临床检验技师临床血液学检验讲义第二十章血栓与止血检验的基本方法.docx
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临床检验技师临床血液学检验讲义第二十章血栓与止血检验的基本方法
第二十章血栓与止血检验的基本方法
一、一期止血缺陷筛查试验
二、二期止血缺陷筛查试验
三、血管壁检验
四、血小板检验
五、凝血因子的检测
六、抗凝物质测定
七、病理性抗凝物检测
八、纤溶活性测定
九、血液流变学检测
一、一期止血缺陷筛查试验
1.出血时间（bleedingtime，BT）
（1）原理：
测定在皮肤受特定条件外伤后，出血自然停止所需的时间即为出血时间。
BT反映了毛细血管与血小板的相互作用，包括内皮下组织与血小板黏附（通过vWF的作用）、血小板
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的聚集和释放等反应，以及PGI2与TXA2的动态平衡。
（2）临床意义：
出血时间延长见于血小板减少症；先天性血小板功能异常，如血小板无力症、血小板
贮存池病；获得性血小板功能异常，如尿毒症、药物影响、异常蛋白血症、骨髓增生性疾病；血管性血友
病；遗传性血管周围结缔组织病如艾-唐综合征。
一般凝血因子缺乏出血时间不延长，但某些严重的因子缺乏（如因子Ⅹ和Ⅺ）及无纤维蛋白原血症可以延长。
出血时间缩短见于某些严重的高凝状态和血栓性疾病。
此外，出血时间还广泛用于外科手术前的出血筛选和抗血小板药物的监控，以免发生出血。
（3）注意事项：
试验前一周患者应停服阿司匹林、噻氯吡啶等抗血小板的药物。
2.束臂试验（tourniquettest或capillaryfragilitytest，CFT）
（1）原理：
通过前臂局部加压，使静脉血流受阻，给毛细血管以负荷，观察前臂皮肤一定范围内新出现的出血点数目，来估计血管壁的完整性及其脆性。
（2）临床意义：
新出血点的数目超过正常为阳性，见于：
①血管壁结构和（或）功能缺陷，如遗传性出血性毛细血管扩张症、过敏性紫癜、单纯性紫癜及其他
血管性紫癜。
②血小板的量和（或）质异常，如原发性和继发性血小板减少症、血小板增多症、先天性（遗传性）
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和获得性血小板功能缺陷症。
③血管性血友病（vWD）。
二、二期止血缺陷筛查试验
1.凝血酶原时间测定（prothrombintime，PT）
（1）原理：
在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶（人脑、兔脑、胎盘及肺组织等制品的浸出液）和钙离子，使凝血酶原变为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。
观察血浆凝固所需时间即凝血酶原时间。
该试验是反映外源凝血系统最常用的筛选试验。
（2）参考值及报告方式
①直接报告患者及正常对照的
PT秒数，参考值为
11～14s。
超过正常
3s为异常。
②凝血酶原时间比值（prothrombintimeratio
，PTR）=受检者PT（s）/正常对照PT（s）。
宜用多
份正常人血浆PT的几何均数，或其混合血浆的
PT，参考值为1±0.15。
③国际标准化比值（internationalnormalizedratio
ISI
，INR），INR=PTR。
ISI：
所用组织活酶的国际敏感度指数（
internationalsensitivityindex
，ISI）
ISI是所用组织凝血活酶与
ISI已知的国际参比品或经其标定过的参比品之间敏感度相比较的一个参
数。
测定方法是用多份不同凝血因子水平的血浆（包括正常人和口服抗凝剂患者），用参比品测得它们PT
