分 子 生 物 学实验报告.docx

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分子生物学实验报告

分子生物学

实

验

报

告

2011级生物科学师范

组长：

组员：

从甘薯中克隆ADK基因的核心片段

（西南大学生命科学学院，重庆400715）

摘要：

甘薯为我国农业主要栽培作物，并且是分子生物学实验室常见材料，本次实验主要以甘薯叶片（部分为茎）为实验材料，第一次实验从材料中提取RNA并反转录cDNA第一链，经PCR扩增得到大量ADK基因核心片段，电泳检测胶回收ADK基因核心片段，将其与T载体相连并导入大肠杆菌DH5感受态细胞中，扩增之后在加有相应抗生素的LB平板上筛选阳性克隆，这对后续生物信息学分析等有重要意义。

第二次实验是用CTAB法提取甘薯DNA，PCR扩增再凝胶电泳检测纯度。

（提取DNA也能扩增出ADK基因核心片段）

关键词：

甘薯、PCR技术、腺苷酸激酶片段（ADK）、基因克隆、转化

Abstract:

Sweetpotatoformyagriculturalmaincultivationcrop,andismolecularbiologylaboratorycommonmaterial,thistimesexperimentmaintosweetpotatoleaves（partforstems）forexperimentmaterial,firsttimesexperimentfrommaterialintheextractionRNAandreverserecordedcDNAfirstchain,byPCRspreadincreasedgetlargeADKgenecorefragments,electrophoresisdetectionrubberrecyclingADKgenecorefragments,willitsandtcarrierconnectedandimportEscherichiacoliDH5（feelStatecellinthe,spreadincreasedinplushascorrespondingantibioticsofLBTabletShangfilterpositivecloneThisimportancetosubsequentbioinformaticsanalysis.ThesecondexperimentwasextractedbyCTABmethodDNA,PCRamplificationandgelelectrophoresisandpurityofsweetpotato.（ExtractionofcorefragmentofDNAcanbeamplifiedADKgene）

keywords:

sweetpotato;PCRtechnologies;AdenylateKinaseGene（adk）;geneclone;transformation

1.综述

1.1甘薯

甘薯（Ipomoeabatatas（L.）Lam.）属旋花科（Convolvulaceae）甘薯属（（Ipomoea）蔓生一年生草本植物，染色体数为2n=6x=90。

其又名山芋、红芋、番薯、红薯、白薯、地瓜、红苕等，因地区不同而有不同的名称，经济价值较高可食用也可入药。

世界甘薯主要产区分布在北纬40°以南。

栽培面积以亚洲最多，非洲次之，美洲居第3位。

1994年世界甘薯总面积为938万公顷，总产量为12433.9万吨。

甘薯是我国的主要栽培作物，常年种植面积6×106hm2左右,栽培面积和总产量均居世界首位，它所富含的淀粉是重要的轻化工和食品加工原料。

选育推广优良品种是农业增产的重要措施，因此，在农业科技工作中，选育和推广优良品种始终处于重要地位，“渝苏303”是西南师范大学在育成“渝苏1号”、“渝薯34”、“渝薯20”之后，于1991年从江苏省农科院提供的杂交种籽中选育而成的又一个甘薯新品种，原系号“91一31一303”，该品种（系）1994—1995年参加四川省甘薯新品种区域试验，1997年5月、1998年1月和1999年4月分别通过四川省、重庆市、江苏省农作物品种审定委员会审定，1998年该品种在重庆、四川、江西、江苏、贵州、河南等省市的种植面积在1×104hm2以上。

经过较长较深时间的研究，甘薯应经成为西南大学生命科学学院分子生物学实验室的常用材料，从分子生物学角度对其进行基因水平上的实验研究对于提高甘薯的质量和产量都有重大意义。

1.2ADK基因

腺苷酸激酶（EC.2.7.4.3,adenylatekinase,ADK）是生物体内普遍存在的一种单体酶，广泛存在于生命有机体中（如微生物、植物和动物体内）。

腺苷酸激酶（ADK）催化ATP和AMP合成两分子ADP的可逆反应，是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配的关键酶。

其表达量直接影响腺苷酸在糖类代谢库和核酸代谢库中的分配。

生物信息学分析表明,在淀粉合成水平最高的植物中,腺苷酸激酶的分子进化水平和遗传相似性也最高，因此,作为腺苷酸代谢库调节中枢的ADK基因（adk）是淀粉代谢工程的重要候选基因,将该基因表达量控制在较低水平就可打破腺苷酸代谢库的平衡,使腺苷酸代谢流向淀粉合成的方向流动。

