紫外吸收法测定蛋白质DNA浓度用户指导书.docx
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紫外吸收法测定蛋白质DNA浓度用户指导书
紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度
用户指导书
北京普析通用仪器有限责任公司
应用技术部
2004年7月
目录
前言：
1
1．蛋白质/DNA浓度测定的意义1
2．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理1
2.1紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理1
2.2紫外吸收法测定DNA浓度的基本原理2
3．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法2
3.1纯蛋白质浓度的测定方法2
3.2纯DNA浓度的测定方法4
3.3蛋白质/DNA混合溶液浓度的测定方法5
4．UVWin5.0软件包测定蛋白质/DNA浓度的使用方法7
4.1．启动DNA蛋白质测定功能7
4.2．设置测量参数8
4.3．处理测量结果9
5．影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素9
6．测定蛋白质/DNA浓度的其他应用方法简介11
前言：
本书将主要介绍紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理、方法以及在测定过程中的一些影响因素，并对其他一些使用化学试剂测定蛋白质/DNA的方法进行了讨论，旨在对用户测定蛋白质/DNA时有一定的指导意义。
1．蛋白质/DNA浓度测定的意义
“21世纪是生物科学的世纪”！
随着克隆羊的成功，随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。
在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等，而基因组学、蛋白质组学的最基本的研究单位就是蛋白质和DNA。
因此，蛋白质和DNA浓度的测定方法，成为生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
紫外吸收法是在不引入化学试剂的情况下，直接利用待测物质在紫外区的吸收性质，来测定其浓度的方法。
该方法因测量简单、快速，不需要试剂，更为重要的是它不破坏待测样品，因此越来越受到重视，并被广泛应用。
2．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理
2.1紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理
蛋白质为生物大分子，所产生的紫外吸收往往是其分子内的小基团所引起的，例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和肽键等等。
1．在蛋白质分子中，酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）残基的苯环含有共轭双键，该共轭双键对紫外光有吸收（其中最大吸收Tyr在274nm；Phe在257nm；Trp在280nm），从而导致该蛋白质对紫外光有吸收，且其吸光度值与这三种氨基酸的浓度相关，从而与蛋白质的浓度相关。
2．肽键对紫外光有吸收（其最大吸收在238nm），因此蛋白质溶液在238nm的光吸收值与其肽键含量成正比，从而与蛋白质溶液的浓度相关。
2.2紫外吸收法测定DNA浓度的基本原理
DNA也为生物大分子，所产生的紫外吸收也是其分子内的小基团所引起的，例如嘌呤碱、嘧啶碱等等。
嘌呤碱、嘧啶碱以及由它们参与组成的核苷、核苷酸及核酸（DNA&RNA）对紫外光都有强烈的吸收作用。
它们吸收紫外光的共同特点是在260nm处为最大吸收值。
3．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法
3.1纯蛋白质浓度的测定方法
1．280nm下的光吸收法
这是最常用的测定蛋白质浓度的紫外吸收法。
方法依据：
蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm附近具有最大吸收，而且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，所以很多蛋白的浓度与A280成正比。
测定方法：
测定蛋白质标准溶液在280nm处的吸收值A，以A对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在280nm处的吸收值A，通过标准曲线法计算出样品浓度。
方法的缺点：
（1）干扰物质较多，高浓度的盐（如NaCI）、含有共轭双键的有机溶剂、核酸都会对测量结果产生干扰。
因此本方法一般只适用于纯蛋白溶液（不含其他盐类或其他盐类浓度非常低）。
（2）目标蛋白与标准蛋白中所含上述三种氨基酸的含量差别较大时，测量结果将会产生大的偏差。