的对数（logPT），再用待标定的组织凝血活酶测得它们的
logPT，以前者为纵坐标，后者为横坐标作图。
经回归求得直线斜率。
则待标定的组织凝血活酶的
ISI=已知ISI×斜率。
ISI
值越低，试剂对有关凝血因子
降低的敏感性越高。
（3）临床意义
①PT延长见于遗传性外源凝血系统的因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和纤维蛋白原减低
，但均很少见。
②肝脏疾病：
由于外源性凝血因子主要在肝脏合成，因而
肝脏疾病时，PT延长。
③维生素K缺乏症：
胆石症、胆道肿瘤、慢性肠炎、偏食、
2～7月龄的新生儿以及长期服用广谱抗生
素的患者等，由于维生素
K吸收或合成障碍，导致肝脏合成异常的凝血酶原、
FⅦ、FⅨ、FⅩ等分子，PT延
长。
④血液循环中抗凝物质增加，如肝素或
FDP增多等。
DIC和原发性纤溶时，由于
FDP生成增加，FDP有
较强的抗凝能力，故也使
PT延长。
⑤用于香豆素类等口服抗凝剂的监控，一般认为以维持
PT值在参考值的
2倍左右（1.3～2.5
倍）即
25～30s，或PTR为1.3～1.5（最大不超过
2），INR以2.0～3.0为宜。
⑥PT缩短见于口服避孕药、高凝状态和血栓性疾病等。
（4）注意事项：
①HCT影响：
不同患者
HCT不同，导致血浆量多少不一，因此游离的
2＋
Ca浓度不同，
从而导致PT结果异常。
对于HCT＜35%和＞55%的患者，采血量或抗凝剂用量按下述公式计算。
采血量（
ml）
=抗凝剂用量（ml）×9×（1-0.45）/（1-HCT）。
②血浆标本离心：
相对离心力1500×g、离心
10分钟制备乏血小板血浆，若血浆中富含有血小板，
PT
将假性缩短。
③溶血、脂血标本：
溶血时由于红细胞中有促凝成分，可使
PT假性缩短；脂血干扰某些仪器检测过程
中的浊度变化，因此会引起
PT检测结果的异常。
2.活化部分凝血活酶时间测定（activatedpartialthromboplastintime
，APTT）
（1）原理：
37℃条件下，以白陶土激活因子Ⅻ和Ⅺ，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第三因子
，
在Ca2＋参与下，观察乏血小板血浆凝固所需的时间，即为活化部分凝血活酶时间，
是内源凝血系统较敏感
和常用的筛选试验。
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（2）参考值
男性：
31.5～43.5s
女性：
32～43s
受检者的测定值超过正常对照10s以上有病理意义。
（3）临床意义
①对内源凝血途径因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ）缺乏较CT敏感（血小板异常不影响APTT），能检出Ⅷ：
C小于
25%的轻型血友病。
对凝血酶原、纤维蛋白原缺乏则不够敏感，故APTT延长的最常见疾病为血友病。
此时可进一步作纠正试验，即于患者血浆中加入1/4量的正常新鲜血浆、硫酸钡吸附血浆或正常血清
（试剂参见凝血酶原消耗试验的纠正试验），再检测APTT。
如正常血浆和吸附血浆能纠正延长的结果而血清不能纠正，则为因子Ⅷ缺乏；如吸附血浆不能纠正，
其余两者都能纠正，则为因子Ⅸ缺乏；如三者都不能纠正，则为病理性循环抗凝物质。
APTT及纠正试验结果判定
所含因子结果
因子Ⅷ因子Ⅸ被纠正不被纠正
正常新鲜血浆
√
√
因子Ⅷ或Ⅸ缺乏
正常血清
×
√
因子Ⅸ缺乏
病理性循环抗凝
正常BaSO4
√
×
因子Ⅷ缺乏
物质
吸附血浆
②在使用肝素治疗时，多用APTT监测药物用量，一般以维持结果为基础值的2倍左右（1.5～3.0倍）
为宜（75～100s）。
但应事先检测所用部分凝血活酶试剂是否对肝素敏感，即向正常人血浆中加入不同量
