytesofCaspase-3proteinandtheapoptosisindexintheexperimentweresignificantlylowerthanthoseinthemodelgroup（P＜,Ｐ＜.ConclusionsBreviscapinecanprotectretinalganglioncellsagainstapoptosisbyhighintraocularpressure，Whichisthemainactivecomponentofwithneuroprotectiveeffects.

Keywords:

Breviscapine；retinalganglioncellsculture；highintraocularpressuremodel；apoptosis

视网膜神经节细胞凋亡（retinalganglioncells，RGCs）是视神经损伤的一起通路，目前尚缺乏避免RGCs的有效药物。

灯盏细辛［Erigeronbreviscapus（Vant.）Mazz.］要紧含有以灯盏花素为主的黄酮类、香豆素类等化合物［1］。

研究证明其有减少血管外周阻力，改善大脑微循环及抗血小板聚集的作用［2］。

随着对其药理作用的深切研究，其应用范围正在拓展。

实验发觉它在青光眼医治方面能够通过量种途径起到视神经爱惜作用［3～4］。

作者对胡竹林［5］、段永久［6］利用的培育瓶注气式加压装置加以改良,成立了加倍科学合理的体外高眼压模型。

并在考察了灯盏细辛多组分对常压下RGCs存活的基础上，用该模型进一步考察了其中灯盏花素对体外高压诱导的RGCs的阻碍，以明确其起视神经爱惜作用的物质基础，为开发研制理想的青光眼视神经爱惜剂提供参考。

1材料

实验动物

SD乳鼠（诞生2～3d内），♀♂兼用。

由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：

川实动管第11号。

药品及试剂

灯盏花素原料药，购于云南玉溪万方天然药物，批号：

040501；尼莫地平注射液·ml-1,德国拜耳公司，批准文号：

国药准字J；多聚鸟氨酸（Sigma公司，P-2533），层粘连蛋白（Roche公司，批号：

1243217），胰蛋白酶（Gibco公司，批号：

1118374），胎牛血清（Gibco公司，批号：

1216472），小牛血清（成都哈里生物，批号：

），DMEM高糖培育基（Sigma公司，批号：

1242226），5-溴-2′-脱氧脲苷（Brdu，武汉博士德，批号：

）。

要紧仪器

DMIL莱卡倒置相差显微镜，CO2孵箱（SANYOMCO-15AC），奥林巴斯体式显微镜等。

统计学方式

实验数据采纳单因素方差分析，应用SPSS统计软件进行处置。

2方式

培育板的处置

取6孔板，于每孔预先置入一血盖片（24mm×24mm），加入mg·ml-1多聚鸟氨酸1ml，振荡均匀，室温静置2h后，吸弃上清液，用适量PBS液洗涤三次，加入5μg·ml-1层粘连蛋白2ml，置37℃，5％的CO2孵箱中留宿，备用。

细胞悬液制备及接种培育

将乳鼠无菌条件下断颈处死摘取眼球，在体式显微镜下沿角膜剪开,钝性分离出视网膜组织。

用%的胰蛋白酶37℃下消化，30min后加入纯小牛血清终止消化，用无菌钢筛网滤过。

将滤液1000r·min-1离心5min，弃上清液。

加入完全培育液，吸管吹打使之制成单细胞悬液。

计数并调整细胞密度为1ml含5×106个细胞。

将细胞悬液按每孔1ml接种于经包被的6孔板中，培育24h后加入5-溴-2′-脱氧脲苷以抑制非神经细胞生长。

高眼压模型制作及药物的加入

培育72h后，将覆有细胞的血盖片嵌入到自制玻璃槽内，随机分成每槽6张，各槽内含不同受试药（灯盏花素、尼莫地平用无血清培育液配制）的完全培育液25ml，模型对照组加入等体积的培育液。

