抗氧化剂抗氧化活性的测定方法.docx
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抗氧化剂抗氧化活性的测定方法
1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。
被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。
2.初始型抗氧化剂（AH）可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。
L.+AH---LH+A.
LOO.+AH---LOOH+A.
LO.+AH---LOH+A.
抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。
LOO.+A.---LOOA
LO.+A.---LOA
次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。
抗氧化剂的活性分为在生物体外（如食品中）的活性和在生物体内的活性。
本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法,不包括在生物体中测定生物活性的方法。
3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力
实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂;在指定浓度下比较不同测试材料（如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系）对底物的作用。
评价或表征抗氧化活性的方法有:
（1）在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值;
（2）测量反应的速率;
（3）测量诱导期（延滞期）或氧化达到一定程度所需的时间;
（4）测量速度的积分（即动力学曲线下的面积）;
（5）测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。
4.参数
4.1诱导期（inductionperiod）
诱导期tIND（也叫延滞期,lagperiod）常定义为化学反应的速度。
诱导期是一个相当不确定的值,受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。
对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。
4.2抑制率（percentageofinhibition）和IC50
抑制率和IC50（抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度,也可用EC50表示的）常用来表征抗氧化能力。
它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关,而且受其他因素的影响,如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。
此外,用IC50表征抗氧化剂
的活性与比较活性的时间点有关。
只有在其他参数相同的情况下,在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。
TEC50是指抗氧化剂提供50%抑制作用所需的时间,也常用来表征抗氧化活性
5.对测定方法的要求
测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要
求:
（1）能说明测试体系中发生的反应,并能用明确的动力学图解描述;
（2）测试要有再现性;
（3）测试效率要足够高;