肝素（从每毫升0.1～1.0IU），看其APTT是否相应延长。
③血管性血友病：
由于患者vWF缺陷，使FⅧ不稳定，导致FⅧ：
C活性减低，故APTT延长。
不同类
型vWDFⅧ：
C活性降低不一样，故APTT延长的程度也不同。
④异常抗凝物增多：
血友病A患者长期输注FⅧ，可产生FⅧ抑制物，引起APTT延长。
一些患者存在狼疮抗凝物（LAC），使APTT延长。
⑤纤溶亢进：
原发性和继发性纤溶亢进（如DIC），产生大量的FDP，使APTT延长。
（4）注意事项：
同PT。
三、血管壁检验
1.血管性血友病因子检测（vWF）：
vWF是一种大分子蛋白多聚体，vWF的测定包括含量测定、功能分析，必要时还可进行基因诊断。
（1）原理
①vWF抗原测定：
可利用免疫电泳法、ELISA或胶乳凝集散射比浊法进行准确定量。
②vWF瑞斯托霉素辅因子活性检测：
在瑞斯托霉素存在的条件下，vWF通过与血小板膜GPⅠb-Ⅸ相互作
用使正常血小板发生凝集。
凝集的强度与被检血浆中vWF的含量和结构有关。
将正常人混合血浆作为100%
瑞斯托霉素辅因子，用缓冲液将其稀释成不同稀释度，加入瑞斯托霉素和新鲜洗涤过的或甲醛固定过的正常血小板悬液，血小板会出现不同强度的凝集。
根据正常血浆的稀释度及其相应的凝集反应，绘制标准曲线。
被检血浆的瑞斯托霉素辅因子活性可以从标准曲线中查到。
（2）临床意义
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①vWF减低：
主要用于vWD的诊断和分型。
②vWF增高：
vWF是一种急性时相反应蛋白，
很多情况下都增高，常见于血栓性疾病（如心肌梗死等）、
肾小球疾病、DM、妊高征及大手术后。
2.血浆6-酮-前列腺素F
（6-Keto-PGF
1α
）检测
1α
（1）原理：
ELISA法。
将抗原（6-酮-PGF1α-牛血清白蛋白连接物）包被酶标反应板，加入受检血浆或
6-酮-PGF1α标准品和一定量的抗
6-酮-PGF1α抗血清，作用一定时间后，再加入酶标记第二抗体，最后加入底
物显色。
标准品或受检血浆中的
6-酮-PGF1α与包被抗原竞争性地与抗体结合，抗体与包被抗原结合的量与
受检标准品或血浆中的
6-酮-PGF
量呈负相关。
根据标准曲线计算出受检血浆中
6-酮-PGF
α
的含量。
1α
1
（2）临床意义：
血浆6-酮-PGF1α减低：
见于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤转移、肾小球病变、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。
四、血小板检验
1.血小板生存时间（plateletsurvivaltime，PST）
（1）原理：
丙二醛（MDA）法或TXB2法：
由于阿司匹林能不可逆性地抑制血小板AA代谢过程中环氧
酶的活性，使其代谢产物MDA和TXB2生成减少。
与此同时，因新生血小板未受阿司匹林的抑制，故其MDA
和TXB2含量正常。
根据病人口服阿司匹林后，血小板MDA和TXB2生成量的恢复曲线可推算出血小板的生
存时间。
MDA含量可用荧光分光光度计法测定，TXB2可以用放射免疫法或酶联免疫法测定。
本试验可反映
血小板生成与破坏之间的平衡，但在血小板计数过低时本法的敏感性较差。
（2）临床意义：
血小板生存期缩短，见于：
①血小板破坏增多性疾病：
如原发性血小板减少性紫癜、同种和药物免疫性血小板减少性紫癜、脾功能亢进、系统性红斑狼疮；
②血小板消耗过多性疾病：
如DIC、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、溶血尿毒症综合征（HUS）；③血栓性疾病：