然后按自行设计的加压装置进行培育，使压力达到kPa。

另设正常对照组（压力为0），维持24h后作Caspase-3蛋白免疫组化检测，48h后进行凋亡检测。

形态学观看

应用倒置相差显微镜天天观看细胞形态及生长情形。

RGCs鉴定［7］

终止培育后，取两张覆有细胞的血盖片做抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组化染色检查。

Caspase-3蛋白免疫组化染色检测

采纳链霉素-生物素复合物（ABC）技术进行检测。

血盖片用90%乙醇固定10min，PBS洗三次，每次2min。

迈新S-P试剂盒（羊抗兔鼠）A清除非特异性物质阻断过氧化物酶活性，37℃孵育10min。

迈新S-P试剂盒B血清封锁，37℃孵育10min，沥去血清，滴加标记一抗Caspase-337℃孵育60min。

沥去PBS，加生物素标记二抗（IgG）迈新试剂C，37℃孵育10min。

沥去PBS，加链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液，迈新试剂D，37℃孵育10min。

沥去PBS，新配制的显色剂DAB，显色3～5min。

以上每步之间均用PBS漂洗三次，每次5min。

采纳阳性表达指数（高倍镜下，阳性细胞占同一视野细胞总数的百分比表示）作为阳性表达的定量指标，每张血盖片随机选5个阳性表达明显的视野，求其平均值。

原位结尾脱氧核苷酸转移酶标记法

采纳TUNEL-POD法进行检测。

血盖片用90%乙醇固定30min，风干。

通透处置用%TritonX-100,室温孵育10min。

PBS冲洗2次，搽干样品周围的水，滴加50μl的TUNEL反映混合液，湿盒中37℃孵育60min。

%H2O2：

甲醇液，室温孵育2min。

加入50μl转化剂-POD，湿盒中37℃孵育30min。

加入50μlDAB底物溶液，室温孵育10min致凋亡细胞棕黄色显现。

以上每步之间均用PBS漂洗三次，每次5min。

采纳凋亡指数（计算同阳性表达指数）作为细胞凋亡的定量指标。

3结果

形态学观看

视网膜神经细胞培育2～4h开始贴壁，24h后细胞呈圆形或椭圆形，部份细胞有聚集现象，多数细胞已经开始伸出短而小的突起，见图1。

加入5-溴-2′-脱氧脲苷后见少量细胞溶解坏死。

48h后细胞体积增大，突起伸长，且突起之间彼此连接成网状。

72h后细胞突起生长达到峰值，长度为胞体的数倍，见图2。

5d后细胞总数开始减少。

加压固定48h后模型组与正常对照组比较，可见细胞胞体缩小，核固缩，乃至显现空泡样改变，见图3、4。

RGCs鉴定

85%以上圆形细胞及其细长突起抗NSE染色阳性,可确以为RGC。

视网膜神经细胞中Caspase-3蛋白表达转变

显微镜下可见胞浆呈棕黄色的Caspase-3蛋白阳性表达细胞，其阳性细胞表达指数统计结果见表1。

结果说明,与模型对照组比较，灯盏花素与阳性药均能明显抑制视网膜神经节细胞中Caspase-3蛋白的表达（P＜,P＜）。

视网膜神经节细胞凋亡情形

显微镜下可见胞核被染成棕黄色的凋亡细胞，各实验组对视网膜神经节细胞凋亡指数的阻碍，见表2。

结果说明,与模型对照组比较，灯盏花素及阳性药均能明显对抗体外高压诱导的RGCs凋亡（P＜）。

表1各组对Caspase-3蛋白阳性表达指数的阻碍表2各组对视网膜神经节细胞凋亡指数的阻碍

4讨论

经常使用的实验性高眼压动物模型虽能较好的模拟青光眼高眼压环境，真实的反映压力对RGCs的阻碍，但无法对RGCs在压力作用下的生长情形进行全程观看。

而采纳RGCs体外加压培育的方式就能够够解决这些问题。

目前国内外经常使用的加压培育装置多为注液式加压，容易造成缺氧或增加污染机遇。

本实验采纳的自行设计的加压培育装置是在前人基础上加以改良而成的。

该装置加压操作方便、可行；在不需要同时监测几十个培育瓶，减少工作量的同时，还能够节约大量的培育及检测试剂，减少细胞用量，从而大大降低了实验本钱；同时能够监测压力，保证了更多的样本能够在相同环境下造模，尽可能减少了实验误差。

采纳该培育模型混合培育RGCs，不仅有利于视网膜神经节细胞生长，而且用它进行RGCs损伤研究，更接近于整体条件下的反映情形。

本实验在成立视网膜神经节细胞体外加压培育体系的基础上，考察了灯盏细辛对压力诱导的RGCs凋亡的阻碍，并明确了其起效成份。

其中灯盏花素原料药为含灯盏乙素达85%以上的粗提取物，实验中还发觉当灯盏花素浓度（）为灯盏细辛总黄酮浓度（10）的近八十分之一时仍呈现出相似的药理活性，说明分离有效成份能提高药效和减少用药量。

由于压力对体外培育的RGCs的阻碍还鲜有文献报导，尤其是关于药物对压力诱导细胞凋亡的爱惜更是罕有报导，将改良后的这种高眼压模型应用于细胞水平的药物挑选将具有重要意义。

【参考文献】

［1］张卫东，陈万生，王永红，等.灯盏花黄酮苷化学成份的研究［J］.中草药，2000，31（8）：

565－566.

［2］吕琳，金毅，朱宇明，等.灯盏细辛的研究进展［J］.中草药，1996，27卷增刊：

238－240.

［3］朱益华，蒋幼芹，刘忠浩，等.灯盏细辛注射液对鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的阻碍［J］.中华眼科杂志，2000；36（4）：

289－291.

［4］朱益华，蒋幼芹，刘忠浩，等.灯盏细辛对高眼压鼠视网膜神经节细胞超微结构的阻碍［J］.湖南中医杂志，2000；16（3）：

71－72.

［5］胡竹林，杜蜀华，胡正.压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞中Fas/FasLmRNA表达的阻碍［J］.眼科新进展，2002，22（6）：

380－384.

［6］段永久，原慧萍，王莉娜.压力对视网膜神经节细胞存活及突起生长阻碍的研究［J］.哈尔滨医科大学学报，2004，38

（1）：

33－36.

［7］杨瑞华，陈景元，邓中荣，等.猪视网膜神经节细胞的培育及超微结构［J］.第四军医大学学报，2001，22（12）：

1092－1094.