细胞免疫组化常用试剂配制.docx
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细胞免疫组化常用试剂配制
免疫细胞化学常用试剂
一、固定剂
大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质〔蛋白质或肽类〕的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂〔或固定方法〕以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液〔pH7.3〕
试剂：
多聚甲醛 40g
0.1mol/L磷酸缓冲液 至1000ml
配制方法：
称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml0.1mol/L磷酸缓冲液〔PhosphateBuffer以下简称PB〕，加热至60℃左右，持续搅拌〔或磁力搅拌〕使粉末完全溶解，通常需滴加少许1nNaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠
试剂：
A液：
多聚甲醛 40g
蒸馏水 400ml
蒸馏水 300ml
蒸馏水 200m
配制方法：
A液最好在500ml的三角烧瓶中配制〔方法同前〕，至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量防止吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1nNaOH或1NHCl将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin’s液及改进Bouin’s液
试剂：
饱和苦味酸
40%甲醛 250ml
冰醋酸 50ml
配制方法：
先将饱苦味酸过滤，加入甲醛〔有沉淀者禁用〕，最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改进Bouin’s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。
但因偏酸〔pH为3～3.5〕，对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。
此外，操作时，应防止吸入或与皮肤接触。
4．Zamboni’s（Stefanini’s）液
试剂：
多聚甲醛 20g
饱和苦味酸 150ml
Karasson-Schwlt’sPB 至1000ml
配制方法：
称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’sPB至1000ml充分混合〔Karasson–Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后〕。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。
固定时间为6～18h。
5．PLP液 PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液〔Periodate-Lysine-paraform-alde－hydefixative〕
试剂：
过碘酸钠
赖氨酸盐酸盐〔或盐酸赖氨酸〕：
多聚甲醛
蒸馏水
配制方法：
〔1〕贮存液A〔0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/lNa3PO4,pH7.4〕：
称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300mOsmmol/L/kg。
〔2〕贮存液B〔8%多聚甲醛溶液〕：
称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液〔方法见前〕。
过滤后4℃冰箱保存。
〔3〕临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠〔NaIO4〕，使NaIO4终浓度为2%。
由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。
固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为，最正确的混合是：
含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky’s液〔pH7.3〕
试剂：
多聚甲醛 30g
25%戊二醛 80ml
0.1mol/LPB 至1000ml
配制方法：
先将多聚甲醛溶于0.1mol/LPB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7．0.4%对苯醌〔Parabenzoquinone〕
0．01mol/LPBS 1 000ml
配制方法：
称取4.0g对苯溶于1000ml0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。
一般要求临用前配制，且防止加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。
此外，对苯醌有剧毒，使用时防止吸入或与皮肤接触。
8．PFG液〔Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehydefixative,PFG〕
试剂：
对苯醌 20g
多聚甲醛 15g
25%戊二醛 40ml
0.1mol/L二甲酸钠缓冲液 至1000ml
配制方法：
先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。
9．碳二亚酰胺-戊二醛〔ECD-G〕液
试剂：
0.05mol/LPB 500ml
0.01mol/LPBS 500ml
Tris 约14g
浓HCl 少许
ECD 10g
配制方法：
先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris〔使其终浓度为1.4%〕溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞〔经PBS漂洗过〕的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3（3-dimethyl-aminoprpyl）-carboi－imidehydrochloride]，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。
ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。
目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
10．四氧化锇〔锇酸OsmicAcid,OsO4〕
配制：
将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。
也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。
为保证充分溶解，应在用前几天配制。
〔1〕2%OsO4水溶解：
取OsO41g溶于重蒸水中。
此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。
〔2〕1%OsO4-PB：
C、5.4% 葡萄糖 5ml
配制方法：
先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5mlC液混合即为0.12mol/LPBG。
〔3〕1%OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液〔pH7.2～7.4〕：
试剂：
2%OsO4水溶液 10ml
0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液〔pH7.2～7.4〕 10ml
配制方法：
取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。
OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。
尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。
过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。
但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。
以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。
关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精〔含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等〕，这些溶液都能促使蛋白质凝固。
它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。
总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用〔但Zenker-Formalin可进行短时的固定〕。
目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：
用4℃的Karnovsky’s液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。
对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamboni’s液等混合固定液。
二、缓冲液
免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。
在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。
1．0.2mol/L（pH7.4）磷酸盐缓冲液〔PhosphateBuffer,PB〕
试剂：
NaH2PO4·2H2O
Na2HPO4·12H2O
配制方法：
配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液〔PB〕，根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