如心肌梗死、心绞痛、糖尿病伴血管病变、深静脉血栓形成、肺梗死、妊娠期高血压
疾病、恶性肿瘤。
2.血小板相关免疫球蛋白（plateletassociatedimmunoglobulin，PAIg）检测
（1）原理：
PAIg包括PAIgG、PAIgM、PAIgA和PAC3。
现以PAIgG检测为例。
ELISA法（双抗体夹心法）：
将抗人IgG抗体包被在酶标板反应孔内，加入被检血小板裂解液，若此液中存在PAIgG，便与包被的抗体结合，再加入酶标的抗人IgG抗体，与结合在板上的PAIgG结合，最后加入底物显色，其深浅与血小板裂解
液中的PAIgG成正比。
根据被检者所测得的吸光度，从标准曲线中计算出血小板裂解液中的PAIgG含量。
（2）临床意义
1）PAIg增高：
见于ITP，90%以上ITP患者的PAIgG增高，若同时测定PAIgM、PAIgA和PAC3，其灵敏
度可高达100%。
但其特异性较低，许多疾病如同种免疫性血小板减少性紫癜（多次输血、输血后紫癜）、药物免疫性血小板减少性紫癜、恶性淋巴瘤、慢性活动性肝炎、系统性红斑狼疮、慢性淋巴细胞性白血病、
多发性骨髓瘤、Evan综合征、良性单株丙球蛋白血症等也有不同程度的升高，因此，PAIg只能作为筛查指
标。
2）观察病情：
经治疗后，ITP患者的PAIg水平下降；复发后，则又可升高。
3.血小板聚集试验（plateletaggregationtest，PAgT）
（1）原理：
浊度法：
在富含血小板血浆（PRP）中加入致聚剂，血小板发生聚集，血浆浊度变化，透光度增加，血小板聚集仪将这种浊度变化转换为电信号并记录，形成血小板聚集曲线。
根据血小板聚集曲
线可了解血小板聚集的程度和速度。
电阻法（阻抗法）是根据电阻抗原理，通过放大、记录浸泡在全血样品中电极探针间的微小电流或阻抗的变化来测定全血样品血小板聚集性的方法。
近年来，出现了一种采用激光散射法进行血小板聚集检测的仪器。
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血小板聚集试验（透射比浊法）
血小板聚集曲线与血小板状态对应示意图
（2）临床意义
1）PAgT增高：
反映血小板聚集功能增强。
见于高凝状态和（或）血栓前状态和血栓性疾病，如心肌梗
死、心绞痛、糖尿病、脑血管病变、妊娠高血压综合征、静脉血栓形成、肺梗死、口服避孕药、晚期妊娠、高脂血症、抗原-抗体复合物反应、人工心脏和瓣膜移植术等。
2）PAgT减低：
反映血小板聚集功能减低。
①见于获得性血小板功能减低，如尿毒症、肝硬化、MDS、原发性血小板减少性紫癜、急性白血病、服用抗血小板药物、低（无）纤维蛋白原血症等。
②遗传性血小板功能缺陷，不同的血小板功能缺陷病对各种诱导剂的反应不同。
血小板无力症
（Glanzmann病）：
ADP、胶原和花生四烯酸诱导的血小板聚集减低和不聚集。
巨大血小板综合征：
ADP、
胶原和花生四烯酸诱导的血小板聚集正常，但瑞斯托霉素诱导的血小板不凝集。
贮存池病：
致密颗粒缺陷
时，ADP诱导的聚集常减低，无二相聚集；胶原和花生四烯酸诱导的血小板聚集正常；α颗粒缺陷时，血小
板凝集和聚集均正常。
血小板花生四烯酸代谢缺陷：
ADP诱导的聚集常减低，无二相聚集，胶原和花生四烯
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酸诱导的血小板聚集均低下。
（3）操作注意事项
1）采血顺利，避免反复穿刺将组织液抽到注射器内，或将气泡混入。
2）抗凝剂采用枸橼酸钠抗凝，不能以EDTA作为抗凝剂。
3）阿司匹林、潘生丁、肝素、华法林等药物均可抑制血小板聚集，故采血前一段时间不应服用此类药
物。
4）测定应在采血后3h内完成，时间过长会导致聚集强度和速度降低。
4.血小板释放反应产物测定
（1）原理：