用基因工程技术获得的含有ADK基因工程菌菌株可用于遗传转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物,为实现淀粉代谢工程奠定了基础。

IbADK全长1314bp，其编码区长度为855bp，编码长度为284个氨基酸残基的ADK蛋白（IbADK）；生物信息学预测IbADK分子量为30.86kDa，等电点为6.46。

1.3研究目的和意义

本次试验就是利用从甘薯“渝苏303”中提取ADK目的基因，通过连接制备重组DNA，然后导入到大肠杆菌细胞中，通过筛选检测目的基因是否转化成功。

本次实验涉及甘薯总RNA的提取，反转录成cDNA第一链过程，PCR扩增目的基因及检测，目的基因回收与连接，大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备，连接产物的转化筛选和PCR检测，以及选做实验植物DNA的提取及检测。

原理上根据目的基因的制备，重组DNA分子的构建，重组DNA分子转移到受体细胞，转化子的筛选，和目的基因表达与功能的鉴定的操作步骤，从分子层面直观的告诉我们了基因工程技术中的操作方法和实现手段。

腺苷酸激酶（ADK）在维持细胞能量平衡中起着重要作用,也就对农作物的产量的提升具有很大的重要作用，不仅是在农作物光合作用的效率的提升上，也在像甘薯这样积累淀粉的农作物的生产量的提高上面具有很大的作用。

弄清楚了甘薯中的ADK基因的序列，对于有征对性的提高甘薯的产量具有直接的关系。

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1实验材料：

甘薯叶片

2.1.2实验工具

PCR扩增仪，电泳仪，恒温培养箱1台，恒温水浴锅，THZ-C水平摇床2台，离心机1台，超净工作台1台，移液枪1套，锥形瓶3×10个，室内使用的大中型枪头各1盒，两面板（蓝板）1个，室内使用的1.5mL的EP管1套。

涂布器1根，凝胶成像系统1台，一次性PE手套，研钵﹑杵、药勺1套。

2.1.3实验试剂

裂解液RZ，氯仿，无水乙醇，蛋白液RD，漂洗液RW，loadingbuffer，SuperPuredNTPS,RNase-FreeddH2O,buffer,RNasin,TIANScriptM-MLV,MiniQH2O,10×PCRbuffer,MgCl2,dNTPmix,引物1，引物2，Taq,琼脂糖，TAE,GoldView，β-巯基乙醇，平衡液BL，PN,缓冲液EB,PMD-19Vector，InsertDNA,SolutionⅠ，CATB,液氮，异丙醇，乙醇，CaCl2，LB液体培养基，Amp抗生素，IB固体培养基

2.2方法

2.2.1植物RNA的提取及检测及反转录

植物RNA的提取实验方法参见总RNA提取试剂盒说明书。

反转录过程如下：

1.在离心管中加入2ulRNA，2ul引物，2ulSuperPureDntps,8.5ulRNase-FreeddH2O

2.70℃水浴加热5分钟后，冰上冷却2分钟，再进行简短离心

3.加入4ulBuffer，0.5ulRNasin

4.加1ulTIANScriptM-MLV,轻轻用移液器混匀

注意事项如下：

1.第一次离心过后，吸取上清液400ul另一离心管中，呈淡粉色。

2.共经过7次离心，均为常温离心，每次离心后加入的试剂不同，需细心。

3.简短离心的步骤与正常离心不同，控制时间

2.2.2PCR扩增adk基因核心片段

（1）在2个50ul的PCR反应管中依次加入如下组分:

PCR反应体系：

1）MiniQH2O39.5μl

2）10×PCRbuffer（含Mg离子）5μl

3）10mMdNTPmix1μl

4）引物1（10μM）F-ADK1μl

5）引物2（10μM）R-ADK1μl

6）Taq（2to5units/ul）0.5μl

7）模板（DNA）2μl

总体积50.0μl

（2）短暂离心混匀各组分后，将PCR反应管放入PCR仪。

PCR反应的程序如下:

Ⅰ）94℃4min

Ⅱ）94℃45s；56℃45s；72℃1min（33个循环）

Ⅲ）72℃8min

Ⅳ）4℃保存

（3）将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果。

2.2.3胶回收adk基因片段和连接T载体及大肠杆菌的培养

1）胶回收adk基因片段

按照提供的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒—-离心柱型中所述的方法对已检测并可使用的adk基因片段进行回收