值得注意的是，目前该方法的应用已经非常广泛，很多蛋白在一定浓度和一定波长下的吸光度A值都有文献数据可查，因此将所测吸光度A值结合文献数据即可以计算出相应的蛋白质浓度。
2．肽键测定法（A238法）
蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比，故此法称为A238法。
（有时也可以使用A230法取代）
测定方法：
测定蛋白质标准溶液在238nm处的吸收值A，以A对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在238nm处的吸收值A，通过标准曲线法计算出样品浓度。
A238法比A280法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。
所以最好用无机盐、无机碱或水溶液进行测定。
若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸或稀碱溶解后再作测定。
3．215nm和225nm下的光吸收差法：
本方法为一个经验公式。
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm下的光吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
吸收差=A215－A225
测定方法：
测定蛋白质标准溶液在215nm和225nm处的吸收值，计算出吸收差，以对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在215nm和225nm处的吸收值，计算出吸收差，通过标准曲线法计算出样品浓度。
在蛋白质浓度20~100g/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度差值成正比，其中NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1NNaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
3.2纯DNA浓度的测定方法
DNA在260nm下有最大吸收，且A260值与DNA的浓度成正比例关系。
因此，可以根据DNA溶液的A260值来计算DNA溶液的浓度。
测定方法：
测定DNA标准溶液在260nm处的吸收值A，以A对DNA标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在260nm处的吸收值A，通过标准曲线法计算出样品浓度。
缺乏DNA标准溶液时，可以利用下面的经验公式来计算：
C＝50×A260（ug/mL）
DNA浓度较低时（20—200ug/mL），上述经验公式线性相关性较好。
同时，如果存在高浓度的盐、带共轭双键的有机溶剂和蛋白质，都会对测量结果产生影响。
3.3蛋白质/DNA混合溶液浓度的测定方法
蛋白质和核酸（DNA&RNA）是生物体内最重要的两种物质，绝大多数生物体内都含有大量的蛋白质和核酸，而且两者紧密相关，互为依存。
从生物体内提取蛋白质时，通常混有核酸；从生物体内提取核酸时，又通常混有蛋白质，而两者在紫外区又都有吸收，所以在测定其浓度时，如果采用上述纯溶液的测定方法，都会对对方有干扰。
因此，针对这种情况，形成了一些专门测定蛋白质/DNA混合溶液浓度的方法。
1．280nm和260nm下的光吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍，在260nm处的吸收更强，核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍。
而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。
依照蛋白质和核酸分别在260nm和280nm处吸光度的差异，可以依据A280/A260判断蛋白质和核酸的比例，如下：
纯蛋白质的光吸收比值：
A280/A2601.8
蛋白质核酸混合溶液：
A280/A2601.8～0.5
纯核酸的光吸收比值：
A280/A2600.5
测定方法：
对于蛋白质和核酸（以DNA为代表）的混合溶液，直接在260nm和280nm下测定其吸光度值，由下面的经验公式，即可分别算出蛋白质和核酸（DNA）的浓度：
蛋白质浓度＝1552×A280－757.3×A260（ug/ml）
DNA浓度＝62.9×A260－36.0×A280（ug/ml）
注意：
（1）该公式为一系列蛋白与核酸的混合溶液通过统计归纳出的经验公式，上述四个系数针对不同的情况还需要修正；
（2）该方法受很多干扰物质的影响，前文所述纯溶液测定方法的干扰物质都会对本方法产生干扰，如高浓度的盐（如NaCI）和含有共轭双键的有机溶剂等等。
2．230nm和260nm下的光吸收差法
依前文所述，蛋白质中肽键在238nm下有最大吸收值，可以取A230作为其一个近似值，同时核酸在230nm附近也有较强吸收，因此，对于蛋白质和核酸（以DNA为代表）的混合溶液，可分别测定其A230和A260。
测定方法：
直接在230nm和260nm下测定其吸光度值，由下面的经验公式，即可分别算出蛋白质和核酸（DNA）的浓度：
