小扁豆根腐病菌的分离与鉴定及对紫花苜蓿红豆草和沙打旺的致病性研究.docx

小扁豆根腐病菌的分离与鉴定及对紫花苜蓿红豆草和沙打旺的致病性研究.docx

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小扁豆根腐病菌的分离与鉴定及对紫花苜蓿红豆草和沙打旺的致病性研究

分类号：

密级：

专业学位研究生学位论文

论文题目（中文）

小扁豆根腐病菌的分离与鉴定及对紫花苜蓿、红豆草和沙打旺的致病性研究

论文题目（外文）

Isolationandidentificationofpathogensoflentil（lensculinaris）rootrotandstudyontheirpathogenicitytoMedicagosativa,OnobrychisviciaefoliaandAstragalusadsurgens

研究生姓名

XXXXXX

学位类别

农业推广

专业学位领域

草业

学位级别

硕士

校内导师姓名、职称

XXXX教授

论文工作起止年月

2011年08月至2013年05月

论文提交日期

2013年06月

论文答辩日期

2013年05月

学位授予日期

校址：

XXXXXXX

原创性声明

本人郑重声明：

本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。

学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。

除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其它个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。

对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本声明的法律责任由本人承担。

论文作者签名：

日期：

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本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大学。

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本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。

本学位论文研究内容：

□可以公开

□不宜公开，已在学位办公室办理保密申请，解密后适用本授权书。

（请在以上选项内选择其中一项打“√”）

论文作者签名：

导师签名：

日期：

日期：

小扁豆根腐病菌的分离与鉴定及对紫花苜蓿、红豆草和沙打旺的致病性研究

中文摘要

小扁豆（Lensculinaris）是甘肃省会宁县等地普遍栽培的粮食作物，也是轮作倒茬和肥土作物，近年来由于小扁豆成片死亡，产量锐减，加之“退耕还林换草”等国家政策的号召，当地陆续改种紫花苜蓿（Medicagosativa）、红豆草（Onobrychisviciaefolia）、沙打旺（Astragalusadsurgens）等豆科牧草。

本论文研究了引致会宁县小扁豆死亡的病原真菌，及这些真菌对三种豆科牧草的致病性，得到如下结果：

1、会宁县调查点小扁豆的死亡率为43.2%，死亡的原因为镰刀菌根腐病（Fusariumspp.），植株发病率为58.4%，根部变褐导致地上枯死为主要症状。

2、结合形态学和ITS序列分析，确定主要的镰刀菌为尖镰孢（Fusariumoxysporum）、木贼镰孢（F.equiseti）和锐顶镰孢（F.acuminatum），在病株根部的分离率分别为55%、18%和9%。

3、用采自当地的土壤盆栽的四种植物均受到此三种镰刀菌的侵染，说明小扁豆镰刀菌根腐病菌为土传病菌，且可侵染小扁豆和三种豆科牧草。

4、三种镰刀菌室内致病性测定和病土栽培两个试验证明，三种镰刀菌均显著降低小扁豆和三种牧草的根长和根干重（P<0.05）。

本论文研究表明在发生过小扁豆根腐病菌的土地建植紫花苜蓿、沙打旺和红豆草等豆科牧草可发生根腐病，建议在生产上加以重视。

关键词:

小扁豆，镰刀菌根腐病，紫花苜蓿，红豆草，沙打旺，致病性

Isolationandidentificationofpathogensoflentil（lensculinaris）rootrotandstudyontheirpathogenicitytoMedicagosativa,OnobrychisviciaefoliaandAstragalusadsurgens

Abstract

Lentil（Lensculinaris）isalimentarncropcomonlyplantedinHuiningandothercounties,GansuProvince.Itisusedinrotationandeutrophytion.However,productionoflentilrupidlydelinedrencentlyyearsasmanyplantsdied.SomeleguminousforageplantssuchasMedicagosativa,Onobrychisviciaefolia,Astragalusadsurgenswerealternatedinthesesiolinthissituationandsomegovermentalpolicysuchasgrainlandforgreenwereimplemented.TheobjectofthisthesiswastostudythepathogensoflentilinHuiningarea,andtestthepathogenicityofthesepathogenstotheseforageplants.Someresulteswereasfollows:

1.MortalityoflentilinHuiningwas43.2%.ThereasonwasFusariumrootrot.Diseaseincidencewas58.4%.Thesymptomscharacterizedasabovegrounddiedsincerootbrownrot.