（4）方法要相对简单;
（5）能连续检测;
（6）应使用与体内或食品有关的活性自由基;
（7）分析中被测物的浓度在食品中或在生物体内能够得到;
（8）除了适合纯溶液外,还适合复杂生物组织和天然产物的测定;
（9）水溶性的和脂溶性的化合物都适用。
6.测定抗氧化活性的方法
大多数方法涉及到直接或间接测量:
（1）底物或标记底物或氧消耗的衰减,
（2）氧化产物的生成,（3）特征自由基的形成或衰减的速度或程度。
在
（1）和
（2）中,抗氧化活性是以对反应物的消耗或生成物的形成的程度或速率来表征抗氧化活性的;（3）是假设通过捕获脂质自动氧化中的自由基抑制氧化的,因此集中在检测被测抗氧化剂对自由基的捕获或抑制自由基的形成的能力上,而不是检测实际发生的氧化反应,如ABTS法和DPPH法。
6.1以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的方法
脂质中的不饱和脂肪酸自动氧化,生成不稳定的氢过氧化物,氢过氧化物继续分解形成短碳链的醛、酮、酸等小分子化合物。
抗氧化剂的加入可以延缓氢过氧化物及其分解产物的形成,由此可测得抗氧化活性。
由于氧化的底物、引发或加速氧化的方法以及脂质氧化检测方法的不同,该法又可分为以下几种情况。
6.1.1氧化的底物或使用的体系
以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的测量抗氧化活性的方法经常使用。
常使用纯的甘油三酸酯、植物油（红花油、葵花油、大豆油、橄榄油等）、鱼油或猪油作为氧化反应的底物,也使用磷脂或脂蛋白作为底物。
为了得到重复性的结果,选择底物时应优先考虑单一的物质,如亚油酸或亚油酸甲酯
底物中含有的抗氧化剂（如植物油中常含有VE）也能参与测试过程,干扰测定。
但是实际测定中常使用植物油等脂质混合物,因为它们是与真实食品有关的脂质成分。
实际操作中应根据具体的测试方法选择合适的底物和测试体系。
6.1.2引发或加速氧化的方法
各种加速氧化的方法,如烘箱法、活性氧法、Rancimat法、OSI法。
这些方法是通过升温或增加氧浓度加速氧化的。
自由基引发剂加速脂质氧化,常用热不稳定的偶氮化合物作为引发剂,最典型的是水溶性的AAPH和脂溶性的AMVN。
除此之外,还有水溶性的ABAP、ABIP和脂溶性的ADVN、AIBN等,也有用DBHN的
上述偶氮化合物在适当的温度下能以需要的速度分解,生成活性自由基。
由于温度容易改变和保持,因此引发速率容易控制。
上述引发剂的优点是自由基的生成速度与引发剂的浓度成比例,与测试体系中的其他成分无关
但是,用自由基引发剂加速反应时抗氧化剂的抗氧化能力主要体现在供氢的速度上,没有考虑抗氧化剂自身生成的自由基的作用,而有些抗氧化剂被氧化后的产物也能参与抑制作用,对抗氧化活性有一定影响。
在食品体系和生物体系中还普遍使用过渡金属或过渡金属的氧化还原反应引发氧化,如Fe2+和Cu2+、Fe3+/抗坏血酸等。
但是这些体系中的一些成分（如抗坏血酸）能与自由基反应,干扰测定结果。
而且使用含有过渡金属的体系不能将不同于初始型抗氧化剂的抑制机理（如螯合作用）区别开。
也有用光照或紫外光来加速氧化的,但是光引发脂质氧化可能引起氧化机理的改变,因此这种方法不常用。
6.1.3脂质氧化的检测
在化学方法中,过氧化值、碘值、游离脂肪酸的含量（酸值）、TBARS法、羰基化合物、克雷斯试验和茴香胺值已被广泛采用。
至于物理方法,如粘度、颜色、共轭二烯含量、红外光谱、折光指数、介电常数和气相色谱法、液相色谱法、气相色谱和质谱联用等已用于油脂氧化的测定。
此外,不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率（C18:
2/C16:
0）、聚合物的含量、极性脂类的
含量也可用于检测脂质的氧化程度。
