猪的CDKN1C和NAP1L4基因印迹分析.docx

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猪的CDKN1C和NAP1L4基因印迹分析

猪的CDKN1C和NAP1L4基因的描述、组织表达和印迹分析

人类CDKN1C/KCNQ1OT1印记域中的CDKN1C和NAP1L4基因是与贝-韦综合征和癌症有关的两个关键的候补基因。

为了增进对猪中的这两种基因的了解，本文将对它的cDNAs进行分析。

通过IMpRH模板，猪的CDKN1C和NAP1L4基因被分配给猪的2号染色体，分别与IMpRH06175在15.78和17.94的检测限下有紧密联系。

采用荣昌猪和长白猪相互杂交的F1代，通过实时定量rt-pcr和polymorphism-based方法对两个基因的组织和等位基因表达进行测定。

尽管猪的CDKN1C和NAP1L4基因在1月龄猪的肺和肾脏中显示出最高的表达水平（P<0.01），但是两者在胎盘组织中的转录水平显著高于其他新生组织。

印迹分析表明，CDKN1C在新生仔猪的心脏、舌、膀胱、卵巢、脾脏、肝脏、骨骼肌、胃、小肠和胎盘等组织中呈母系表达，在新生仔猪的肺和肾脏中呈双等位基因表达，而NAP1L4被验证在上述12种新生组织中呈双等位基因表达。

总的说来，CDKN1C印迹在哺乳动物中保守存在但在新生猪组织中具有组织特异性，而NAP1L4印迹在哺乳动物中存在争议。

1.前言

基因印迹，由于体细胞的表观遗传调控，其中某些基因的单等位基因表达取决于亲本的源性，它对哺乳动物新生胎儿的生长发育，胎盘的功能以及产后的行为至关重要。

很多研究已经表明，基因组印迹的中断与先天性疾病、癌症以及其他种类的疾病例如贝-维综合征和普拉德-威利综合征等有关[1-4]。

目前，在小鼠的基因组中估计有大约2114种转录印迹和600种潜在的印迹基因[5,6]，其中有大约116种印迹基因已经被发现，但是只有几种印迹基因在猪中被发现。

因此，有必要在猪中找寻出更多的印迹基因，从而提供新的数据和观点给猪的功能基因组学和比较基因组学研究。

很多印迹基因在基因组的集合和基因顺序以及在每个印迹域中的印迹显示出老鼠和人类之间的相当大的相似性[7,8]。

据报道，CDKN1C和KCNQ1OT1存在于人类11p15.5和老鼠7号染色体末端的一个印迹集群中。

在这个区域的基因包括OSBPL5,CARS,NAP1L4,PHLDA2,SLC22A18,SLC22A18AS,CDKN1C,KCNQ1DN,KCNQ1OT1,KCNQ1,TSSC4,CD81和ASCL2[8]。

CDKN1C/KCNQ1OT1域的印迹中断与贝-维综合征和癌症的发生有关[8]。

CDKN1C（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂）和NAP1L4（核小体组装蛋白1，4）是2个在人和老鼠印迹集群中特别有意义的基因。

CDKN1C，也被称作p57Kip2，编码一个属于CIP/KIP家族的编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI），是一个假定的肿瘤抑制基因[9,10]。

CDKN1C基因突变已经在大约5–20%的贝-维综合征患者中得到确认[11,12]，小鼠母体CDKN1C继承的缺失表现出一定的BWS的特点[13]，而在散发性肿瘤、胚胎性肿瘤患病个体中CDKN1C的基因突变非常罕见[14-18]。

