发酵工程综合实验报告之欧阳化创编.docx
《发酵工程综合实验报告之欧阳化创编.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵工程综合实验报告之欧阳化创编.docx（16页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
发酵工程综合实验报告之欧阳化创编
发酵工程综合实验报告
时间：
2021.02.12
创作人：
欧阳化
实验题目蛋白酶的发酵工艺研究
院系名称生物与食品工程学院
学院：
生物与食品工程学院
7月31日
标题1
摘要1
关键词2
1.引言2
2.材料与方法3
2.1材料3
2.1.1菌种3
2.1.2试剂3
2.1.3培养基4
2.1.4实验仪器4
2.2方法4
2.2.1蛋白酶酶活测定4
2.2.2总可溶性糖测定5
2.2.3枯草芽孢杆菌发酵实验6
2.2.4发酵罐实验6
2.2.5蛋白酶性质实验7
3.结果与分析7
3.1透明圈观察7
3.2标准曲线8
3.2.1酪氨酸标准曲线8
3.2.2葡萄糖标准曲线9
3.3不同装液量摇瓶发酵实验9
3.4小型发酵罐发酵实验11
3.5蛋白酶性质研究12
3.5.1最适pH测定及pH影响酶稳定性的研究12
3.5.2最适温度测定及p温度影响酶稳定性的研究13
3.6小结15
4.致谢16
5.参考文献17
蛋白酶的发酵工艺研究
StudyonProteaseFermentationConditions
摘要：
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）能够产生大量的蛋白酶，是进行蛋白酶研究的良好材料。
本次实验目的在于学习蛋白酶的定性定量测定方法，考察营养及环境对酶生产的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用。
我们控制装液量为唯一变量，测定酶活及总糖变化，最终确定最佳装液量条件为60ml。
在此基础上，我们进一步确定了最适温度为40℃，最适pH为5。
我们挑选透明圈较大的菌落在小型发酵罐进行发酵，定时取样测定酶活与总糖，绘制发酵曲线，从而了解菌体生长情况。
Abstract:
Bacillussubtiliscanproducemuchproteaseandcanbeagoodmeterialforresearchaboutprotease.Thepurposesofthisexperimentarelearninghowtomeasureproteasequalitativelyandquantificationly,investigatinghowthenutritionandenvironmentinfluencetheoutputofprotease,andtryingtobefamiliarwithsmallsizedfermentationcylinder.
Wecontrolledfluidvolumeastheonlyvariablequantity,measuredenzymeactivityandtotalsugarquantity,finallyconfirmedthatthebestfluidcolumeconditionis60ml.Onthisbasis,wemovedforwardasinglesteptoconcludethatthebesttemperatureis40℃andthebestpHis5.Wechosethebacterialcolonywithbiggertransparentcircletofermentinthesmallsizedfermentationcylinder,measuredenzymeactityandtotalsugarquantityatregulartime,thendrewthefermentationcurve,consequentlywecouldknowhowwasthesituationofthegrowingbacterium.