除上述方法外,测量体系中氧的减少造成压力变化的氧压法,测量氧消耗的氧电极法,测量底物中不饱和脂肪酸的减少以及氧化后底物的增重等方法也常用于检测脂质的氧化。
6.1.3.1脂质氧化初期产物的检测
（1）过氧化值（peroxidevalue,PV）法。
过氧化值是测量脂质氧化最常用的方法,反映了脂质和含脂原料中氢过氧化物和脂质过氧化物的总含量。
测量PV的方法有很多,但其原理均系碘化氢还原
此法是根据脂质氧化生成的氢过氧化物ROOH和过氧化物ROOR能将碘离子氧化成碘分子进行测定的,原理如下:
ROOH+2H++2I----I2+ROH+H2O
ROOR+2H++2I----I2+2ROH
I2+2S2O3---S4O62-+2I2
此法灵敏度低,选择性差。
碘化氢易被氧化,还极易与碳碳双键加成,而且生成的碘也能与不饱和双键加成,使测得的结果偏低。
此外,样品的量、溶剂、反应条件（如时间、温度）和滴定速度的不同都会造成误差。
（2）共轭二烯氢过氧化物法。
共轭二烯作为测量脂质氧化的一种简单的方法和有用的指标已普遍用于样品抗氧化活性的测定。
共轭二烯的量可通过在某一时间的吸光值计算。
此法适合纯脂质体系中脂质氧化的研究。
由于组织样品和生物体液含有许多在紫外光区有强吸收的物质（如血红蛋白、叶绿素、嘌呤和嘧啶等）干扰测定,所以一般不能直接测量其共轭二烯。
这可以通过在分析前用有机溶剂将脂质提取出来加以解决。
脂质中的脂肪酸在紫外区也有吸收,对测定结果也有一定的影响。
此外,共轭二烯不稳定,在生成的同时也会分解,因此共轭二烯的量反映的只是氧化早期阶段脂质氧化的程度。
该法不适合测量饱和脂肪酸含量高的油,如棕榈油。
（3）硫氰酸铁（ferricthiocyanatemethod,FTC）法。
此法是根据脂质氧化产生的过氧化物将Fe2+氧化成Fe3+,Fe3+与硫氰酸铵反应,生成的硫氰酸铁在500nm处有强吸收,通过500nm吸光度的变化可测得过氧化物的含量。
6.1.3.2脂质氧化终产物的检测
脂质氧化初期产物不稳定,可分解生成醛（如己醛）、酮（如丁酮、戊酮、辛酮）、酸和烃类等小分子物质,这些氧化的终产物也用于脂质氧化的检测,
TBARS法是目前使用最普遍的方法。
但是脂质氧化形成的丙二醛并不多,绝大多数与TBA结合的丙二醛是在酸性条件加热时由过氧化物分解生成的。
而且TBA还可以和氧化的蛋白质,核酸等反应生成和TBA-丙二醛反应物类似的红色物质,532~535nm处的吸收包括了这些物质的贡献。
用荧光法可以避免这一点。
测量前,用HPLC分离产物也可以减少误差。
脂质氧化终产物中还含有戊烷、己烷、己醛等烃类气体,这些气体可以用气相色谱检测。
通过某一小分子气体的量的变化,可反映脂质氧化程度,通常以己醛为检测指标。
该法准确,重复性好。
测量脂质氧化的方法很多,以过氧化值、共轭二烯、TBARS法和顶空气相色谱法最为常用
6.2清除自由基的方法
6.2.1ABTS法
ABTS（波长max=342nm）可被K2S2O8、MnO2、ABAP和H2O2等各种试剂氧化,生成蓝绿色的自由基阳离子ABTS.+。
ABTS.+相当稳定,在414、645、734和805nm处有最大吸收峰。
在有供氢能力的抗氧化剂（如酚类物质）存在下,ABTS.+与之反应,变成没有颜色的ABTS。
抗氧化剂清除ABTS.+的能力可用414或734nm处吸光度的变化测量。
测得的结果以TEAC（当量抗氧化能力）表示,即被测抗氧化剂清除ABTS.+的能力（吸光度大小的变
化）与标准抗氧化剂trolox（VE的水溶性类似物）清除ABTS.+的能力的比值。
trolox的TEAC值是1。
Miller等人提出的ABTS法中,ABTS.+是由ABTS与铁肌红蛋白自由基（ferrylmyoglobin）反应生成的,而铁肌红蛋白自由基由高铁肌红蛋白（metamyoglobin）和H2O2反应生成。
在这种方法中,被测物是在H2O2引发生成ABTS.+前加入的,抗氧化剂也能和铁肌红蛋白自由基反应,造成TEAC值
