激光扫描共聚焦显微镜操作手册.docx
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激光扫描共聚焦显微镜操作手册
北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书
激光扫描共聚焦显微镜
（A1R-si）
操作指南
北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书
第一章：
Ti-E显微镜操作2-7
显微镜光路调节和照明注意事项6
Ti-E物镜，DIC插片，DIC棱镜对照表7
第二章：
共聚焦开关机8-10
第三章：
共聚焦图像拍摄11-38
NIS-ElementsC软件开启和操作界面简介11-15
NIS-ElementsC的实时图像获得基本操作16-23
图像拍摄24-27
探测模式（标准探测器）设置28-38
第四章:
图像的保存和查看39-42
第五章：
图像分析43-46
附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍47-51
附件二：
图像格式批量转换操作52-53
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第一章Ti-E显微镜操作指南
（一）认识显微镜各个部件
（1）滤光片：
包括D---毛玻璃；NCB---色温（8）滤色块转盘（包括DIC检偏器）；
平衡片；ND---减光片；“GIF”---绿色滤（9）手动荧光光闸；
光片和用于PFS的红外滤光片；（10）电动焦距调节旋钮；
（2）视场光阑；（11）ND减光片；
（3）聚光器升降旋钮；（12）遥控器；
（4）起偏器（DIC用）；（13）透射光电源；
（5）聚光器对中旋钮；（14）汞灯荧光光源；
（6）孔径光阑；（15）PFS控制器
（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（16）HUB控制器
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遥控器示意图（根据具体配置有些图标可能不显示）
1）物镜切换按钮；
2）滤光块，DIC检偏器切换按钮；
3）DIC检偏器快速切换按钮；
4）光路端口切换按钮；
5）PFS开关控制按钮；
6）聚光器转盘切换按钮；
7）透射光源控制按钮*。
*请注意：
CNTL按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微
镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定；CNTL功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制
透射光源。
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前面板示意图
1）状态显示屏；
2）PFS开关按钮和PFS聚焦状态指示灯（需要选购PFS部件）；
3）光路端口切换按钮；
4）中间变倍旋纽；
侧面板示意图
1）调焦旋钮
2）粗微调切换按钮
3）物镜切换按钮；
4）滤光块，DIC检偏器切换按钮
5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）；
6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）；
7）物镜复位；
8）物镜向下移动2毫米；
注意：
在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB控制器（显微镜示意图15位置）
右侧的电源开关打开。
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（二）明视场透射光操作要点
1）打开电源开关，并打开显微镜透射光卤素灯电源开关；
2）把滤色块移到空位；
3）把起偏器，检偏器移出光路；
4）把聚光器转盘切换到A状态；
5）检查柯勒照明（柯勒照明调节方法参看附录1）；
6）检查出光端口。
（三）微分干涉（DIC）操作要点
1）按照明视场透射光观察方法调节好显微镜；
2）把起偏器，检偏器移入光路；
3）按照相对应物镜将聚光器镜转盘转到相应N1/N2位置（请参见另外所附对照表）；
4）检查出光端口；
5）旋转起偏器，选择最佳显示效果。
（四）荧光观察操作要点
1）打开荧光电源稍待片刻至光源指示灯不闪；（打开约10min稳定，关闭需要超过15min
后才可以再次启动）
2）确认透射光开关处于关闭状态；
3）检查出光端口；
4）选择合适的滤色块；
5）打开光闸（汞灯面板的shutter旋钮），调节荧光亮度（汞灯面板的ND旋钮），进行观察；
6）不观察时，把光闸关掉，以避免荧光淬灭。
注意：
该系统配置透射和荧光光闸，在做相应操作时，应将对应光闸打开。
光闸开关可在遥
控器上设定。
落射光照明
光闸按钮
透射光光闸
按钮
汞灯光闸按钮
（电动型号）
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显微镜光路调节和照明注意事项
（一）柯勒照明的调节方法
1）选择10X物镜；
2）调焦，使标本清晰成像；
3）缩小视场光阑（显微镜视图2位置）；
4）上下调节聚光器（显微镜视图3位置），使视场光阑边缘清晰；
5）调节聚光器对中旋钮，使其居中；
6）放大视场光阑，使其刚刚外切于视野。
（二）长寿命汞灯电源的注意事项
1）电源打开以后，大约10分钟左右光源达到稳定状态；
2）电源关闭以后，至少要等10分钟才能重新打开。
（三）物镜盖玻片矫正环的调节方法
1）调焦，使图像相对最清楚；