NAP1L4，也称为NAP-2,编码一个和NAPs具有同源性的蛋白质，通过从细胞质运送组蛋白到染色质装配机构参与基因表达的调控[19]。

NAP1L4与抑制胎儿的生长发育，造成胎儿死亡的过程有关[20]。

这些结果表明，CDKN1C和NAP1L4是两个重要的与BWS和癌症发生有关的基因[8]。

目前，有很多关于CDKN1C和NAP1L4在人和老鼠中的印迹状态的报道。

CDKN1C是从母体等位基因表达，而NAP1L4除了在老鼠的胎盘母系表达外，在其他所有组织中均为双等位基因表达[21]。

在猪中，CDKN1C是母系表达预期[22]。

尽管取得了一些进展，但猪CDKN1C、NAP1L4的相关数据仍然有限。

因此，将在这篇文章中对猪CDKN1C、NAP1L4在组织中的表达模式和印迹状态进行研究。

这项研究将有助于提高对猪CDKN1C、NAP1L4功能重要性的认识。

2.材料和方法

2.1组织样品和cDNA的准备

用8头长白猪和8头中国本土品种的荣昌猪进行正反杂交（每个品种各4头公猪和4头母猪）。

这些公猪和母猪，必须没有共同的祖父母。

从23头上述杂交后的F1代猪中提取组织，组织包括心脏，胃，骨骼肌，肾脏，肺，肝，小肠，膀胱，舌，脾脏，脂肪，卵巢和胎盘。

23头F1代猪包括10头出生24小时的新生崽猪（5头来自3对不同父母的LD×RC，另5头来自3对不同父母的RC×LD）以及7头来自4对不同父母的LD×RC的F1代1月龄仔猪和6头来自4对不同父母的RC×LD的F1代1月龄仔猪。

亲本猪的耳组织中提取基因组DNA，基因分型的CDKN1C和NAP1L4也要收集，组织样本被存储在−80℃直到使用。

采用Trizol试剂（Invitrogen公司，圣迭戈，美国）从冰冻组织提取总DNA，然后用DNaseⅠ（Takara公司，日本）进行复苏。

然后使用AMV逆转录酶XL（Takara公司，日本）和寡核苷酸（DT）引物进行反转录，分别在40℃下进行50min和在70℃下进行15min。

有逆转录酶和没有逆转录酶的反应物分别作为阳性和阴性样品，以便进行基因克隆和印迹分析。

2.2CDKN1C和NAP1L4的分子克隆

人类CDKN1C（NM000076）和NAP1L4（NM005969）基因的cDNA序列被用来通过BLASTN程序在猪的EST数据库中搜索可用的表达序列标签。

同源序列，在至少100bp中大于80℅的信息相匹配，被组装成ESTs重叠群用于引物设计。

引物对CDF1／R1用于CDKN1C，引物对NAF1/R1用于NAP1L4（表1）.为了获取两种基因的全长cDNA，根据供应商的指示分别用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒（Clontech公司，美国）和RNALAPCR试剂盒（Takara公司，日本）进行5′和3′RACE。

通过5′RACE，序列特异性引物5′CDGSP1和5′CDGSP2（嵌套）被设计成CDKN1C，而5′NAGSP1和5′NAGSP2（嵌套）被设计成NAP1L4。

通过3′RACE，序列特异性引物3′NAGSP1and3′NAGSP2（嵌套）被设计成NAP1L4。

热循环条件下的PCR反应的初始条件是先在94℃变性5min，其次是35个周期的94℃变性30s，53–60℃退火30s（表1），72℃延伸30s，最后再在72℃反应10min.然后在商业服务机构（Invitrogen公司，上海，中国）进行PCR产物测序。

2.3辐射杂交（RH）映射

为了获取RH映射需要的内含子序列，先对猪CDKN1C和NAP1L4与人类相应基因（NM000076,NM005969）进行对齐。

根据共识序列，引物INF1/R1和INF2/R2（表1）被设计成CDKN1C内含子2和NAP1L4内含子3。

基于上述内含子的引物对MF1/R1和MF2/R2（表1）被用来进行猪辐射杂种板（IMpRH）的PCR分型，该引物对由INRA（法国）提供[23]。

PCR在10μL的总量重复进行，包含25ng的IMpRHDNA样品，0.3μM的各种引物，75μM的各种dNTP，1.5μMMgCl2以及1UTaqDNA聚合酶（Takara公司，日本）。

PCR反应条件为先在94℃变性3min，其次是35个周期的94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后再在72℃反应7min.此外，PCR进行有猪基因组DNA（作为阳性对照）和没有DNA（作为阴性对照）的反应。

可以访问http:

//rhdev.toulouse.inra.fr/查看通过IMpRH映射工具进行的PCR结果的统计分析。

两点和多点RH分析来识别LOD值为5的连锁群。

2.4杂合猪的识别和印迹分析

经长白猪和荣昌猪cDNA序列比对搜寻猪CDKN1C和NAP1L4上的SNPs。

使用23个F1个体基因组DNA对每个基因进行单核苷酸多态性基因分型。

分别用引物对IJF1/R1,IJF2/R2（表1）对CDKN1C和NAP1L4的PCR产物进行直接测序来检测SNPs。

通过样品杂合子的总DNA的RT-PCR对每一个基因的等位基因的表达模式进行SNPs分析。

PCR产物通过上述引物进行双向测序。

为了消除在PCR的基因组DNA污染的可能性，引物β-actinf/R在猪β肌动蛋白基础上被设计生成猪β肌动蛋白的内含子3。

2.5实时定量PCR

在Bio-RadiQ5机器（美国）上用SYBRPremixExTaqII试剂盒进行实时PCR。

引物QF1/R1,QF2/R2和QF3/R3分别用来扩增一个136,128,165bp的CDKN1C，NAP1L4和RPL32（核糖体蛋白L32）的cDNA。

熔解曲线分析（60–95℃）是用来评估扩增的特异性。

用primescript反转录酶和寡聚酶（dT）（Takara公司，日本）对从各组织样本中提取出的总RNA进行反转录。

25μL总量下进行3重反应，反应的25μL总量包括12.5μLSYBRPremixExTaqII（TaKaRa,日本）,0.4μM的引物和2.5μL模板cDNA。

用表达数据分析的标准曲线推断出cDNA样品池中的单个基因。

内源性调控基因RPL32被使用，其在在我们公布的数据[24]表现出稳定的表达。

利用2−ΔΔctmethod确定各基因的相对表达。

为了验证组织与年龄之间的表达差异是否有显著性。

3.结果

3.1猪CDKN1C和NAP1L4的序列分析和定位

在引物CDF1/R1以及5′RACE（GenBank登录号hq679903）的PCR产物测序后，全长cDNA生成的116bp被用来组装猪的CDKN1C。

序列分析表明该基因含有一个786bp（从HQ679903的nt162到nt947）的开放阅读框（ORF），编码一种261个氨基酸的蛋白质。

ORF与人类序列（NM_000076）有79％的氨基酸序列相同和85％的核苷酸序列相同。

NAP1L4的全长cDNA是2655bp（hq679902），包括470bp5′-UTR、1024bp3′-UTR和1161bpORF，编码386个氨基酸。

猪NAP1L4利用一个位于hq6799022617的位置的多聚腺苷酸化位点（ATTAAA）。

ORF与人类序列（NM_005969）有94％的氨基酸序列相同和86％的核苷酸序列相同。

在人类和小鼠，CDKN1C和NAP1L4基因是紧密相连的[8]。

采用IMpRH面板[23]测定猪CDKN1C、NAP1L4染色体定位。

两点分析，野猪染色体2（SSC2）上的CDKN1C（LOD15.78，距离0.15cr，保留频率16%）和NAP1L4（LOD17.94，距离0.11cr，保留频率19%）都和IMpRH06175紧密相连。

多点分析表明，CDKN1C与311840215（上标记，距离0.34cr）和IMpRH06175（下标记，距离0.14cr）有联系，而NAP1L4与311840215（上标记，距离0.36cr）和IMpRH06175（下标记，距离0.10cr）有联系。