β-血小板球蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）和血小板第四因子（plateletfactor4，
PF4）是血小板α颗粒中特有的蛋白。
当体内有过多的血小板被激活，释放反应亢进时，二者血浆中的浓度
升高，因此，β-TG和PF4是血小板活化的重要指标。
二者的检测多采用ELISA法。
（2）临床意义
1）增高：
反映血小板被激活及其释放反应亢进，见于血栓前状态和（或）血栓性疾病，如心肌梗死、
脑血管病变、尿毒症、妊高征、糖尿病、肾病综合征、弥散性血管内凝血、静脉血栓形成等。
2）减低：
见于先天性或获得性贮存池病（α颗粒缺陷症）。
（3）注意事项：
注意避免血小板体外被活化，否则导致假阳性。
另外，当肾脏排泄功能异常、血小板破坏过多时，血浆β-TG和PF4也可增高，因此，在评价其临床意义时应除外影响因素。
5.血块收缩试验（clotretractiontest，CRT）
（1）原理：
在富含血小板血浆中加入Ca2＋和凝血酶，使血浆凝固形成凝块，血小板收缩蛋白使血小板伸出伪足，伪足前端连接到纤维蛋白束上。
当伪足向心性收缩，使纤维蛋白网眼缩小，测定析出血清的体
积可反映血小板血块收缩能力。
（2）临床意义
1）减低：
见于原发性血小板减少性紫癜、血小板增多症、血小板无力症、红细胞增多症、低（无）纤
维蛋白原血症、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等。
2）增高：
见于先天性（遗传性）因子ⅩⅢ缺乏症等。
五、凝血因子的检测
1.血浆纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）含量测定
（1）原理：
FIB检测有凝血酶凝固法（Clauss法）、比浊法（PT衍生法）以及免疫学的方法等。
①Clauss法：
以凝血酶作用于待测血浆中的FIB，使其转变为纤维蛋白，血浆凝固。
血浆中FIB的含
量与凝固时间呈负相关，检测结果与参比血浆制成的标准曲线对比可得出纤维蛋白原的含量。
②PT衍生法：
当PT测定完成时，纤维蛋白原转变为纤维蛋白，其形成的浊度与FIB的含量成正比，因
此无需另加任何试剂，即可由产生的浊度，用终点法或速率法算出FIB含量。
③免疫学方法：
是利用抗FIB多克隆抗体与FIB特异性结合反应进行测定。
方法有免疫浊度、单向免疫扩散和ELISA等。
（2）临床意义：
增高见于糖尿病、急性心肌梗死、急性传染病、结缔组织病、急性肾炎、多发性骨髓瘤、休克、大手术后、妊高征、急性感染、恶性肿瘤和应急状态等。
降低见于先天性低或无FIB血症、遗传性FIB异常、弥散性血管内凝血（DIC）、原发性纤溶症、重症肝炎和肝硬化等。
（3）方法学评价：
Clauss法和PT衍生法：
测定的是纤维蛋白原的功能，由于FIB的异质性，当FDP
增高时，Clauss法测定结果会受到影响；免疫学方法测定的是纤维蛋白原的含量。
2.血浆因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ的促凝活性测定
（1）原理：
一期法是将待测血浆分别与乏FⅧ、FⅨ、FⅪ和FⅫ基质血浆混合，进行APTT测定。
将正
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常人混合血浆与乏因子血浆混合，测定APTT，作出标准曲线。
从各自的标准曲线中分别计算出受检血浆中
FⅧ：
C、FⅨ：
C、FⅪ：
C和FⅫ：
C相当于正常人的百分率（%）。
（2）临床意义
1）增高：
主要见于血栓前状态和血栓性疾病，如静脉血栓形成、肺栓塞、妊娠高血压疾病、晚期妊娠、
口服避孕药、肾病综合征、恶性肿瘤等。
2）减低：
FⅧ：
C减低见于血友病A、血管性血友病、血中存在因子Ⅷ抗体、DIC；
FⅨ：
