1正交模拟法研究护骨胶囊各单味药及复方药效贾欢欢.docx

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1正交模拟法研究护骨胶囊各单味药及复方药效贾欢欢

正交模拟法研究护骨胶囊各单味药及复方药效

贾欢欢1，高建林1，陈珺1，卢丽1，陆幸妍1，杨国柱1，

曾雯2，秦中华2，李英彬1，万超3，李青南1*

（1.广东药学院，生命科学与生物制药学院，新药功能研究中心，广州510006;2.东莞万成制药有限公司，广东东莞523040;3.香港中文大学医学院，生物医学学院，干细胞与再生医学中心，香港）

［摘要］目的:

应用正交模拟法分析护骨胶囊（HG）各药味对该复方药效的贡献值，并对该方不同组合的复方进行药效模拟。

方法:

采用正交模拟法，将HG10个药味按照设计的正交表分为13个组（第13组为阴性对照组），通过血清药理学实验得出相应含药血清，采用CCK-8法检测各组血清对成骨细胞（Ob）增殖的影响。

DAS3.0软件处理数据，分析各药味的药效贡献值并对复方药效进行模拟。

结果:

以Ob增殖为指标，经正交模拟法分析，确定HG各药味在复方中的药效贡献值顺序为:

淫羊藿＞骨碎补＞巴戟天＞山药＞龟甲＞当归＞熟地黄＞续断＞杜仲＞制首乌;以Ob增殖为指标，对复方药效进行模拟研究，结果显示27个模拟组方预测药效值明显优于阴性对照组，而且原方最好，4个模拟组方接近于原方。

结论:

正交模拟法分析HG，确定了HG各药味在复方中的药效贡献值，并发现多个组方的模拟药效与原方接近。

［关键词］正交模拟法;护骨胶囊;成骨细胞;药效贡献值;模拟药效

［中图分类号］R285.5［文献标识码］A［文章编号］1005-9903（2011）15-0161-05

PharmacodynamicContributedValuesofCompositionandPharmacodynamic

SimulationofCompoundHuguCapsulesbyOrthogonalSimulationMethod

JIAHuan-huan1，GAOJian-lin1，CHENJun1，LULi1，LUXing-yan1，YANGGuo-zhu1，ZENGZhao-li2，ZENGWen2，QINZhong-hua2，LIYing-bin1，WANChao3，LIQing-nan1*

（1.SchoolofLifeScienceandPharmacopedia，GuangdongPharmaceuticalUniversty，Guangzhou510006，China;

2.DongguanWanchengPharmacopediaCompanyLimited，Dongguang523040，China;

3.ConterofStemCellandRegenerativeMedicine，SchoolofBiomedicalSciences，FacultyofMedicine，TheChineseUniversityofHongKong，Shatin，HongKongSAR，China）

［Abstract］Objective:

ToanalysispharmacodynamiccontributedvaluesofcompositionandpharmacodynamicsimulationofcompoundHugucapsules（HG）．Method:

TencomponentsofHGweredividedinto13groups（group13fornegativecontrolgroup）byorthogonalsimulationmethod，thedrugserumwasgottenbytheserumpharmacologicalexperimentsandCCK-8methodwasadoptedtodetectosteoblast（Ob）proliferation．PharmacodynamiccontributedvaluesandpharmacodynamicsimulationofcompoundwereanalysisbyDAS3.0software．

Result:

TheproliferationofObasaindex，asequenceofpharmacodynamiccontributedvalueswerefoundbyorthogonalsimulationmethod:

EpimediiFolium＞DrynariaeRhizoma＞MorindaeOfficinalisRadix＞DioscoreaeRhizoma＞TestudinisCarapaxetPlastrum＞AngelicaSinensisRadix＞RehmanniaeRadixPraeparata＞DipsaciRadix＞EucommiaeCortex＞PolygoniMultifloriRadixPraeparataMultiflorumF．WithObproliferationastheindex，andtheresultsofpharmacodynamicsimulationofcompoundshowedthat27compoundswerebetterthanthenegativecontrolgroup，andtheoriginalcompoundisthebestineffect，theotherfourcompoundsareclosetotheoriginalcompound．Conclusion:

OrthogonalsimulationmethodisamethodtoanalyzetheChineseherbalcompound．Thisapproachcandeterminepharmacodynamiccontributedvaluesofcomposition，andpharmacodynamicsimulationofcompoundforHG．ThemethodcanprovidealotofinformationforstudyingChineseherbalcompound，andisbenefitfordevelopingnewdrug．

［Keywords］orthogonalsimulationmethod;Hugucapsules;osteoblast;pharmacodynamiccontributedvalues;simulationefficacy