3.2CDKN1C的表达和印迹

从5个新生儿和7个1月龄的LD×RC的杂交种的组织中提取的总RNAs，采用相对实时定量PCR分析对猪CDKN1C表达模式进行测定。

对于每个年龄，组织的RNA被作为一个生物学重复。

新生猪胎盘中，CDKN1CmRNA水平很高（P＜0.01），而在其他组织中是非常低的，它们之间没有差异（图1（a））。

在一个月大的猪，最高的表达水平在肺和肾中观察到（P＜0.01），其次是骨骼肌和心脏（P＜0.01）。

更少的CDKN1C转录在脾，舌，膀胱，胃，肝，脂肪，和小肠中（P＜0.01）。

有趣的是，猪CDKN1C转录水平在肺和骨骼肌中上升，在舌，膀胱，小肠下降（P＜0.01），但出生后在其他组织中无明显差异。

对比荣昌和长白序列显示一个SNP（A/G）在CDKN1C916位置（hq679903）。

由于没有提供任何可用的RFLP多态性位点，RT-PCR产物直接测序被用于表达基因的辨别。

PCR产物的测序显示，RC×LD的3个新生猪和4个LD×RC新生猪发生杂合子SNP，而它们的父母分别是等位基因A和G纯合子。

RC×LD的F1代猪仅表达长白猪的G等位基因，LD×RC的F1代猪只是在胎盘以及在舌，膀胱，卵巢，肝，脾，骨骼肌，胃，小肠中表达荣昌猪的等位基因A（图2（a））。

然而，猪CDKN1C的等位基因的表达在肺和

肾脏检测到（图2（a））。

3.3NAP1L4的表达和印迹

NAP1L4在猪组织中广泛表达，在新生儿猪，表达水平显著高于胎盘（P＜0.01），其次是肺和骨骼肌（P＜0.05）,更少NAP1L4的转录发生在脾，舌，膀胱，卵巢，肝，胃和小肠（P＜0.05）（图1（b））。

相反，在一个月的年龄段，最高水平的表达发生在肺，心，肾（P＜0.01），最低的表达发生在脾，舌（P＜0.01）。

与新生儿组织相比，猪NAP1L4表达水平在心脏和肾脏中上升，在骨骼肌中下调（P＜0.01），但在其他组织中没有显著的可见的的变化。

在荣昌猪和长白猪的NAP1L42461位置之间检测到一个T/CSNP（HQ679902）。

共有5个RC×LDF1猪的DNA样本和4个LD×RCF1猪的DNA样品呈杂合多态性，而他们的父母长白猪和荣昌猪分别是C/C和T/T纯合子。

RT-PCR产物直接测序证实了NAP1L4在新生猪的肺，心脏，肾脏，膀胱，卵巢，舌，脾，肝，骨骼肌，胃，小肠，和脾中双等位基因转录。

在图2（b）中说明了猪NAP1L4在骨骼肌中的双等位基因表达。

4.讨论

在这项研究中，第一次在猪中对CDKN1C、NAP1L4基因克隆及其染色体定位，表达模式，和印迹进行了进一步的分析。

由于这两个品种杂交F1代有利于检测印迹基因[25]，故我们利用荣昌和长白品种进行等位基因的表达分析。

序列分析表明，猪CDKN1C、NAP1L4分别与人类的氨基酸和核酸有很高的同源性，在SSC2上两个基因都与IMpRH06175和311840215之间区域紧密联系，与小鼠7号染色体末端和人类11p15.5同线[8]。

这些结果表明这两个基因在哺乳动物中是保守的。

CDKN1C是一种有效的几种G1cyclin/CDK复合物的抑制剂，其过度表达导致细胞周期阻滞在G1期[26，27]。

在组织中，CDKN1C的生物学功能和分布已被广泛研究。

研究表明，在人类和小鼠中，CDKN1C在胎盘最高表达，在其他组织中低水平表达，而在成人的心脏，肺，骨骼肌，脑，肾和胰腺中表达[28，29]。

最近，shuklaeal。

[30]揭示，CDKN1CmRNA水平在胎儿宫内生长受限（IUGR胎盘改变）和酒精暴露与对照组相比改变；因此，它们被选为胎儿宫内发育迟缓、胎儿酒精暴露的生物标志物。