1.柱平衡步骤：

向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL,12000rpm（～13400×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，因为凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul，以此类推。

50℃水浴放置10分钟，期间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4.将上一步所得溶液加入另一个吸附柱CA2中室温放置2分钟，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

5.向吸附柱CA2中加入700ul漂洗液PW，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

6.向吸附柱CA2中加入500ul漂洗液PW，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液。

7.将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm（～13400×g）离心2分钟，尽量出去漂洗液。

将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干。

8.将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液EB，水浴37℃2分钟。

12000rpm（～13400×g）离心2分钟收集DNA溶液。

2）连接T载体

1.在200ulEP管中加入下列组分：

PMD-19TVector0.5ul

InsertDNA4.5ul

SolutionⅠ5ul

2.轻轻混匀，16℃连接30分钟

3）大肠杆菌摇床培养

部分同学在老师指导下已完成

2.2.4DNA的提取及大肠杆菌感受态细胞的制备

1）DNA的提取

1、向10ml离心管中预先加入4mlCTAB抽提液及相应量的β-巯基乙醇（2%-3%），65℃预热；

2、取适量的植物甘薯嫩叶用液氮充分磨成粉末，转入该10ml离心管中，迅速混匀。

3、于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）颠倒混匀三次或四次；

4、冷至室温后加入等体积（4ml）氯仿，轻柔颠倒混匀使乳化10min；

5、10000转／分离心10min（18-20℃）；

6、吸取上清3-4ml于另一干净的10ml离心管中；

7、吸取上清加入与上清液等体积且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现；

8、用玻璃钩子挑出DNA，放入盛有1ml75%乙醇的1.5mlEppendorf管中

9、用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇；

10、用1ml75%乙醇再漂洗一次；

11、用无水乙醇再漂洗一次；

12、沉淀于室温或60℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；

13、用500μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，得DNA粗提物。

14、取10μlDNA电泳检查DNA的质量；

2）大肠杆菌感受态细胞的制备

1.将1ml过夜培养菌液移入50mlLB培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.6

2.取培养液3ml转入10ml无菌离心管中，于4℃4000r／min离心10min，去上清

3.沉淀用3ml预冷的0.1MCaCl2悬浮，与冰上放置30分钟；

4.4℃，4000r／min离心10min，去上清；

5.沉淀用600μl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞

6.分装3管，每管200μl，冰上放置30分钟

2.2.5连接产物的转化、筛选及PCR检测

1.将10μlDNA的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30分种；

2.42℃水浴中热激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上2min，室温下放置3-5min；

3.加入800l37℃预热的LB液体培养基，混匀后37℃180rpm培养0.5h

4.4000rpm离心10min，去800l上清液，将剩余的200l菌液混匀；

5.用烧烤过的涂布棒将100l的菌液涂布于加相应抗生素的LB固体培养基涂匀，共2个

6.置于37℃恒温箱中培养

2.2.6连接产物的筛选及PCR检测

1.选取平板上合适菌落，标记备用（共4个）

2.用10μl移液器枪头对准所选菌落刮取，置于装有1ml溶液的EP管中

3.将EP管进行摇床培养

4，PCR检测

3.实验结果与分析

3.1甘薯RNA的提取及检测+反转录

图1-2总RNA的电泳图（末）

图1-1总RNA的电泳图（初）

结果分析：

RNA极易被RNA酶降解，而RNA酶在自然界中广泛而丰富的存在，因此要取得本次实验的成功关键之处在于严格防止RNA酶的污染。

此外，为了达到更佳的效果，实验选用的材料是甘薯嫩叶，因为其RNA含量丰富，但实验中能否研磨充分，也会对实验结果造成影响。

从RNA电泳的结果来看，我们组在该次实验中较好地做到了这两点，因此获得的条带不仅区分度好，亮度也高。

在实验中共进行了两次紫外检测，首次检测是在预期时间后，但发现RNA条带跑的不是很开（如图1-1），分析原因是配制琼脂糖凝胶时胶浓度比期望浓度大，致使RNA迁移速率减慢，因而电泳时间相对延长。

由于在电场中核酸分子的迁移速率取决于分子量大小和空间构型，沉降系数大的RNA跑得慢，故从上到下的条带分别代表28S、18S、5.8S（如图1-2）。

从电泳获得的28S和18S两条主带的亮度来看，28S和18SRNA比值约为2:

1，符合一般真核细胞RNA比值。

3.2PCR扩增adk基因核心片段

图2PCR扩增adk基因的电泳图

结果分析：

上次实验中，我们对获得的甘薯RNA进行了反转录，获得cDNA。

本次实验利用上次实验获得的cDNA进行PCR，所用的10×PCRbuffer、taq是北京普博欣公司生产，而引物1、引物2系华大公司生产（1、2组），其他四组用其他公司生产的试剂盒。

从扩增结果来看，效果均不错（1-4组扩增的是adk基因，5、6组扩增的是adk核心片段，故结果有所差异）。

通过与Marker跑出的条带对比，扩增的目的基因在1000~750bp之间（Marker各条带从上到下分别表示2000、1000、750、500、250、100，后面3个不太明显）。

本次实验每个组共做了2个50μL反应体系，但待加完所有试剂后，很多体系的体积明显不同，分析原因可能是在操作过程中使用移液枪出现问题，或是移液枪本身有误差。

3.3目的基因片段的回收、连接

上次实验我们扩增到了甘薯adk目的基因，并进行了电泳，得到了单一目的DNA条带，本次实验将该目的DNA条带切下，进行胶回收和T载体连接。

实验进行顺利。

根据时间安排，本次连接过夜，是连接更加完全。

3.4DNA的提取、大肠杆菌感受态细胞的制备、连接产物的转化

3.4.1DNA的提取

图4-1提取DNA结果图

图4-2提取DNA的电泳图

结果分析：

本次提取DNA使用的材料仍是甘薯，所用植物材料的量和研磨是否充分是影响获得DNA量多少的两个主要方面，与其他组相比，我们组提取的DNA量比较充足（如图4-1所示）。

将此DNA沉淀溶解后进行琼脂糖凝胶电泳，得到3条清晰可区分的带，从上向下依次代表蛋白质等大分子杂质、DNA、RNA（如图4-2所示），较其他组而言，我们组DNA条带亮度高，说明提取的DNA量多。

RNA分带不明显，说明有部分降解，但未被降解完全。

3.5连接产物的筛选及PCR检测

图5-2PCR菌检图

图5-1连接转化后的E.Coli平板

结果分析：

我们组的两个加了氨苄抗生素的LB培养基上共长出了4个大肠杆菌菌落（分给了2组一个），这几个菌落形状都比较规则，判断是由一个大肠杆菌长成，由于它们能够在加了氨苄抗生素的培养基上长出，说明它们具有氨苄抗性，说明有T载体导入，但无法确认该T载体上是否有我们所需的adk目的基因，还需进一步菌检。

由PCR菌检结果可知（如图5-2），该3个菌落虽都是转化子，但3号菌落菌检无条带，说明3号菌落是假阳性的，而1、2号菌落则是我们所要得到的菌落。

整个分子实验取得成功。

取得这样的结果，有一部分运气在里面，但全组成员在此过程中的严谨操作也是必不可少的重要因素。

分子生物学实验感想

四天的分子实验结束了，时间看似漫长，却也如此短暂，回首这四天的实验经历，有辛苦，有疲惫，但也不乏成就感和喜悦感，在老师的指导下，和同学们一起完成实验，这样的过程总是那样美好，让人留恋，当然，实验过程中收获到的心得体会对于我来说最为宝贵。

作为我们一组的记录员，说实话，工作有些辛苦，但是我觉得很快乐，这份工作很适合我，也正是我喜欢与擅长的方面。

从实验当初的迷茫，到实验最后的娴熟，我也不得不佩服自己的耐心与细心，这是我以前没有发现的优点，希望以后可以得以施展和加强巩固。

由于做记录员，工作比较繁杂，所以实验中我只做些简单的操作，比如离心、计时等，但对于整个实验流程我还是比较了解的，这也是记录员的好处吧！

在这方面我的收获还是蛮大的，至少懂得实验过程是马虎不得的，有一步失误，就可能导致整个实验的失败。

我们组在整个实验过程中都很顺利，包括后面对菌的培养，长出了四组明显菌落，并且发现了2个阳性转化子，这种结果是我们期待的，同样也是我们没有想到的，心里别提有多开心了，感觉这四天的努力没有白费，一切辛苦都是值得的。