2.Fusariumspp.wereidentifiedasFusariumoxysporum,F.equisetiandF.acuminatumcombinedmorphologicalandITSanalysis.Theisolationfrequentieswere55%,18%and9%.

3.FourplantspecieswereinfectedbythethreeFusariumspeciesinthepotexperimentusedsoilcollectedfromHuining.Thisindicatesthepathogensoflentilrootrotwassoilborne,andhavevirulencetothethreeleguminousforages.

4.ThethreeFusariumspeciesdecreasedrootlengthandrootweightsignificantly（P<0.05）bothinpathogenicitytestandpotexperimentwithcontaminativesoil.

Inconclusion,M.sativa,O.viciaefolia,A.adsurgenswouldbeinfectbythepathogensoflentilrootrotinsoilaftergrownlentilwithrootrot.Itisnecessarytopaymuchattentiontorootrotofleguminousforagespractically.

Keywords:

lentil,Furasiumrootrot,Medicagosativa,Onobrychisviciaefolia,Astragalusadsurgens,pathogenicity

目录

中文摘要I

AbstractII

前言1

第一章文献综述2

1.1会宁县农业结构状况2

1.1.1会宁县农业概况2

1.1.2会宁农业结构发展趋势3

1.2小扁豆及其病害4

1.2.1小扁豆的生物学及其利用方式4

1.2.2小扁豆病害6

1.3豆科牧草及其根腐病9

1.3.1豆科牧草的发展前景9

1.3.2豆科牧草的根腐病10

1.4小扁豆根腐病菌和豆科牧草根腐病菌的联系11

第二章材料与方法12

2.1材料12

2.1.1小扁豆根腐病调查与取样地点12

2.1.2供试植物12

2.1.3供试土壤12

2.1.4培养基12

2.2试剂和仪器13

2.3方法14

2.3.1小扁豆根腐病的发病率和死亡率田间调查14

2.3.2小扁豆根腐病菌的分离14

2.3.3小扁豆根腐病菌的培养与鉴定14

2.3.4小扁豆根腐病菌对四种植物的致病性测定16

2.3.5小扁豆根腐病发生区土壤盆栽试验17

2.4数据处理17

第三章结果与分析18

3.1小扁豆根腐病田间调查18

3.1.1发病率和死亡率18

3.2小扁豆病原菌在田间植株上的分离与鉴定20

3.2.1分离率20

3.2.2形态学鉴定20

3.2.3在8种培养基上的菌落特征及生长速率25

3.2.4三种镰刀菌的分子生物学鉴定29

3.3小扁豆根腐病菌对四种植物的致病性测定32

3.3.1发病过程及症状32

3.3.2主要分离病原菌的致病性32

3.3.3病原菌的再分离34

3.4土传途径验证34

3.4.1生物量测定34

3.4.2病原菌再分离35

第四章讨论36

参考文献38

在学期间的研究成果42

项目资助43

致谢44

前言

小扁豆（Lensculinaris）是甘肃省会宁县等甘肃中部干旱地普遍种植的豆科粮食作物，主要经济作物，也常用作轮作养地和饲料（陈喜明等，2011）。

然而，据当地农民反映和本文作者初步观察，会宁县小扁豆的植株死亡比例较高，导致大量减产，甚至绝收，致使小扁豆在当地的栽培面积不断缩减。

在“调整农业结构”、“退耕还林还草”、“国土整治”等政策指导下，本地区不断增大紫花苜蓿、红豆草、沙打旺等牧草的种植面积（王海川，2013）。

国内外研究表明豆科植物死亡的主要原因为根腐病（南志标，1991），在国外引致小扁豆根腐病的病原有立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）（Beniwaletal.,1993），齐整小核菌（Sclerotiumrolfsii）（Aycocketal.,1966），镰刀菌（Fusariumspp.）（Tosietal.,2001），核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）（Beniwaletal.,1993）等。