被高估。
根据ABTS.+的生成方法和参比抗氧化剂的不同,提出了几种改进的ABTS法,在这些方法中ABTS.+都是在添加被测试样前生成的,避免了干扰
ABTS法广泛用于评价抗氧化剂清除自由基的能力。
此法快速简单,可用于常规测定。
但对于同一物质,测得的TEAC值往往不同,
造成TEAC值不同的主要原因有:
生成ABTS.+的方法、被测物的浓度、反应持续的时间、测试体系的pH值和测试所用波长不同。
ABTS测试所
需时间一般为5~6min,有些抗氧化剂在使用的时间内没有完全与ABTS.+反应,造成TEAC值被低估。
此外,有些化合物清除ABTS.+后的产物也能与ABTS.+反应,测得的TEAC值是被测化合物与反应产物的TEAC值的和
在测定化合物抗氧化能力时,相当高抗氧化能力的产物的生成是个缺陷。
ABTS.+在与氢原子供体的反应中选择性差是此法的又一个不足,它可与任何羟基化的芳香族化合物反应,这与它们实际抗氧化能力无关,TEAC值也包括对抗氧化不起作用的羟基。
6.2.2DMPD.+法
在酸性条件下,DMPD可被ABAP、FeCl3、CuCl2、H2O2氧化,生成稳定的DMPD.+,它在505nm处有最大吸收峰。
根据加入抗氧化剂后吸光度的变化可测得样品清除自由基的能力。
Fogliano等人用FeCl3与DMPD反应测定葡萄酒的抗氧化活性。
DMPD只溶于水,不能用于疏水性抗氧化剂的测定。
6.2.3DPPH法
DPPH法又可分为动力学法和静力学法
动力学法测的是添加完含有供氢能力的样品后DPPH.减弱的速率,表征的是被测物的反应性,即反应的快慢,一般用DPPH.减弱的起始速率表示;
静力学法测的是被测样品清除DPPH.的量,或DPPH.与某一供氢体反应的化学计量关系或复杂混合物中活性.OH的量,常以IC50表示。
与ABTS法类似,被测物清除DPPH.的产物也能与DPPH.作用,影响测定结果
SanchezMoreno等人把上述2种方法结合在一起,以抗氧化效率AE（antioxidantefficiency）表示,AE用参数1/EC50t50计算（t50是达到50%变化时需要的时间）。
DeBeer等人提出类似的参数:
自由基清除效率RSE（radicalscavengingefficiency）,RSE由DPPH.减弱的起始速率与EC50的比率计算。
AE和RSE随试剂浓度的变化而改变,因此重复性差。
Bandoniene和Mukovic将DPPH法与HPLC结合起来用于检测苹果的抗氧化活性。
此法与HPLC法一样,在某一实验中只能检测出一部分酚类物质（基本上是相对低分子量的）,不适合测定聚合酚类含量高的物质,如红葡萄酒、红茶、咖啡和可可等。
ABTS.+和DPPH.是测定抗氧化活性使用最广的2种人工生成的自由基,但是它们对抗氧化剂的响应以及它们的操作也有几个重要的不同:
（1）DPPH.不需制备可直接得到,而ABTS.+必须由酶或化学反应生成。
（2）ABTS.+可溶于水,也可溶于有机溶剂,所以既可测量水溶性化合物也可测量脂溶性化合物。
而DPPH.只能溶于有机溶剂,特别是乙醇,不溶于水,在评价水溶性抗氧化剂的作用时,这是一个很大的局限。
（3）在与供氢体的反应上,DPPH.比ABTS.+的选择性强。
例如,DPPH.不能与只含有一个.OH的芳香酸反应,也不能与B-环上没有-OH的类黄酮反应。
而ABTS.+可与任何羟基化的芳香族化合物反应。
6.2.4Fremy自由基和galvinoxyl还原法
根据稳定的Fremy自由基（五硫化二钾）溶于水,合成的过氧自由基galvinoxyl溶于乙醇,它们能与供氢体反应,分别用于测定茶叶中的水溶性和脂溶性抗氧化剂的活性。
自由基浓度用电子自旋共振（ESR）仪测定,根据自由基浓度的变化可知抗氧化剂的活性。
Galvinoxyl和Fremy自由基选择性强,只能与供氢能力强的供氢体反应;灵敏度高,可在混浊的或颜色深的溶液中进行。