关键词：
枯草芽孢杆菌,蛋白酶,酶活,总糖,装液量
Keywords:
Bacillussubtilis,protease,enzymeactiivity,totalsugarquantity,fluidvolume
1.引言
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。
按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。
前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。
皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。
蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。
临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。
加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。
催化蛋白质水解的酶类。
种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等【1】。
蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富【2】。
由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。
蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中【3】。
在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中都大量的使用蛋白酶。
此外，胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶都是人体消化道中的蛋白酶，在它们的作用下，人体摄入的蛋白质被水解成小分子肽和氨基酸。
目前在焙烤工业中使用的蛋白酶有霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶和植物蛋白酶。
面包生产中应用蛋白酶能改变面筋性能，其作用形式和面包调制时力的作用及还原剂的化学反应不同。
蛋白酶的作用不是破坏二硫键，而是断开形成面筋的三维网状结构。
蛋白酶在面包生产中的作用主要表现在面团发酵过程中。
由于蛋白酶的作用，使面粉中的蛋白质降解为肽、氨基酸，以供给酵母碳源，促进发酵。
随着蛋白酶制剂应用研究的不断深入，人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用，蛋白酶也因此受到了越来越多的关注【4】。
但目前无论是对蛋白酶的基础研究还是应用研究都还存在很多不足，需要加强以下方面的工作：
①筛选和培育产蛋白酶含量高的微生物菌种，并且这些菌所产的蛋白酶必须稳定性好，适合在饲料工业中应用；②研究不同pH值特性的蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶）在动物消化道内的相互作用；③研制具有多种用途（如既可补充动物内源酶不足又可降解抗营养因子）的复合蛋白酶；④根据不同的日粮类型和动物生长阶段，开发专用的蛋白酶产品；⑤加强蛋白酶在生长和成年动物上的应用研究；⑥研究蛋白酶对动物内源酶和饲料中其它外源酶的影响【5】。
本次实验目的在于学习蛋白酶的定性定量测定方法，考察营养及环境对酶生产的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用。
最终确定最佳装液量条件为60ml。
在此基础上，我们进一步确定了最适温度为40℃，最适pH=5。
此次试验能够帮助我们了解蛋白酶的性质，确定酶的最适条件，熟悉小型发酵罐的操作工艺流程。
2.材料与方法
2.1材料
2.1.1菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）
2.1.2试剂
（1）生理盐水：
称取0.85gNaCl，用蒸馏水定容至100ml，即为0.85%生理盐水,121℃灭菌20min。
（2）福林试剂（Folin试剂）:
使用时加2倍蒸馏水稀释,即成已稀释的福林试剂。
（3）0.4mol/L碳酸钠溶液:
称取无水碳酸钠42.4g，用蒸馏水定容至1000mL。
（4）0.4mol/L三氯乙酸（TCA）溶液:
称取三氯乙酸65.4g，用蒸馏水定容至1000mL。
（5）pH7.2磷酸盐缓冲液:
称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.2g，用蒸馏水定容至1000mL,即成0.2mol溶液（A液）。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液（B液）。
取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液。
（6）2%酪蛋白溶液:
准确称取干酪素2g,称准至0.002g，加入0.1mol/L氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸）,然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
（7）100μg/mL酪氨酸溶液:
精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐
步加入6mL1mol/L盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.21mol/L盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。
（8）蒽酮试剂：
取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。
（9）标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）：
100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。
2.1.3培养基
（1）牛肉膏蛋白胨培养基（g/100ml）：
牛肉膏0.5，蛋白胨1，氯化钠0.5，pH7.07.2，121℃灭菌20min。
（2）酪蛋白培养基（g/100ml）：
牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化钠0.5,奶粉5，琼脂2，pH7.27.4，121℃灭菌20min。
（3）细菌种子培养基1:
牛肉膏蛋白胨培养基。
（4）细菌基本液体发酵培养基（g/100ml）：
豆饼粉3.0，玉米粉4.0，麸皮粉2.5，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾0.03，pH7.27.4，121℃灭菌20min。
（5）PDA酪蛋白培养基（100ml）：
马铃薯汁（20%）100ml，奶粉5g，琼脂粉2g，自然pH，121℃灭菌20min。
2.1.4实验仪器
试管，烧杯，移液管，锥形瓶，胶头滴管，100ml容量瓶，移液枪，恒温振荡箱，恒温培养箱，培养皿，水浴锅，分光光度计，离心机，离心管，比色皿等。
2.2方法
2.2.1蛋白酶酶活测定（福林酚法）
原理：
福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
酪氨酸标准曲线的绘制：
取6支干燥试管编号，分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。
摇匀置于水浴锅中。
40℃保温发色20min在用721型分光光度计进行测定（波长660nm）。
表1酪氨酸标准曲线绘制加样
编号
1
2
3
4
5
6
酪氨酸/ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
H2O/ml
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Na2CO3/ml
5
5
5
5
5
5
福林酚/ml
1
1
1
1
1
1
OD660
蛋白酶活力测定：
试管中加入0.1MpH7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释后的酶液1ml（或固体物料1g，加水9ml振荡30min后取1ml），取，40℃预热5分钟，加入预热过的pH7.2的2.0%酪蛋白1ml,摇匀，在40℃水浴中准确反应10分钟。
用2mlTCA终止酶反应，静置10min。
过滤后取1ml滤液，加入0.4mol/L碳酸钠5mL,再加入已稀释的福林试剂1mL。
空白试验测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活,再加入酪蛋白。
（若OD值过大，可稀释滤液重新比色，不允许稀释显色液）
蛋白酶酶活力单位的定义：
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
蛋白酶活力（µ/ml）=A*4*N/10；式中:
A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；N——酶液稀释的倍数;10——反应10min。
2.2.2总可溶性糖测定
原理：
蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。
葡萄糖标准曲线测定：
取7支干燥洁净的试管，按表2顺序加入试剂，进行测定。
以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线。
表2葡萄糖标准曲线绘制加样单位：
ml
管号
0
1
2
3
4
5
6
标准葡萄糖溶液
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.8
蒸馏水
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.4
0.2
置冰水浴中5min
蒽酮试剂