但国内报道的仅有镰刀菌，发现于甘肃省定西地区（张彦梅，2007）。

但会宁县小扁豆根腐病的病原是否与定西地区一致或不同尚无研究。

植物根腐通常为土传病害，其寄主范围较广，且部分病菌存在寄主专化型，如由茄镰孢豌豆专化型（Fusariumsolanif.sp.pisi,Fsp）引起的根腐病是豌豆（Pisumsativum）最重要的病害之一（向妮等，2012），由尖镰孢西瓜专化型（F.oxysporumf.sp.niveum）引起西瓜枯萎病（刘波等2012）；由尖镰孢小扁豆专化型（Fusariumoxysporumf.sp.lentis）引起寄主植物小扁豆的枯萎病（Bayaaetal.,1998）。

然而，在发生过小扁豆大量死亡的土地上播种豆科牧草是否会影响草地建植、草地生产力和草地持久性等均尚无定论。

本论文拟研究引致会宁县小扁豆死亡的病原真菌种类的基础上，在室内确定这些病原菌对紫花苜蓿、红豆草、沙打旺等三种豆科牧草的致病性，为当地退耕还草过程中牧草病害控制提供初步依据。

第一章文献综述

1.1会宁县农业结构状况

1.1.1会宁县农业概况

我国是小杂粮作物的起源中心之一，有相关统计结果表明，在20世纪90年代，我国曾大规模生产燕麦、豌豆、小扁豆等品种（张名恢，1989；柴岩等，2001；林汝法，2002）。

因此，我国被全世界赞誉为“小杂粮的王国”。

小杂粮的种植区主要集中在我国的旱作地区和高寒地区：

黑龙江、吉林、河北、陕西、甘肃、宁夏、新疆等干旱区域（程汝宏，2003；李洪，2005）。

杂粮作为旱作农业的重要组成部分，在豆类作物中，绿豆、豌豆、蚕豆、小扁豆等都比较耐干旱、耐土壤瘠薄（张名恢，1989；蔺海明，1990），常作为开垦荒地的先锋作物及减灾作物（杜虎平，2006）。

目前，由于加工技术落后，品种退化严重，且经营粗放，使得国际市场上杂粮销量上涨，供不应求（郭艳，2006）。

而由于种植条件的限制和生态环境的不断恶化，小杂粮作物病害的防治工作迫在眉睫，因此也是我们目前研究的重点之一（程宏汝，2003）。

小杂粮作为甘肃省的特色粮食作物之一，其适应性广，种植范围广泛，且种植面积相对集中，种植方式多种多样（吴国忠，2003；赵有彪，2007）。

随着小杂粮的价格不断攀升，具有显著的经济效益（秦俊梅等，2004；刘中卿等，1999；韦公远，1999）。

但近年来，随着马铃薯和地膜玉米的大面积推广种植，小杂粮的种植被忽略，从而导致其种植的规模也逐渐下滑，使旱区粮食生态系统的多样性以及生态系统的平衡遭到了破坏（吴国忠，2003）。

因此，大力发展小杂粮作物的生产，保证我省的粮食安全是刻不容缓的，大力发展小杂粮作物对促进农业经济结构调整、增加农民收入还具有十分重大的意义。

近年来，随着农业产业结构的调整以及农业膳食结构的多元化发展，食用豆类产业目前已发展成为西部地区农业和农村经济发展中极具竞争优势和发展潜力的特色产业（和立宣，2003；盖钧镒等，1994；崔永伟，2008）。

会宁县总面积6439平方公里，现有耕地460多万亩，其中川塬地120万亩，梯田沟坝地170多万亩，山坡地170多万亩。

全县辖28个乡镇，284个村，总人口58.45万人，农业人口53.31万人，占总人口数的91%（张寅等，2011）。

会宁县是甘肃省农业资源大县，马铃薯、玉米、紫花苜蓿生产占全省的十分之一（王彩斌，2006）。

小扁豆是会宁县的特殊小杂粮之一，因小扁豆在整个生产过程中不使用农药、化肥及其它添加剂，因此被认为是极具特色的绿色的无公害的食品资源（白美清，2008）。

且小扁豆在农业生产中能够有效地减少环境的污染，降低能源的多余消耗，进而能够有效地保持良好的土壤结构（张雄等，2003；张雄等，2005）。

从这几年的传统农业来看，产业水平严重低下，甚至颗粒无收。

在这块贫瘠的土地上，农民靠天降粮，靠窖吃水。

目前在这块土地上，搞工业没有出路，只有先把传统农业科学发展，向现代化农业进军，因地制宜，解决会宁县传统农业落后的问题，从而解决会宁县的贫困问题（王彩斌，2006）。