C减低见于血友病B、肝脏病、维生素K缺乏症、DIC、口服抗凝药物；
FⅪ：
C减低见于因子Ⅺ缺乏症、肝脏疾病、DIC等；
FⅫ：
C减低见于先天性因子Ⅻ缺乏症、肝脏疾病、DIC和某些血栓性疾病等。
（3）注意事项
1）FⅧ：
C：
在严重肝实质损伤时，FⅧ：
C可明显升高。
FⅧ：
C减低时，需与vWF含量同时测定，以
筛选出vWF缺陷的可能。
2）目前认为，凝血因子促凝活性测定不必等待逐级筛选和纠正试验的结果，可以在单纯APTT延长时
检测。
3）受检标本检测凝固时间不在标准曲线范围可稀释后检测。
3.血浆因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ的促凝活性测定
（1）原理：
将待测血浆分别与缺乏FⅡ、FⅤ、FⅦ和FⅩ基质血浆混合，进行PT测定。
将正常人混合
血浆与乏因子血浆混合，测定PT，作出标准曲线。
从各自的标准曲线中分别计算出受检血浆中FⅡ：
C、F
Ⅴ：
C、FⅦ：
C和FⅩ：
C相当于正常人的百分率（%）。
（2）临床意义
1）增高：
见于血栓前状态和血栓性疾病。
2）减低：
见于维生素K缺乏症（FV除外）、肝脏疾病、DIC、口服抗凝剂和血中存在相应的抑制物。
先天性因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ缺乏症较罕见。
目前因子FⅡ：
C、FⅤ：
C、FⅦ：
C和FⅩ：
C的测定主要用于肝脏受损的检查，因子Ⅶ：
C在肝脏早期
可下降，因子Ⅴ的测定在肝损伤和肝移植中应用较多。
4.血浆因子ⅩⅢ定性试验
（1）原理：
在钙离子作用下，因子ⅩⅢ能使溶解于尿素溶液的可溶性纤维蛋白单体聚合物变为不溶性的纤维蛋白。
因此，含因子ⅩⅢ的血浆钙化凝固后不再溶于尿素溶液中，而缺乏ⅩⅢ的血浆聚合物则可溶
于5mol/L尿素溶液中。
（2）临床意义：
本试验简单、可靠，是十分有用的过筛试验。
在临床上若发现伤口愈合缓慢、
渗血不断或怀疑有因子ⅩⅢ缺陷者，可首选本试验。
若纤维蛋白在
24h
内，尤其是2h内完全溶解，表示因子ⅩⅢ缺乏，见于先天性因子ⅩⅢ缺乏或获得性因子ⅩⅢ缺乏，后者见
于肝脏疾病、SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤、转移性肝癌、
DIC及原发性纤溶等。
5.血浆因子ⅩⅢ亚基抗原测定
（1）原理：
凝血因子ⅩⅢ由两个亚基α和β构成。
检测方法为免疫火箭电泳法：
在含有FⅩⅢα亚基
和β亚基抗血清的琼脂凝胶板中，加入受检血浆（抗原），在电场作用下，出现抗原-抗体反应形成的火箭
样沉淀峰，此峰的高度与受检血浆中FⅩⅢ亚基的浓度成正比。
根据沉淀峰的高度，从标准曲线中计算出F
ⅩⅢα：
Ag和FⅩⅢβ：
Ag相当于正常人的百分率（%）。
（2）临床意义：
同上。
六、抗凝物质测定
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1.抗凝血酶Ⅲ（antithrombinⅢactivity，AT-Ⅲ：
A）测定
（1）血浆抗凝血酶Ⅲ活性测定
原理：
发色底物法：
受检血浆中加入过量凝血酶，使AT-Ⅲ与凝血酶形成1:
1复合物，剩余的凝血酶作
用于发色底物S-2238，释出显色基因对硝基苯胺（PNA），显色的深浅与剩余凝血酶呈正相关，而与AT-Ⅲ
呈负相关。
根据标准曲线计算出AT：
A的含量。
（2）血浆抗凝血酶Ⅲ抗原（AT：
Ag）检测
1）原理：
免疫学方法如火箭电泳法、免疫酶标及免疫比浊法。
2）临床意义
①增高见于血友病、白血病和再生障碍性贫血等的急性出血期以及口服抗凝药物治疗过程中。
②减低见于先天性和获得性AT-Ⅲ缺乏症，后者见
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