〔1〕0.2mol/L的Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2o31.2g（或NaH2PO4·H2O27.6g）加重蒸水至1000ml溶解。
〔2〕0.2mol/L的Na2HPO4：
称取NaHPO4.·12H2o71.632g〔或Na2HPO4·7H2O53.6g或Na2HPO4·2H2o35.6g〕加重蒸水至1000ml溶解。
〔3〕0.2mol/LpH7.4的PB的配制：
取19ml0.2mol/L的NaH2PO4和81ml0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB〔pH约为7.4～7.5〕。
假设pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水〔PhosphateBufferedSaline,PBS〕
试剂：
0.2mol/LPB 50ml
NaCl 8.5～9g（约0.15mol/L）
重蒸水 至1000ml
配制方法：
称取NaCl8.5～9g及0.2mol/L的PB50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。
假设拟配制0.02mol/L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推。
PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，否则需要调整。
0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。
一般情况下，0.2mol/lPB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可到达要求的pH值，假设需调整pH，通常也是调PB的pH。
3．Karasson–Schwlt’s磷酸盐缓冲液
重蒸水 至1000ml
配制方法：
同前
该缓冲液主要用于配制Zamboni’s固定液。
4．0.5mol/LpH7.6的Tris-HCl缓冲液。
1NHCl 约420ml
重蒸水 至1000ml
配制方法：
先以少量重蒸水〔300～500ml〕溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至1000ml。
此液为储备液，于4℃冰箱中保存。
免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，用时取储备液稀释10倍即可。
该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水〔TBS〕、DAB显色液。
5．Tris缓冲生理盐水〔TrisBuffered,Saline,TBS〕
试剂：
0.5mol/LTris-HCl缓冲液 100ml
NaCl 3.5～9g（0.15mol/L）
重蒸水 至1000ml
配制：
先以重蒸水少许溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。
TBS主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。
6．Tris-TBS（PBS）
试剂：
TritonX-100 10ml（1%）或3ml（0.3%）
0.5mol/LTris缓冲液〔pH7.6〕 1000ml（50ml）或（0.2mol/L的PB）
NaCl 8.5～9g
重蒸水 至1000ml
配制方法：
先以重蒸水少许溶解NaCl后，加入TritonX-100及Tris缓冲液或〔PB〕，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。
该液常用浓度为1%及0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。
7．0.1mol/L〔pH7.4〕二甲胂酸缓冲液
试剂：
0.2mol/L二甲胂酸钠 500ml
0.1NHCl 28ml
蒸馏水 至1000ml
配制方法：
先称取二甲胂酸钠〔MW：
214〕42.8g,加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液；再取HCl1.7ml加蒸馏水至1000ml,配成0.1N，最后取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1nHCl28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。
8．几种常用的不同pH值缓冲液的配制表
〔1〕0.2mol/L磷酸盐缓冲液〔pH5.7～8.0〕
pH
0.2mol/LNaH2PO4（ml）
0.2mol/LNa2HPO4（ml）
（2）0.05mol/LTris-HCl缓冲液〔pH7.19～9.10〕
pH
0.2mol/LTris（ml）
0.2mol/LHCl（ml）
H2O
（3）0.2mol/L醋酸盐缓冲液〔pH3.6～5.6〕
pH
0.2mol/L醋酸〔ml〕
0.2mol/L醋酸钠〔ml〕
（4）0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液〔pH5.0～7.4〕
pH
0.2mol/L二甲胂酸钠〔ml〕
0.2NHCl（ml）
蒸馏水
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
注：
HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。
〔5〕0.2mol/L碳酸盐缓冲液〔pH9.2～10.7〕
pH
0.2mol/LNa2CO3（ml）
0.2mol/LNaHCO3（ml）
三、显色液
免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。
常用的显色液有：
1．DAB〔Diaminobenzidine〕显色液
DAB即3，3-二氨基苯联胺
试剂：
DAB〔常用四盐酸盐〕 50mg
0.05mol/LTB 100ml
30%H2O2 30～40μl
配制方法：
先以少量0.05mol/L（pH7.6）的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。
DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法〔如酶标法、PAP法等〕，其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。
但有几点需注意：
DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量防止与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
2．4-氯-1-萘酚〔4-Cl-1-Naphthol〕显色液
配方1：
4-Cl-1-萘酚 100mg
纯乙醇 10ml
0.05mol/LTB（pH7.6） 190ml
30%H2O2 10μl（0.003%）
配制方法：
先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb19ml，用前加入30%H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。
配方2：
4-Cl-1-萘酚
N-二甲基甲酰胺〔DMF〕
0.05mol/LTB（pH7.6）
30%H2O2
配制方法：
先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入组织标本〔注意：
温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀〕。
显色时间通常为5min左右。
4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。
多数认为最好去除白色沉淀〔如上述〕，但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。
由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。
3．3-氨基-9-乙基卡唑〔3-amino-9-ethylcarbozole,AEC〕显色液
试剂：
AEC 20mg
0.05mol/L醋酸缓冲液〔pH5.5〕 50ml
30%H2O2 25ml
配制方法：
先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。
临显色前，加入30%H2O2。
切片显色时间为5～20min。
该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。
由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。
4．TMB显色液
试剂：
TMB
HCl
亚硝基铁氰化钾
无水酒精
配制方法：
〔1〕醋酸盐缓冲液：
取1.0mol/L的HCl190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。
〔2〕A液：
取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。
〔3〕B液：
称取5mgTMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
〔4〕孵育液：
放入标本前数秒，取2.5mlB液及97.5mlA溶于试管中充分混合。
〔液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染〕。
酶反应时，加入终浓度为0.005%的H2O2。
〔5〕主要显色步骤：
组织标本在蒸馏水〔或PBS〕中漂洗数次〔每次约10～15min〕后放入未加H2O2的孵育液中作用20min〔19℃～30℃〕，然后向孵育液中放入H2O2〔每100ml孵育液中加0.3%的H2O21.0～5.0ml〕继续孵育液20min左右〔19℃～23℃〕，捞出标本漂洗数次〔共30min左右〕。
在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴片、脱水，封片。
也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁〔pH3.3～3.5〕中负染5min后贴片、脱水、封片。
TMB即四甲基联苯胺〔Tetrabenzidine〕是一
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