1.1.2会宁农业结构发展趋势

会宁县地处陇中干旱半干旱农业生态区，特定的旱地农业生态长期以来形成了特有的旱地农作物布局与耕作栽培制度，使小杂粮作物种植具有悠久的栽培历史。

当前会宁县小杂粮常年播种面积在3.5万hm2以上，年产小杂粮达7.5万吨。

小杂粮种植主要以凉谷米、黑谷米、荞麦、莜麦、豌扁豆为主。

会宁县是甘肃省的小杂粮绿色食品生产基地，近年来，会宁县小杂粮产业在有关方面的高度关注和重视下，走出了一条特色发展之路，为甘肃省小杂粮产业的发展提供了值得参考和借鉴的经验和依据（杨祁峰等，2009）。

近年来，会宁县按照“打绿色牌，把会宁建成陇中绿色产业基地”的奋斗目标，提出了“发展是第一要务，草畜是第一产业”的发展思路，大力实施百万亩全膜、百万亩玉米、百万亩草、百万亩马铃薯、百万只羊五个百万工程，草畜产业发展基础得到加强，规模养殖发展速度不断加快（会宁县区划办，2003）。

会宁县是粮食生产大县，按照“水地全套种、平地全铺膜”的发展思路，积极探索高产高效栽培模式；会宁是草畜产业强县，坚持“坡地全种草，农民全养殖”的思路；会宁是陇中绿色产业基地，土层深厚、无污染，具有发展绿色产业得天独厚的优势（崔永伟，2008）。

多年来，全县上下顺应自然规律，培育形成了马铃薯、草畜、小杂粮、瓜类等特色产业。

经过多年的发展，全县的农业产业化建设已初具规模，形成了以马铃薯和草畜为主的战略主导产业，以小杂粮为主的地方特色产业，以瓜类为主的区域优势产业。

因此会宁县被中国特产之乡委员会命名为“中国小杂粮之乡”和“中国肉羊之乡”（吴国忠，2003）。

小杂粮生产已成为当地农民增加收入的一条重要途径，也成为会宁县的支柱产业之一。

天然草场是畜牧业发展的基础条件，然而目前常被人们所忽视，长期以来只有索取，没有投入（李爱珍，2001）。

过度垦植，自然灾害及不合理超载放牧使草场退化现象日益加剧。

加强对草场的保护和合理利用，特别是进行科学改良和管理，显得十分必要。

由于会宁县干旱缺水，种植业的不断扩大使水资源更加紧张，应提倡有计划的退耕还草，尤其在农作物生产低效益区和高风险区，更应加大退耕还草的力度。

因此，发展草产业对于保护生态环境、实现人与自然和谐发展，促进地区产业发展，有着紧迫的现实意义（郭耀武，2011）。

1.2小扁豆及其病害

1.2.1小扁豆的生物学及其利用方式

1.2.1.1小扁豆的生物学

小扁豆（Lensculinaris），又名滨豆、兵豆、鸡眼豆、洋扁豆。

其英文名为lentil,Splitpea（郑卓杰等，1997），为豆科一年生草本植物，是目前为止世界上已发现的最古老的自花授粉作物之一（Zohary,1972），小扁豆在全世界有超过48个国家种植（Erskine,1997），是世界上第七大食用豆类作物（表1）（Furmaniaketal.,2007），其作为一种耐旱杂粮作物，在我国的北方地区栽培历史悠久，其中大部分种植在干旱少雨地区或山区，通常可以借助自然降雨供给水分或底部土壤的水分生长（叶静渊，1995）。