6.3以抗氧化剂抑制自由基对底物的氧化降解为基础的方法
此法与6.1.3.2方法不同之处在于测试体系中既有底物又有自由基,但底物自身不能生成自由基,它与外源自由基反应,形成有荧光或带颜色的特征物质,抗氧化剂的加入使生成的特征产物减少,由此可测得抗氧化活性。
6.3.1ORAC法
氧自由基吸收能力法
原理如下:
天然蛋白质β-藻红蛋白（β-PE）在540nm光波激发下可发射565nm的荧光。
在有自由基或氧化剂时,β-PE的荧光逐渐减弱;当有抗氧化剂存在时,β-PE的荧光减弱被抑制。
自由基或氧化剂可用AAPH（产生过氧自由基）、H2O2-Cu2+（主要产生HO.）和Cu2+。
使用AAPH时,可测量所有公认的抗氧化剂,如抗坏血酸、α-生育酚、β-胡萝卜素。
使用Cu2+-H2O2时,可测量甘露醇、葡萄糖、尿酸以及过渡金属螯合剂这类物质,不用于测定抗坏血酸、α-生育酚。
测定结果以Trolox（标准抗氧化剂）当量表示。
此法是一种新的、独特的评价各种物质抗氧化活性的方法。
该法优于其他类似方法的原因有2
个:
（1）使用了曲线下面积（AUC）的方法,将抗氧化剂对自由基作用的抑制时间和抑制程度结合成一个单独的量。
其他类似的方法是在固定抑制率时使用抑制时间或在固定的时间内使用抑制率作为定量分析的基础。
（2）此法使用不同的自由基生成剂或氧化剂,这点很重要,因为抗氧化活性与分析中使用的自由基或氧化剂有关,而且PE和自由基间的反应完全。
在ORAC法中,AAPH与抗氧化剂的摩尔比非常高（超过2000）,使得此法专一性强,测量的是抗氧化剂直接清除自由基的能力,由于使用荧光技术,此法也能测量含有抗氧化剂的稀释的油乳状液。
此法测得的是总的抗氧化活性,而且可自动化、标准化,但需要全自动系列化分析仪。
该法最初用于测定生物
体系中的抗氧化剂,后来广泛用于天然酚类物质和食品（如茶叶、蔬菜、水果和草药提取物）的测定。
6.3.2TRAP法
总自由基清除抗氧化能力法
测量血浆或血清总抗氧化能力最广的方法。
该法中的过氧自由基由AAPH产生,在向血浆中添加完AAPH后,通过测量反应过程中消耗的氧检测底物的氧化状况。
在诱导期内,氧化被血浆中的抗氧化剂抑制。
结果以血浆的诱导期与标准抗氧化剂Trolox的诱导期的比值表示。
而Ghiselli等人报道的TRAP法基本上是Glazer法的复制。
Glazer于1990年发表的TRAP法用AAPH产生过氧自由基或用Cu2+-抗坏血酸产生HO.,氧化底物B-或R-PE（藻红蛋白）。
Glazer假定在过氧自由基或HO.存在时,PE荧光的减弱与时间呈线性关系。
由试样保护PE防止过氧自由基或HO.氧化的诱导期与Trolox诱导期的比值定量给出试样的抗氧化能力。
然而,PE荧光淬灭的速度与过氧自由基或HO.不是线性关系,而且诱导期一般很难测定
Ghiselli等人的TRAP法和ORAC法使用同样的测试体系,不同之处在于动力学曲线以及由动力
学曲线计算出的抗氧化活性。
TRAP法中PE荧光的减弱与时间呈线性关系（以恒定的速率减弱）,直到荥光减弱80%;而ORAC法中荧光强度的减小随时间减慢（不以恒定的速率进行）。
造成这个差异最可能的原因是PE的起始浓度不同。
TRAP法的抗氧化活性可用图表法、诱导期计算;在ORAC法中,抗氧化能力用动力学曲线下的面积计算。
二者都以Trolox当量的形式来表示。
6.3.3DCFH-DA法
二氧荧光素二乙酸酯法也是测定总的自由基清除能力
AAPH产生的过氧自由基氧化DCFH-DA,生成DCF（dichlorofluorescein,二氯荧光黄）。
DCF有很强的荧光（Ex480nm,Fm526nm）,在504nm也有吸收,因此可用荧光法或分光光度法检测。
在此法中,DCF的荧光的形成或吸光度的出现包括4个阶段:
第一延滞期（thefirstlagphase）是由于样品中的抗氧化剂形成的,它们被过氧自由基消耗完后反应进行到第一传播阶段（thefirstpropagationphase）;由于在第一传播阶段添加的内标抗氧化剂Trolox中断此传播阶段,致使第二延滞期开始,相应的反应随Trolox的消耗进入第二传播阶段。
由第一
延滞期与第二延滞期的比值可得出样品的抗氧化能力。
6.3.4化学发光法
基本原理是活性自由基氧化发光剂（常用的发光剂有luminol（鲁米诺）、lucigenin（光泽精）等,形成的发光剂自由基能发光,发出的光可由发光计检测,容易记录。
抗氧化剂是活性自由基清除剂,它能抑制CL,使发光强度减弱,通常有一个明确的诱导期（tIND）。
抗氧化活性以Trolox当量的形式给出。
由抗氧化剂抑制CL的能力（由tIND估算）与Trolox抑制CL能力的比值可定量得出样品的抗氧化能力。
此法用H2O2或过硼酸盐氧化luminol,反应由辣根过氧化物酶（HRP）催化。
通常,此反应产生的发射光强度低,易快速消减。
通过向反应中添加对-碘苯酚（增强剂）能极大提高发射光强度,延长发射光时间并使发射光稳定。
发射光对抗氧化剂的干扰灵敏,当反应中添加的所有抗氧化剂被消耗完时能再恢复。
除上述方法外,产生CL的方法还有多种。
CL法操作简单、快速,每次操作只要几分钟,容易自
动化。
大多数CL法用于测定生物样品,它们也容易应用于食品的测试。
6.3.5β-胡萝卜素漂白法
β-胡萝卜素漂白法是根据乳状液中的亚油酸能自动氧化,生成的自由基与β-胡萝卜素反应,引起β-胡萝卜素的黄色衰减（在470nm处吸光度减小）;在有抗氧化剂存在时,β-胡萝卜素漂白的速率被减缓。
该法给出的抗氧化活性是通过抑制率来表示的,且测试体系是在非控制条件下进行的（自动化）,不能得到重复的数据,因此很少用于定量测定。
如果将自动氧化改成可以控制的反应（如使用自由基引发剂）,此法就可修改成一个能定量和具有重现性的方法。
β-胡萝卜素漂白法使用的是乳化的脂质,而在乳化的脂质乳状液中影响被测物抗氧化活性的因素增
加,很难得到重复性的结果。
如果不考虑这一点,β-胡萝卡素漂白法是很有价值的,特别是对于研究脂溶性抗氧化剂。
但是,此法不适合测定水溶性的化合物。
6.3.6藏花素漂白法
用于测定复杂混合物和食品的抗氧化能力。
藏花素是一种天色化合物（类胡萝卜素的一种）,在可见光区（443nm）有强吸收。
在有过氧自由基（可由AAPH或ABAP热分解生成）时,藏花素颜色变浅（被漂白）;添加抗氧化剂后,藏花素的漂白速率减慢。
藏花素漂白法是一种动力学方法。
对于单一化合物A,在加入偶氮化合物（提供过氧自由基）之后,藏花素漂白的速率在大约1min内呈线性关系,记录没有抗氧化剂时藏花素漂白的速率（V0）与有抗氧化剂存在时的漂白速率（V）,通常记录10min,二者的比率符合方程V0/V=1+（ka/kc）*（[A]/[C]）。
其中,[A]和[C]分别是被测抗氧化剂和藏花素的浓
度,kc和ka是过氧自由基分别与藏花素和抗氧化剂反应的速率常数,ka/kc可由[A]/[C]对V0/V的线性回归方程的斜率计算,ka/kc表明被测物与过氧自由基相互作用的相对能力,由此可测得V0/V的值。
用Trolox的ka/kc除以被测抗氧化剂的ka/kc,得到的就是以Trolox当量表示的被测化合物的抗氧化能力。
对于复杂的抗氧化剂混合物,这种方法测得的是总的抑制效果。
Tubaro等人认为,藏花素漂白法提供了一个更加精确的评价抗氧化效果的方法。
但该法测量的
是被测抗氧化剂与另一种抗氧化剂-藏花素对过氧化自由基反应的竞争,而且分析中使用的藏花素的浓度是固定的（10umol/L）,而在分析中使用多个浓度是必需的。
Lyssignoli等人提出一种修改的适合常规测试的方法---小平板比色法（microplate�
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