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色
葡萄糖浓度（mg/ml）
A620nm
发酵液中总糖测定：
取稀释后的发酵液1mL，加入蒽酮试剂4mL（注意冰浴），加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。
空白试验中将稀释样液换为水，其它测定方法同上。
2.2.3枯草芽孢杆菌发酵实验
（1）种子培养：
在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入装有30毫升种子培养基的250ml三角瓶中，在30±1℃振荡培养1216h。
（2）涂平板：
取种子培养液1ml,用无菌生理盐水稀释度，取105，106稀释度，涂布在酪蛋白培养基平板上。
每个稀释度涂2套平板，每套平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满整个平板表面。
（3）发酵培养：
将种子液接种到发酵培养基中，振荡培养72h。
（4）蛋白酶摇瓶发酵工艺优化：
改变发酵的某一条件，如碳源种类，氮源种类，C/N,pH,装液量等，测定蛋白酶酶活，以确定较优的发酵工艺条件。
（4）提取（液体培养）：
将培养物合并，抽滤除菌体，测定滤液的蛋白酶酶活，算出总酶活。
向滤液加入硫酸铵使浓度达55%，静置过夜，去上清液，将沉淀通过压滤除母液，（测定母液中的蛋白酶活性），于40℃干燥24h,烘干后进行磨粉，即得粗酶制品。
测定粗酶制品中的蛋白酶酶活。
2.2.4发酵罐实验
（1）种子培养：
在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入装有50毫升种子培养基的500ml三角瓶中，在30±1℃振荡培养1618h。
（2）接种：
将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火后打开接种口，将种子培养液注入。
接种量为1%5%，盖好接种口，调节搅拌转速至所需数值，培养开始。
（3）取样：
为了解培养过程中的变化，需定时取样进行样品分析。
由于罐内为正压，打开取样管时，样品自然流出。
取样时应将上一次取样时残留在取样管中的培养液去除后再取样。
另外，取样后应通过加热蒸汽，以防取样管路污染杂菌。
（4）培养结束：
将电极与培养液全部取出，发酵罐冲洗干净。
2.2.5蛋白酶性质实验
粗酶液制备：
固态发酵：
准确称取1g发酵物料，加入100mmol/LpH7.2的磷酸缓冲液10mL,30°C、180rpm/min振荡2h,过滤后滤液。
液态发酵：
合并发酵液，抽滤除菌体，取滤液。
酶学性质：
（1）最适反应pH值及pH值稳定性研究
40℃下测定在pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0时（柠檬酸磷酸钠缓冲体系）的酶活，以酶活力最高者为100%。
以沸水浴5min的酶液作为对照。
将粗酶液置于pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的缓冲溶液中40℃下保温4h，测定漆酶活性。
以酶活力最高者为100%。
以沸水浴5min的酶液作为对照。
（2）最适反应温度及温度稳定性研究
测定在温度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的酶活。
以酶活力最高者为100%。
以沸水浴5min的酶液作为对照。
将酶液在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中保温4h，然后40℃下测定其残余酶活。
以酶活力最高者为100%。
沸水浴5min的酶液作为对照。
3.结果与分析
3.1透明圈观察
图1透明圈
数据：
透明圈直径2.2cm，菌落直径0.6cm。
分析：
透明圈直径与菌落直径比值越大，则表示酶的活力越高。
此图中的透明圈是我们组培养的所有平板中最大者。
比值=2.2/0.6=3.67,数值较大，说明酶活力较高。
我们将此菌落进行摇瓶培养，作为下一步进行的小型发酵罐培养的种子液。
3.2标准曲线
3.2.1酪氨酸标准曲线
图2酪氨酸标准曲线
方法：
以酪氨酸微克数为横坐标，以对应OD值（660nm）为纵坐标，根据实验数据绘制。
分析：
R平方值较接近1，说明拟合程度较好。
3.2.2葡萄糖标准曲线
图3葡萄糖标准曲线
方法：
以标准葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，以对应OD值（620nm）为纵坐标，根据实验数据绘制。
分析：
R平方值较接近1，说明有较高的拟合度。
3.3不同装液量摇瓶发酵实验
表3装液量40ml摇瓶发酵实验结果
表4装液量60ml摇瓶发酵实验结果
表5装液量80ml摇瓶发酵实验结果
分析：
根据表中数据可知，随着时间的推移，酶活呈现先上升后下降的规律。
这明显符合菌体的生长情况。
当培养时间达到30h时，酶活最高。
总糖总体上呈下降趋势，不过624h内总糖下降较快，3054h内总糖下降较慢。
这可能是因为刚开始菌体生长处于对数期，代谢较强，对糖的需求很大，然后菌体生长趋于稳定状态直至衰老，所需糖量就会减少。