以上所说的都是我在实验中的体会，接下来我想说的是实验过后我的感想，这些感想比实验中那些匆匆的心情增加了许多反思与积淀。

给我留下最深印象的应该是周四那天晚上，也就是实验结束，曾老师在讲台上给我们讲了一些事情的那堂晚课，记得当时实验结果还没出来，曾老师给我们讲实验报告该怎么书写，其中提到了实验结果的问题，曾老师说“实验失败了并不可怕，这很正常，不要被这件事影响了心情”，之后又举了很多他经历的实验失败，告诉我们要学会总结和反思，说实话，有那么一大段时间我都是眼含泪花地听着他讲话，不时地笑一下回应，心里很温暖，他真的是个好老师，懂得怎么教育学生，很多老师都会采用批评的口吻总结课堂，那样的方式我们早就厌倦了，而他却用不同的方式告诉了我们真理，这让我很感动，也很崇拜，即使失败，老师也还在关照着我们的内心，那份感谢不知怎样用语言来表达，我想我会永远地记得他的教育方式，来教育我的学生，用那份宽容来对待我身边的人。

曾老师让我们对他提一些建议，我只想提一点：

希望您继续温暖可爱的孩子们，用您一直宽容的心对待您的学生们！

实验过程中，有老师帮助，同学的团结，有工具、药剂的陪伴，我感到很幸福，很充实，认真对待每一件事，每一个人，正确看待自己，定位未来的道路，相信明天会更好。

分子生物学实验感想

本次实验我们做了RNA的抽提与检测、RNA逆转录获取cDNA及检测、PCR扩增目的的基因及检测、目的基因片段的回收与连接、大肠杆菌感受态细胞的制备、连接产物的转化和筛选及PCR的检测及DNA的抽提与检测。

此次为期大概四天，实验中小组成员都想积极参与，但由于实验不需要太多人动手，部分人不得不只配和其他组员完成任务。

本次实验成功不仅仅是小组成员间的合作成果，也是全班各小组共同合作的成果。

充分体现了实验需要团队合作。

我们充分利用时间自觉完成实验，相对而言效率较高，实验结果较为成功。

经过四天的实验，我们把DNA,RNA的提取，PCR扩增目的基因，电泳，胶回收目的片段，连接—T载体，转化大肠杆菌，阳性克隆筛选，PCR鉴定连起来做，感觉能把整个实验串联起来，更有利于实验知识的学习，这几天实验做下来心里很踏实，老师要求写的实验报告很特殊，我们小组合作的方式完成实验报告，对实验知识有进一步的加深。

思路得到了开阔。

实验过程中，我们把看不见的DNA提取出来了，也得到了PCR等的实验结果。

在理论中很难理解的东西，实验后理解起来更容易了。

经过曾令江老师的指导，实验中反复操作后，我们对实验仪器使用技术提高了。

此次分子生物学实验采取集中时间按技术路线流程完成，不仅节约时间，更是让我们更深入的熟悉理解技术操作原理。

相比于其他科目的实验，每周进行一小部分实验操作，没有很好地连接起来，分子生物学实验更利于我们记忆，效率明显的有大部分提高。

再加上曾老师的悉心指导及包容，帮助我们从失败的结果中得出的经验及教训，改正错误。

从老师身上我们也学到了细心，耐心，坚持不懈的实验精神。

这次试验老师才是最辛苦的人。

　实验中我们收获了很多，不但获得了实验的相关知识，让我们近距离更直观的理解了课本上的理论知识，也让我们加强了实验的操作技能，更加注意实验的相关事项。

实验中要十分严谨并且要积极观察相关现象。

另外，有点小遗憾就是实验中人数太多了，器材不够，很多同学没有真正的参与到实验的具体操作中来。

　　最后，感谢曾令江老师对本次实验悉心指导与帮助。

————古丽克孜·吐热克

分子生物学实验总结与体会

从5月12日开始到5月15日持续四天没有严格作息时间的分子生物学实验，也是大学里最后的一门实验课结束了，反而有一点失落，不再整天那么忙碌，不习惯了。

实验中同学们都和积极，每节课都能全勤，并且参与实验，这一门实验课是我大三学年上的最实在的实验课，跟有的实验是不一样的，老师全程陪同、指导，有一个基本思路，技术路线，使得实验不再那么茫然，不会给一堆新鲜的实验仪器，PPTl浏览一遍然后就把实验室扔给我们，最后只要交实验报告就行了。

在本次实验中，我体会到了

1、实验以人为本，科研都是为人服务的，虽然科研工作者都要有为科研献身的精神，但还是要在实验中采取措施保护工作者，以免去不必要的人身损失，就比如在用液氮里研磨甘薯叶片，操作者都要用棉手套和一