2）把矫正环向一个方向转动一定角度，此时图像变模糊，调焦，使图像相对最清楚；
3）判断此时的图像质量是否有所改善。
如有改善，则按照该方向再旋转一定角度；如质量
下降，则反方向旋转；
4）重复2）和3）直到图像质量改善之后又有所下降；
5）反方向旋转，回到倒数第二次的位置即可。
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Ti-E物镜，DIC插片，DIC棱镜对照表
Ti-E:
CombinationsofobjectiveandDICprism
ObjectiveDICSliderN1/N2
PlanApo10×10×N1
PlanApoVC20×20×N2
PlanApo40×40×ⅠN2
PlanApoVC60×60×IN2
PlanApoVC100×100×IN2
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第二章共聚焦开关机操作指南
（1）Ti-E电动倒置荧光显微镜；
（2）A1共聚焦显微镜总控制器；
（3）A1共聚焦显微镜光谱探测模块
（4）A1共聚焦显微镜标准4通道探测模块；
（5）A1共聚焦显微镜扫描头；
（6）A1共聚焦显微镜4激光台；
（7）A1共聚焦显微镜激光器电源柜；
（8）A1共聚焦显微镜透射光探测器；
注意：
开机时，必须是先打开硬件（包括显微镜，激光器，共聚焦总控制器），再打开NIS-Elements
软件；关机时，必须是先关掉软件，再关掉硬件。
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（一）A1R-si开机顺序
1.打开UPS或接线板总电源开关（一般都处于开机状态）；
2.打开需要使用的激光器，不使用的激光器可以不打开（具体见后面）；
3.打开共聚焦控制器左侧面板右上角的控制器开关；
4.依次打开电脑，显微镜的长寿命汞灯电源，卤素灯电源，电动载物台控制电源；
5.打开显微镜底座右后端的HUB控制部件电源；
6.待确认控制器打开的状态下，双击桌面NIS-Elements3.0快捷图标，选择NikonA1/C1
confocal选项进入软件，开始共聚焦操作。
（二）A1R-si关机顺序
1.请先确认关闭软件，再关闭共聚焦控制器（此条请特别注意）；
2.依次关闭显微镜各个控制部件电源；
3.依次关闭各个激光器之后，关闭激光器电源总开关；
4.关掉UPS或接线板总开关（遇到如停电等特殊情况时进行此步骤）。
（三）激光器的开关机顺序
各个激光器的开关是独立的。
下面分别加以介绍：
首先要打开激光器电源盒前面钥匙旋钮，然后根据需要打开相应的激光器。
（1）640nm激光器电源操作面板
开机：
电源开关拨到ON位置--钥匙开关拨到I位置;
关机：
钥匙开关拨到O位置--电源开关拨到OFF位置
（2）405nm激光器电源操作面板
开机：
电源开关拨到ON位置--钥匙开关拨到I位置;
关机：
钥匙开关拨到O位置--电源开关拨到OFF位置
（3）488nm多线Ar离子激光器
开机：
确认开关○5处于Standby位置后，将钥匙开关○6转到on位置，这时风扇开始
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转动--大约30秒后，液晶面板会有数字显示17左右--把左侧开关○5由standby拨到
operate，液晶面板显示数值40左右，打开完成；
关机：
把左侧开关由run拨到standby--3a上的钥匙开关转到垂直位置--等几分钟，
待风扇停止转动之后，把电源开关拨到OFF位置。
（4）543nm激光器（开关内置在激光底座电源中）
注意：
多线Ar离子激光器功率较高，请务必按照操作步骤开关机，否则会造成该激光器
使用寿命的缩短，并有可能导致激光器的损坏。
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第三章共聚焦图像拍摄
（一）NIS-ElementsC软件开启和操作界面简介
1．1打开和关闭CameraSettings窗口
当NIS-Elements启动时，CameraSettings窗口自动打开；随着NIS-Elements关闭而自动关闭。
1.1.1启动CameraSettings窗口
双击NIS-Elements图标。
图1.1-1NIS-Elements图标
硬件首先进行初始化，桌面上出现[Nowinitializing]对话框。
硬件初始化结束后，该对话框自动关
闭。
图1.1-2Now-Initializing对话框
当硬件初始化结束后，弹出NIS-Elements标题窗口；标题窗口自动关闭后，NIS-Elements启动运
行。
随即CameraSettings自动打开。
该窗口也可以通过View菜单下Acquisition栏里找到。
图1.1-3标题窗口
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图1.1-4初始状态的NIS-Elements窗口和CameraSettings窗口
1.1.2关闭CameraSettings窗口
NIS-Elements关闭时，CameraSettings也自动关闭。
1.2CameraSettings窗口结构
CameraSettings是用于设置共聚焦扫描参数的窗体，主要包括：
设定激光光源和强度、调整图像
亮度、光刺激设定、扫描方法、扫描精度／速度等。
图1.2-1CameraSettings窗体
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表1.2-1CameraSettings窗体功能列表
功能名称功能描述
捕捉实时（live）图像，拍摄图像或应用光刺激设置。
（１）图像获取
此类型的功能均以按钮的形式呈现。