通过对比三组数据，我们发现当装液量为60ml时，酶活最高。
这可能是因为此组的菌体密度比其它两组更为适宜。
3.4小型发酵罐发酵实验
图4发酵曲线
分析：
024h内酶活较低，2448h内酶活迅速升高，4856h内酶活稍有下降。
这可能是因为024h内菌体处于生长初期，刚刚适应新的环境，产酶量少；然后2448h内菌体快速生长，产酶量也因此迅速增加；4856h内菌体生长趋于稳定，产酶量因此略有下降。
此后预计产酶量仍会进一步降低。
表6总可溶性糖测定
分析：
024h内总糖利用较少，2448h内总糖利用明显增多，4856h内总糖利用又有所下降。
这可能是因为024h内菌体处于生长初期，刚刚适应新的环境，对糖需求量小；然后2448h内菌体快速生长，需要的总糖量也因此迅速增加；4856h内菌体生长趋于稳定，需总糖量因此略有下降。
此后预计总糖仍会进一步降低。
3.5蛋白酶性质研究
3.5.1最适pH测定及pH影响蛋白酶稳定性的研究
表7pH研究原始数据
（1）最适pH测定
数据处理：
测定pH分别为2,3,4,5,6,7且温度都为40℃时的酶活，以沸水浴5min的酶液作对照。
然后取酶活最高者为100%，其余的相对酶活由各自酶活与最高酶活的比值所得。
图5不同pH对蛋白酶活性的影响
分析：
由图可知，酶活在pH为5的时候达到最高，此时菌体生长状况最好。
pH为24时酶活相对较低。
pH在67之间时，酶活仍处于较高水平。
（2）pH对蛋白酶稳定性的影响
数据处理：
保温4h后，再次测定酶活，仍以沸水浴5min的酶液作对照。
酶稳定性由下降后的酶活与之前的酶活比值所得。
图6不同pH对蛋白酶稳定性的影响
分析：
由图中可知，当pH为5的时候酶的稳定性最高。
pH在24时，酶的稳定性较差。
pH在67时，酶的稳定性也相对较高。
这可能是因为菌体比较适宜在酸性环境中生长。
3.5.2最适温度测定及温度影响蛋白酶稳定性的研究结果
表8温度研究原始数据
（1）最适温度
数据处理：
测定温度分别为20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃时的酶活，并以沸水浴5min的酶液为对照。
然后取酶活最高者为100%，其余的相对酶活由各自酶活与最高酶活的比值所得。
图7温度对蛋白酶活性的影响
分析：
当温度为40℃时，酶活最高。
2040℃之间或4060℃之间时，酶活也相对较高。
70℃时酶活较低。
80℃时酶活基本为零，这可能是高温引起蛋白酶结构变性失去活性。
（2）温度对蛋白酶稳定性的影响
数据处理：
保温4h后，再次测定酶活，仍以沸水浴5min的酶液作对照。
酶稳定性由下降后的酶活与之前的酶活比值所得。
图8温度对蛋白酶稳定性的影响
分析：
50℃时酶的稳定性最高。
80℃时酶活降至零点，说明已经完全失去活性。
3.6小结
（1）本实验通过改变装液量测定酶活及总糖变化，最终确定最佳装液量为60ml，此时的菌体密度最适宜菌体生长。
（2）024h内，酶活较低，总糖利用较慢，菌体处于生长初期；2448h内，酶活迅速增高，总糖利用也迅速增多，菌体处于快速增长期；4856h内，酶活略有下降，总糖利用也趋于平缓，此时菌体生长稳定。
（3）通过对蛋白酶性质的研究，最终确定最适pH为5，最适温度为40℃，但是在50℃时酶的稳定性最高。
（4）初步掌握了小型发酵罐的操作流程。
实验过程中难免出现一些不必要的技术失误，今后会更加注重提高实验技能水平。
4.致谢
感谢杨柳老师认真又耐心的指导，尤其是对发酵罐操作流程的细致讲解，使我们能顺利完成实验！
感谢实验室工作人员为我们创造了良好的学习环境！
感谢小组成员袁浏欢、李文涵、李文胜、黄勇军、叶岩的合作与努力！
5.参考文献
【1】卫公元，王大慧，陈坚。
不同溶氧控制方式下的谷肤甘肤分批发酵过程[J]。
化工学报。
（9），23302332
【2】刘颖，张彬彬。
枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化[J]。
食品科学，，Vol.35,No.13
【3】卓林霞，吴晖。
枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶优化试验研究[J]。
粮食与饲料工程，
（2），3235
【4】董晓燕。
生物化学实验[M]。
化学工业出版社，
【5】赵东峰，梁春艳，任翔。
溶氧对生物转化泰乐菌素及其酰化物的影响[J]。
中国医药工业杂志，,37（3），162164
合肥工业大学综合实验报告
学生姓名
杨益坤
专业（班级）
生物技术121班
学号
214114
实验名称：
蛋白酶的发酵工艺研究
个人小结：
通过认真地完成本次实验，我掌握了蛋白酶的定性定量测定方法，了解了营养与环境条件对蛋白酶生产的影响，还熟悉了小型发酵罐的工艺流程，可谓是受益匪浅。
我认为此次实验之所以取得成功主要是归功于杨柳老师的悉心指导以及小组成员们的合作努力，当然也是与自己对待实验认真负责的态度密不可分。
但是，实验过程中仍然会遇到很多棘手的问题，犯一些低级错误，以后我会更加注重提升自己的实验技术水平，为将来在科研方面取得更大的进步打下坚实的基础。
再次感谢尊敬的杨柳老师和亲爱的小组成员们！
个人签名：
年月日
成绩：
指导教师签字：
年月日
升级会员 