近年来，小扁豆作为重要的农业出口商品之一，发展迅速（Sarkeretal.,2006）。

全世界的农业均起源于各种不同的时间和不同的背景。

小扁豆是人类种植的最古老的栽培和驯化作物，起源于亚洲西南部和地中海地区（沈奇等，2012），其栽培历史已接近10000年（Cubero,1981）。

在新石器时代的许多考古遗迹上均发现了碳化的小扁豆种子，研究怀疑很可能这是野生小扁豆的遗迹。

几十年来，小扁豆被认为是人类驯化的最早的物种（Nesbittetal.,1998）。

小扁豆是经古丝绸之路传入我国的（叶静渊，1995），主要分布在甘肃、新疆、山西、内蒙古、河南、河北、陕西、宁夏、云南等省区，江苏、安徽等地曾经也大力推广种植（宗绪晓等，1997；龙静宜等，2002）。

表1十大小扁豆生产国2009

国家

产量（吨）

加拿大

1,510,200

印度

950,000

土耳其

302,181

美国

265,760

澳大利亚

143,000

埃塞俄比亚

123,777

中国

120,000

叙利亚

102,461

伊朗

83,985

孟加拉

60,537

世界

3,917,923

注：

来自联合国粮农组织-经济和社会部门-统计部门

小扁豆是一种长日照作物，耐旱性强，分布广泛，能够适应寒冷干燥的恶劣气候，通常发芽的最低温度为3～4℃，最适生长温度为22℃左右，主要栽培于温带、亚热带和热带的高海拔地区，其中以亚洲栽培最为广泛。

小扁豆种子种子休眠期较短，通常为3～4周，生育期也短，通常为90～120天，子叶不出土，千粒重为10～90g，适宜于砂质壤土，而不适于酸性土壤，常和大麦或小麦混播，当植株逐渐变黄，下部豆荚变为褐色或黄褐色时，则可以收获（Summerfieldetal.,1981；陈喜明等，2011；Muchlbaueretal.,1985；Saxenaetal.,1981；Solhetal.,1981；Wilsonetal.,1972；Zohary，1972）。

小扁豆作为自花授粉植物之一，为豆科蝶形花亚科，染色体数目为2n=14（Sharmaetal.,1996）。

研究结果表明栽培型小扁豆的单倍体染色体基因组大小为4,063Mbp（Arumuganathanetal.,1991）。

然而，杨秀英等人对中国东北和甘肃所产的两种种皮颜色小扁豆进行了分类研究，研究结果表明绿色种皮小扁豆和红色种小扁豆的核型公式为2n=2x=16=6m+6sm+2st+2st（SAT），结果与其他学者的研究结果有所不同（杨秀英等，2000）。

通常，通过植株和种子的形态特征不能够形象地描述小扁豆，因此，分子和生化标记被用于更好的描述小扁豆。

蛋白质电泳，尤其是11S蛋白和7S蛋白被用于很多豆类品种的品种描述（Geptsetal.,1986）。

据报道，这种贮藏蛋白适合于标记多态性检测其中不同的基因型（Geptsetal.,1986；Marchetal.,1987；Staswicketal.,1983）。

小扁豆属具有丰富的遗传多样性（Galasso,2003），其中仅有一个亚种LensculinarisMedik.subsp.Culinaris被认为是栽培种，根据种子的大小和形状可以把LensculinarisMedik.subsp.Culinaris分为两个变种：

直径小于6mm的小粒变种var.microsperma和直径大于6mm的大粒变种var.macrosperma（Guptaetal.,2005）。

而其他的小扁豆属则被认为是野生亚种和野生种：

Lensculinarissubsp.orientalis（Boiss.）Ponert.,LensodemensisLadiz.,Lenservoides（Bring）Grande.,Lensnigricans（Bieb.）Godr.,LenslamotteiCzefr.和LenstomentosusLadiz.。

小扁豆属的分类曾经历过前后很多次的修改（Ladizinskyetal.,1984；Ladizinsky,1993；Ladizinsky,1997；Fergusonetal.,2000）。

Ferguson等（2000）通过同工酶和RAPD的实验分析，结果发现小扁豆属的分类是由4个种的7个分类群组成的：

Lensculinarisssp.Culinaris,Lensculinarisssp.Orientalis,Lensculinarisssp.Tomentosus,Lensculinarisssp.Odemensis,L.ervoides,L.nigricans,L.lamotte,其中L.odemens