护骨胶囊（HG）是在中医理论指导下形成的国家中药新药（新药证书国药准字Z20040106），临床研究表明其有很好的防治原发性骨质疏松症的作用［1］，但是临床反馈老年人用药量略微偏大，10%的患者认为药性略微偏燥。

为改善这些不足，本文采用正交模拟法［2-3］分析HG各药味对该复方药效的贡献值，并对该方不同组合的复方进行药效模拟。

该方法采用现代数理统计实验设计方法及计算机技术，可确定各组分对复方药效的影响，排列其重要程度，并可以对不同组合的效应进行预测。

采用此方法使实验设计与研究更具合理性和科学性，并以最少的实验次数得出尽可能最佳的实验结果［4］，提高了实验的效率。

1材料

1.1动物2月龄SD大鼠26只，雌雄各半，体重（200±10）g，合格证号0074494及0074528;出生24h内的SD大鼠3只，合格证号SCXK（粤）2008-

0020，雌雄兼用，每只约15g。

均由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.2药材及试剂护骨胶囊10味原药材（东莞万成制药有限公司，批号均为20100801），DMEM高糖培养基（Gibco公司，批号709791）、0.25%胰酶溶液

（中国医学科学院生物医学工程研究所，批号20100929），胶原酶Ⅰ（Invitrogen公司，批号201108），PBS缓冲液（杭州吉诺生物医药技术有限

公司，批号20100914），β-甘油磷酸钠（Sigma公司，批号BCBB4821），L-维生素C（Sigma公司，批号037K02501），地塞米松（Sigma公司，批号100827），CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号C0038），碱性磷酸酶（AKP）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100630）。

1.3仪器台式多管低速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司，型号TDZ5-WS）;酶标仪（Bio-Rad公司，型号MicroplateReader680）;倒置生物显微镜

（深圳拓天仪器设备有限公司，型号J-D200）;二氧化碳培养箱（RSBiotech公司，型号Galaxy）;恒温水浴锅（中国姜堰市天力医疗器械有限公司，型号

TL420D）等。

2方法

2.1护骨胶囊原方组成见表1。

表1护骨胶囊原方组成

药味编号

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

药味

淫羊藿

巴戟天

骨碎补

杜仲

续断

制何首乌

熟地黄

龟甲

当归

山药

剂量/g

277.5

277.5

277.5

277.5

277.5

347.5

347.5

208.5

208.5

277.5

2.2优化组方分组及给药剂量HG10个组分A，B，C，D，E，F，G，H，I，J按表2进行设计，组成13个组方，每个组方加8倍量水浸泡1h，分两次煎煮，第一煎武火60min，第二煎文火30min［5］。

将两次粗虑的药液合并，抽滤，收集滤液，最后浓缩到0.1g·mL－1。

每组2只大鼠给药，雌雄各半。

按0.2mL·

kg－1进行ig，每天1次，连续7d。

根据护骨胶囊人的服用量计算出护骨胶囊原药材的大鼠给药量，采用标准动物的等效剂量折算系数法［6］，可以折算出

每组大鼠的给药量，其计算方法为:

大鼠给药剂量（g·kg－1）=人的临床剂量（g·kg－1）×70kg×0.018/0.2kg=6.3×人的临床剂量（g·kg－1）。

其中0.018为折算系数;人体重按70kg计算，大鼠体重按0.2kg计算。

HG人的临床给药量1天为:

0.476g·kg－1。

计算结果见表3。

其中阴性对照组13大鼠ig0.9%的生理盐水。

2.3含药血清制备最后1次ig后1h心脏取血，将大鼠血3000r·min－1离心10min，取血清，每组血清混匀，于56℃水浴30min灭活，－20℃保存。

配制时采用0.22μm的微孔滤膜过滤，与无血清的DMEM配成10%的含药血清培养基。

表2正交设计

配伍组号

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

2

1

1

1

2

2

2

2

2

2

1

3

1

1

2

2

1

2

1

2

1

2

4

1

2

2

1

2

1

1

2

2

1

5

1

2

2

2

1

1

2

1

2

2

6

1

2

1

1

2

2

2

1

1

2

7

2

1

1

2

2

1

1

1

2

2

8

2

1

2

1

2

1

2

2

1

2

9

2

1

2

1

1

2

2

1

2

1

10

2

2

1

1

1

2

1

2

2

2

11

2

2

1

2

1

1

2

2

1

1

12

2

2

2

2

2

2

1

1

1

1

13

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

注:

1水平代表用药，2水平代表不用药。

表3各组具体给药剂量

配伍组号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

给药剂量/g·kg－1

3.0

1.2

1.5

1.6

1.2

1.4

1.6

1.2

1.5

1.3

1.5

1.2

0.0

2.4成骨细胞（osteoblasts，0b）培养出生24h内的SD大鼠，75%乙醇浸泡15min，无菌取头盖骨，PBS液中刮去结缔组织及骨膜，直至骨头发白，重复清洗3次，用2%的胶原酶Ⅰ消化，形成原代成骨细胞。

用含10%FBS的DMEM在37℃，5%CO2条件下培养成骨细胞，3d后更换培养基。

待细胞长到大概培养皿90%以上进行传代［7］。

2.5细胞增殖实验将对数生长期的细胞胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清培养基稀释至1×104/mL。

混匀接种于96孔培养板中，每孔100μL细胞液，3

7℃，5%CO2培养箱中培养1d。

而后吸去旧培养基，加入配制的10%含药血清培养基，37℃，5%CO2培养箱中培养2d。

2d后向每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续在37℃，5%CO2培养箱中培养1h，用酶标仪在470nm测定吸光度（A）［8］。

2.6数值分析本实验用正交模拟法对HG进行研究，采用2个水平考察，1水平为“使用该药”，2水平为“不使用该药”;用双向单侧t检验分析各组分

在复方中的重要程度;提出了复方药效学模型。

此法可确定各组分对复方药效的贡献值，排列其重要程度，并可对不同组合的复方进行药效模拟［3］。

所有实验数据以珋x±s表示。

方差分析、双向单侧t检验，药效预测，均由DAS3.0软件完成。

3结果

3.1Ob鉴定

3.1.1形态学观察原代细胞贴壁前呈均匀一致的球形，24h左右开始贴壁，72h完全贴壁，并且胞浆伸展，呈饱满的多角形。

10d之后出现细胞融合，

大多呈立方体形。

3.1.2碱性磷酸酶（AKP）检测条件培养基可以诱导头盖骨骨髓间充质干细胞转化为成骨细胞，以AKP试剂盒检测，发现使用条件培养基培养细胞的上清液A值0.1640±0.003，明显高于使用普通培养基的A值0.0343±0.0021（P＜0.05）。

3.2HG模拟组方对成骨细胞增殖的影响与阴性对照组（第13组）比较，第1组及第2组A值较高，有统计学差异（P＜0.05），且第1组A值明显高于

第2组。

见表4。

表4优化组方分组10%含药血清

培养成骨细胞2d后测470nmA（珋x±s，n=3）

配伍组号

A

RSD/%

1

0.8713±0.17231）

19.8

2

0.5680±0.06461）

11.4

3

0.4547±0.0193

4.3

4

0.4070±0.0225

5.5

5

0.4343±0.0340

7.8

6

0.4853±0.0274

5.7

7

0.4270±0.0142

3.3

8

0.3670±0.0050

1.4

9

0.3917±0.0133

3.4

10

0.3803±0.0206

5.4

11

0.3797±0.0084

2.2

12

0.3923±0.0155

4.0

13

0.4323±0.0504

11.6

注:

与阴性对照组（第13组）比较1）P＜0.05，RSD为相对标准差。

3.3药效学参数分析应用DAS3.0软件分析13个组的A值，比较各药味“用药”与“不用药”的药效变化，确定各药味的重要性，实为该组分对复方的贡

献值，反映各自重要程度［3］。

见表5。

由表5可以发现:

所有药物对Ob增殖均有加强的作用，其中D，F对Ob增殖作用不明显。

而且可以得出各味药对Ob增殖的影响大小，也是重要程度排序为:

A＞C＞B＞J＞H＞I＞G＞E＞D＞F，即:

淫羊藿A＞骨碎补C＞巴戟天B＞山药J＞龟甲H＞当归I＞熟地黄G＞续断E＞杜仲D＞制首乌F。

表5各组分对复方药效的贡献值ED

参数项

药效贡献值ED

相对标准误RSE

t

P

注释

E（0）

0.4323

0.0673

基线效应

E（A）

0.1410

0.1491

6.7060

0.0000

期望贡献值

E（B）

0.0974

0.2160

4.6300

0.0000

期望贡献值

E（C）

0.1073

0.1960

5.1010

0.0000

期望贡献值

E（D）

0.0426

0.4938

2.0250

0.0500

期望贡献值

E（E）

0.0455

0.4624

2.1630

0.0370

期望贡献值

E（F）

0.0375

0.5603

1.7850

0.0830

期望贡献值

E（G）

0.0519

0.4054

2.4670

0.0180

期望贡献值

E（H）

0.0733

0.2868

3.4870

0.0010

期望贡献值

E（I）

0.0573

0.3667

2.7270

0.0100

期望贡献值

E（J）

0.0758

0.2774

3.6050

0.0010

期望贡献值

3.4复方药效学模型评价复方药效预测（Epred）是在不含相互作用的期望效应（Eexp）基础上，考虑了药物间相互作用效应（Eint）及个体值与均值之间

随机波动（Erand）的综合结果［3］。

其计算公式为:

复方药效预测=期望效应+相互作用效应+随机波动应用DAS3.0软件对HG不同组合的复方进行药效模拟评价，通过药效预测值Epred发现，28个预测组中最小效应组合为组3（Epred:

0.4323），即阴性对照组;最大效应组合为组1（Epred:

1.162），即原方。

其次有4个组合的模拟药效值接近于原方:

组6（Epred:

1.0407）含8味药，减少了续断E、山药J;组8（Epred:

1.0436），含8味药，减少了杜仲D、山药J;组19（Epred:

1.0861）含9味药，减少了山药J;组23（Epred:

1.0060）含7味药，减少了杜仲D、制何首乌F、山药J。

结果见表6。

表6不同组方的药效预测值及其95%置信区间的模拟（

±s，n=12）

组别

组方方案

药效预测

95%置信下限

95%置信上限

1

A1B1C1D1E1F1G1H1I1J1

1.1620

1.0907

1.2332

2

F1

0.4699

0.4059

0.5339

3

A2B2C2D2E2F2G2H2I2J2

0.4323

0.3611

0.5036

4

A1C1D1E1F1G1

0.8581

0.7676

0.9486

5

G1H1I1

0.6149

0.5281

0.7016

6

A1B1C1D1F1G1H1I1

1.0407

0.9614

1.1199

7

B1C1D1E1F1G1I1

0.8718

0.7642

0.9794

8

A1B1C1E1F1G1H1I1

1.0436

0.9648

1.1223

9

A1B1D1E1F1G1

0.8482

0.7552

0.9411

10

A1B1C1E1G1I1

0.9327

0.8550

1.0103

11

B1C1D1F1G1I1

0.8263

0.7251

0.9276

12

B1C1D1E1F1H1

0.8359

0.7363

0.9355

13

A1B1C1D1E1H1I1

0.9967

0.9197

1.0737

14

A1C1D1E1G1

0.8206

0.7366

0.9045

15

A1C1D1F1G1I1

0.8700

0.7810

0.9589

16

A1C1D1H1I1

0.8539

0.7744

0.9334

17

A1C1D1F1G1H1

0.8860

0.7997

0.9722

18

A1B1C1D1E1

0.8661

0.7900

0.9421

19

A1B1C1D1E1F1G1H1I1

1.0861

1.0055

1.1668

20

A1B1C1E1F1G1

0.9129

0.8325

0.9932

21

A1D1E1F1G1H1I1

0.8815

0.7793

0.9836

22

C1D1E1F1G1H1I1

0.8478

0.7352

0.9603

23

A1B1C1E1G1H1I1

1.0060

0.9306

1.0815

24

A1B1C1D1F1H1I1

0.9888

0.9107

1.0669

25

B1C1E1F1H1I1

0.8507

0.7527

0.9486

26

A1B1C1D1E1G1I1

0.9753

0.8937

1.0568

27

A1B1C1D1E1F1G1

0.9555

0.8709

1.0400

28

B1D1E1F1G1H1I1

0.8378

0.7229

0.9528

4讨论

近年来，随着人口的老龄化，骨质疏松症已被列为国家重点攻关的老年三大疾病之一［9］。

中药护骨胶囊在治疗骨质疏松症方面已取得了一定的临床疗效，但该方临床反馈药性略微偏燥，用药量稍大。

为改善这些不足，本研究采用正交模拟法分析了HG10味药的多种配伍组合及各味药对复方的药效贡献值。

结果得出了HG各药味对复方药效的贡献值，并排列了其重要程度:

淫羊藿A＞骨碎补C＞巴戟天B＞山药J＞龟甲H＞当归I＞熟地黄G＞续断E＞杜仲D＞制何首乌F。

其中淫羊藿的药效贡献值远大于其他药味的贡献值，进一步证明了淫羊藿作为护骨胶囊君药的科学性。

本实验同时对不同组合的复方进行了药效模拟，发现28个预测组中最小效应组合为组3，即阴性对照组;最大效应组合为组1，即原方;其次有4个组合的模拟药效值接近于原方。

此结果为HG的组方优化提供了参考，如组方23去掉了杜仲D、制何首乌F和山药J，从我们的实验获得各组分贡献值的数据中，发现杜仲D、制首乌F对Ob增殖的贡献值是最小的（P＞0.05），