小鼠CDKN1C基基因突变的结果是在小鼠胎盘[31]迷宫区大血栓性病变的出现。

我们的研究表明，CDKN1C基因mRNA在猪新生儿胎盘丰度最高，而在1月龄的猪的肺和肾脏检测到其高水平表达。

一般来说，猪CDKN1C的表达模式与人类和小鼠的基因密切相关，而CDKN1C在猪胎盘中高水平表达说明其在猪胎盘生长和发育中的重要作用。

NAP1L4已被发现大部分定位于细胞质，较少部分存在于细胞核中，调节核小体的形成[32]。

Huetal.[33]发现NAP1L4广泛表达，在睾丸组织中呈现出三倍更高水平的的表达相比在其他组织。

有趣的是，我们的研究还表明，NAP1L4猪组织中广泛表达，但检测到NAP1L4在新生儿胎盘中比在其他组织中表达水平高。

NAP1L4介导血管生成，其在红色羽毛台湾土鸡高产高蛋亚群中比在产蛋低亚群显著高表达。

这些研究表明，NAP1L4有助于促进动物繁殖性能和可能在胎盘功能上发挥作用。

现在有一些关于CDKN1C、NAP1L4印迹的报道。

CDKN1C在人和小鼠中呈母系表达[8]。

小鼠NAP1L4在胎盘父系抑制，在其他胚胎组织[21]双等位基因表达，而经Higashimoto等人测试发现人类NAP1L4双等位基因表达可在所有组织和年龄段检测到[8]。

在这项研究中，猪NAP1L4就像人类一样，在猪所有组织中检测到双等位表达。

此外，我们的数据表明，猪CDKN1C在心脏，舌头，膀胱，卵巢，脾脏，肝脏，骨骼肌，胃，小肠和胎盘母系表达，与以前的数据一致，符合CDKN1C在孤雌生殖比在双性生殖表达更高[22]。

猪CDKN1C在肺和肾脏中双等位基因表达，这与人类在同一组织中的单等位基因表达存在差异。

这是因为印迹的程度往往由于不同的表观遗传修饰导致组织物种特异性而不同[35]。

在人类和小鼠中，已被证明CDKN1C印迹受到源自母系表达KCNQ1基因内含子10的KCNQ1OT1反转录控制。

一个位于KCNQ1OT1启动子的cpgisland，简称KvDMR1或KCNQ1基因印记控制区（ICR），父系等位基因未甲基化，母系等位基因甲基化，有利于表达源自从导致沉默的邻近基因包括CDKN1C传播的父系的等位基因的KCNQ1OT1的表达。

而KCNQ1ICR尚未在猪中特征存在，其基因顺序和基因在人类，小鼠，鸡和tammar之间的高度保守的集群结构[37]。

这一信息支持的假设，不同的表观遗传修饰的KCNQ1ICR或其他机制不影响KCNQ1OT1在猪肺和肾脏中的转录。

5.总结

本文对猪NAP1L4的全长cDNA和包含5′-UTR和ORF的猪CDKN1C进行了分析。

猪CDKN1C、NAP1L4映射到SSC2，且都与IMpRH06175紧密相连。

Bischoff等人的结果确认，印迹分析表明，NAP1L4在组织测试呈双等位基因表达，而CDKN1C在组织中除猪肺和肾脏外呈母系表达。

这项研究发现了猪中一个新的印迹域,为猪CDKN1C、NAP1L4功能的重要性的进一步调查提供的数据。

附录：

表1

表1：

猪CDKN1C和NAP1L4基因的引物序列和引物信息

图1：

图1（a）,图1（b）

图1：

猪CDKN1C（a）和NAP1L4（b）的组织表达。

表达式值采用RPL32规范化，表示为平均值（mean）±标准误（SE）.Sp:

spleen脾;Lu:

lung肺;H:

heart心;K:

kidney肾;T:

tongue舌;B:

bladder膀胱;O:

ovary卵巢;Li:

liver肝;Sm:

skeletalmuscle骨骼肌;St:

stomach胃;Si:

smallintestine小肠;P:

placenta胎盘;F:

fat脂肪。

ABC-column表示0日龄柱形体上标不同字母表示不同的显著性，p＜0.05（小写）和P＜0.01（大写）。

∗∗P＜0.01。

图2：

图2（a）,图2（b）

图2：

0日龄猪CDKN1C（a）和（b）NAP1L4的母系表达或双等位基因表达。

RC:

Rongchangpigs荣昌猪,LD:

Landracepigs长白猪,P:

placenta胎盘,L:

lung肺,K:

kidney肾,Sm:

skeletalmuscle骨骼肌。

箭头指示的是SNP位点。

备注：

本文作者、致谢及参考文献已略去（见外文原文）。

武汉轻工大学

毕业设计外文文文献翻译

姓名：

张浩然

学号：

100703120

专业：

动物生物技术

院系：

动科学院

指导教师：

郭玲

WuhanPolytechnicUniversity