用于共振扫描模式与检流计式扫描模式的切换。
当处于实（２）扫描模式选择
时（live）捕捉状态下时，扫描模式不能更改。
在光谱探测（SpectralDetector）模式和虚拟滤色片（Virtual
Filter）模式下，只有检流计式扫描模式可用，因此不能改
变扫描模式。
用于设置探测通道系列和光路设定。
（３）滤色块和染料
图像获取画面用于设定PMT亮度、激光功率和针孔大小。
（４）图像获取／光刺激设定
光刺激画面中设置用于刺激的激光的功率。
（５）扫描参数设置选取扫描方法、精度、速度等。
用于标识当前处于遥控器控制下的通道。
（６）遥控器选择图标
1.3NIS-Elements的操作界面
（1）主菜单栏；
（2）上图标工具栏；（3）左图标工具栏；（4）窗口排布选择；（5）控制窗口边栏；
（6）图像显示区域；（7）状态栏
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上图标工具栏和左图标工具栏图标介绍：
Open：
打开文件Redo：
还原一步撤销的操作
Save：
保存当前文件LiveFast：
快速预览
Savenext：
将当前文件保存为新文件ZStackLive：
Z轴序列预览
Print：
打印Integrate：
叠加，多次拍摄图像累积
Undo：
撤销前一步操作Average：
平均，多次拍摄图像平均
RAMBufferON：
打开内存拍摄CapturetoRAMBuffer：
拍摄存至缓存
BackgroudCorrectionON：
打开背景校正CaptureMultichannel：
拍摄多通道
OpticalConfigurations：
打开光路配置设定CaptureMultipoint：
拍摄多点
NewOpticalConfiguration：
创建光路配置Copy：
复制
PointingTool：
指针按钮PasteAsNewImage：
粘贴复制图像
MagnifierGlass：
图像放大工具Crop：
剪切
Annotations&Measurement：
注释和测量RunMacro：
执行宏命令
BinaryToolbar：
二元蒙板编辑工具CloseAll：
关闭全部窗口
Define/RunExperiment：
打开多维拍摄窗口GeneralOption：
打开设置窗口
CaptureTimeLapse：
拍摄时间序列CustomizeToolbar：
自定义工具栏
CaptureZSeries：
拍摄Z轴序列
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控制窗口介绍：
NIS-ElementsAR软件所有控制窗口均可以在主菜单栏View菜单下找到，或者在图像显示区
域点击鼠标右键弹出。
Acquisition：
AVIAcquisition：
AVI拍摄NDAcquisition*：
多维图像拍摄
AutoCaptureFolder：
自动拍摄存储文件Nosepiece*：
物镜转盘控制
夹
MicroscopeControlPad*：
显微镜控制面
CameraSettings*：
相机设定
板
CaptureFRETImage*：
拍摄FRET图像XYZNavigation*：
XYZ导航
FiltersandShutters*：
滤色块和光闸控制ZSeries*：
Z轴序列
Lamp*：
光源控制
Visualization:
BinaryLayers：
二元蒙板层编辑Preview：
预览窗口
Histogram：
柱状图Synchronizer：
窗口同步器
LUTs:
LUTsXYOverview*：
XY预览
OpenedImages：
已打开图像
Analysis:
AnnotationsandMeasurements：
注释和测量
AutomatedMeasurement：
自动测量
AutomatedMeasurementResults：
自动测量结果
BinaryToolbar：
二元蒙板编辑工具ROIStatistics：
ROI统计
Colocalization：
共定位分析RTDeconvolution*：
实时反卷积
EDFZ-Profile*：
Z序列景深扩展Thresholding：
阈值分析
IntensityProfile：
光强分析TimeMeasurement：
时间测量
ObjectCount*：
目标计数Tacking*：
轨迹分析
ObjectClassifier*：
目标分类VolumeMeasurement：
体积测量
PixelClassifier：
像素分类
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（二）NIS-ElementsC的Live图像获得基本操作
本章介绍通过CameraSettings窗体来获取实时（live）图像的基本方法。
在进行共聚焦拍照
前,请将Ti光路设定到A1模式（左端口光路输出,滤色块位置空）。
2.1获取实时（live）图像与扫描区域的设定
1选择扫描模式
选择共振[Resonant]或检流计式[Galvano]扫描方式。
（A1R系统同时含有此2种扫描模式）
图2.1-1选择扫描模式
在光谱探测（SpectralDetector）模式和虚拟滤色片（VirtualFilter）模式下，只有检流
计式扫描模式可用，因此不能改变扫描模式。
2设定光路（Opticalpath）配置
1）打开光路配置窗口
点击“滤色片和染料”画面中的[Setting]按钮。
关于光路（Opticalpath）设置的详细说明，参见探测模式的章节中关于“滤色块和染
料”的部分
图2.1-2滤色片和染料画面
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图2.1-3光路（opticalpath）配置窗口
2）选择探测模式（探测器）
[DU4]：
标准探测器，[SD]：
光谱探测器，[VF]：
虚拟滤色片，[VAAS]：
VAAS（虚
拟光阑系统）（后面3种模式在安装了相关硬件时显示）
图2.1-4选择探测器
3）激活自动光路配置
点击自动[Auto]按钮
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图2.1-5选取自动模式
4）为各个通道选择被观察的染料
从下拉列表中为每一个需要使用的通道选择一个染料。
选择染料后，系统将自动为
该通道选择合适的激光波长和二向色镜。
图2.1-6选择荧光染料
5）选择所要使用的通道
在需要使用的通道对应的复选框上打勾。
图2.1-7选择通道
6）选择是否使用透射探测器
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图2.1-8选择透射探测器
7）最后确认光路设置
点击[ok]按钮。
确认使用此光路配置，光路设置窗口关闭。
图2.1-9确认光路设定
3.应用扫描设置
通过扫描设置画面可以设定扫描参数。
具体设置方法参见后文，“扫描设置窗口”。
图2.1-10扫描设置画面
4．获取实时图像
点击[Live]按钮可以捕获实时图像。
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图2.1-11获取实时图像
图2.1-12实时图像
5．调整实时图像的亮度
可以通过图像获取画面来调整各个通道的亮度。
参见下一节探测模式中关于“图像获取窗口”
的部分内容。
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图2.1-13图像获取画面
6．设置扫描区域
设定扫描区域，详见第9章“导航窗口（Navigationwindow）”。
1）将实时窗口（livewindow）切换成导航窗口，点击[ShowScanArea]按钮
图2.1-14从实时窗口切换成导航窗口
图2.1-15选择扫描设定工具
2）选择需要使用的扫描区域设置工具。
关于扫描设定工具的详细用法请参见“关于扫描区域”
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2.1-16设置扫描区域
3）利用所选择的工具进行扫描区域的设定。
7．在所选择的区域中获取实时窗口
1．把导航窗口切换回实时窗口，点击[ShowScanArea]
图2.1-17从导航窗口切换回实时窗口
2．获取所设定扫描区域的实时图像，点击[Live]按钮。
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图2.1-18获取实时图像
图2.1-19更改扫描区域后的实时图像
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（三）图像拍摄
图像获取窗口主要用于显示实时图像，拍摄图像或是运行光刺激条件。
NIS-Elements中的相
应功能在此都用按钮表示。
3．1图像获取画面中的主要功能
图3.1-1图像获取窗口
表3.1-1图像获取窗口的功能列表（表单1/3）
NameFunction
用于显示活动图像。
活动图像窗口自动打开并显示活动图像。
所谓活动图像就是当前显
（1）Live按钮
微镜上观察的实时图像。
用于拍摄当前活动窗口所对应的正式图像。
当进行拍摄时，会新弹出一个独立于活动图
（2）XY按钮
像的窗口。
用xy功能拍摄的图像是对活动图像重新扫描后生成的静态图像。
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表3.1-1图像获取窗口的功能列表（表单2/3）
NameFunction
打开[CaptureZ-Series]对话框。
用拍摄三维（X-Y-Z）图像。
关于此处的操作请参见附件一。
（3）XYZ按钮
图3.1-2拍摄Z-Series对话框
中的描述。
也可以通过下述方法实现XYZ功能：
在主菜单中选[Acquire]然后依次选取
[CaptureZ-Series]->[CaptureZ-SeriesAutomatically...]
打开[CaptureTimelapse]对话框。
用于拍摄二维（X-Y）时间序列图像。
关于此处的操作请
参见附件一。
（4）XYTime按钮
图3.1-3拍摄时间序列对话框
中的描述。
也可以通过下述方法实现XYTime功能：
在主菜单中选[Acquire]然后依次选取
[CaptureTimelapse]->[CaptureAutomatically...]
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表3.1-1图像获取窗口的功能列表（表单3/3）
NameFunction
（5）XYZTime按钮打开[NDAcquisition]对话框。
用于拍摄三维（X-Y-Z）时间序列图像。
关于此处的操作请参见附
件一。
图3.1-4多维（ND）拍摄对话框
（6）PhotoActivation打开[PhotoActivation]对话框。
用于设定光刺激观察模式。
根据CameraSettings窗口设置条件
按钮的不同会打开不同的对话框。
普通光刺激模式同时光刺激模式
（检流计式扫描）（共振扫描）
图3.1-5光刺激对话框
也可以通过下述方法实现PhotoActivation功能:
-普通光刺激模式
在主菜单中选[Applications]然后依次选取[Define/RunSequentialStimulation...]
–同时光刺激模式
在主菜单中选[Applications]然后依次选取[
升级会员 