蛋白质浓度＝183.0×A230－75.8×A260（ug/ml）
DNA浓度＝49.1×A260－3.48×A230（ug/ml）
与A280/A260光吸收差法类似，该公式也是为一系列蛋白与核酸的混合溶液通过统计归纳出的经验公式，上述四个系数针对不同的情况也需要修正。
与A280/A260光吸收差法相比，此方法具有更高的精确度，同时干扰物质也更多，除了高浓度盐、带共轭双键的有机物之外，一些醇、有机酸和过氧化物也会产生干扰。
4．UVWin5.0软件包测定蛋白质/DNA浓度的使用方法
由于紫外吸收法测量蛋白质/DNA浓度被广泛应用，北京普析通用仪器有限责任公司在紫外可见分光光度计专用软件UVWin5.0上专门为其设计了一个软件包，该软件包综合了上述所有的紫外吸收法测定蛋白质浓度的方法，其中将最常用的测定蛋白质/DNA混合溶液的方法形成两个专用方法，分别为方法1（“A230/A260法”）和方法2（“A280/A260法”），同时还预留了一个自定义模块供用户根据实际情况和需求，自己设计检测波长和进行差值运算的系数。
另外，基于蛋白质/DNA在320nm之上均没有光吸收的原理，该软件还设计了一个“波长320nm背景校正”的可选功能，以方便用户能够更好地选择合适的测定方法。
总的来说，UVWin5.0蛋白质/DNA测定专用软件包基本上涵盖了所有的可以根据紫外吸收来测定蛋白质/DNA浓度的方法。
软件的具体操作方法如下：
4.1．启动DNA蛋白质测定功能
启动UVWin5.0软件之后，如果您需要进行DNA蛋白质分析，选择【应用】菜单下的【DNA/蛋白质分析】子菜单，系统会打开DNA蛋白质测量窗口。
如图所示。
窗口将分为两个部分，位于中间部分的为显示窗口，显示当前的测量结果。
位于下方的是控制台，您可以通过点击控制台上的按钮来开启相应的功能。
图1DNA蛋白质测定窗口
4.2．设置测量参数
在控制台按钮中，有一个名为【设置】的按钮，点击此按钮即可打开参数设置窗口。
如图所示。
图2DNA蛋白质参数设置
●WL（A1，A2）：
表示DNA蛋白质的两个测定波长。
●Df（A1，A2）：
表示DNA的两个系数。
●Pf（A1，A2）：
表示蛋白质的两个系数。
如果您要进行320nm的背景校正，点击【320nm背景校正】选择框，然后输入相应的校正系数即可。
DNA蛋白质的计算方法如下：
●不进行320nm校正
DNA浓度＝Df1×A1－Df2×A2
蛋白质浓度＝Pf2×A2－Pf1×A1
●进行320nm校正
（A1＝A1－A320，A2＝A2－A320）
DNA浓度＝Df1×A1－Df2×A2
蛋白质浓度＝Pf2×A2－Pf1×A1
另外，在控制台按钮中，还有一个名为【仪器】的按钮，点击此按钮即可打开仪器参数设置窗口，如光谱带宽等。
4.3．处理测量结果
DNA蛋白质的测量是非常简单的，您只需要将样品放入样品池，然后点击控制台上的【测量】按钮即可完成测量。
如果您要对测量结果进行打印输出，点击控制台上的【打印】按钮。
如果您要导出测量结果，点击【导出】按钮。
5．影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素
紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的最大特点就是操作简单、测量迅速，而且不需要引入试剂；但是它也面临着很多问题，诸如测量准确性的问题。
本节将讨论影响测定的一些主要因素。
（1）蛋白质的不同对测定结果的影响。
由于蛋白质是生物大分子，而紫外吸收往往是其分子内的小基团所引起的，例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和肽键等等。
因此当蛋白质不同，其包含的上述小基团含量发生变化时，就会影响蛋白质含量的测定。
然而蛋白质种类繁多，结构复杂，很难对其进行有效的归类。
例如人体内含蛋白质的种类约有10万种，整个生物界的蛋白质种类估计有100亿种。
建议：
测量过程中如果条件允许，应尽量使用相近的蛋白质做标准曲线，修正测量参数，以便得到更为准确的数值。
（2）溶液中干扰物质的影响。
由于蛋白质所包括的具有紫外吸收的小基团为常见基团，其产生紫外吸收的特异性并不强，很多具有类似结构的有机溶剂都会有类似的紫外吸收，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类，这些混入蛋白质溶液都会对测量产生干扰。
另外，一些高浓度的无机化合物也会对蛋白质的含量测定产生干扰，例如NaOH、NaCI等等。
建议：
测量时应尽量排除干扰物质，同时选择合适的参比溶液。
（3）溶剂吸收的影响。
如果以一些在紫外区有吸收的物质做溶剂（例如醇、酮类），会对测量结果产生很大的影响。
建议：
测量时尽量不要使用此类溶剂，或者在测量时选择合适的参比。
（4）PH对测定的影响。
PH变化时对蛋白质含量测定的影响非常大，例如：
下图为Tyr的吸收谱线与PH的关系。
由图可以发现，PH=6和PH=13时，光吸收度已经有了非常大的差异。
maxatpH6:
274nm
maxatpH13:
295nm
建议：
测定样品时不要使溶液处于过酸或者过碱的状态，同时样品的PH值要与标准品的PH值尽量保持一致。
（5）环境极性、蛋白质构象、蛋白质折叠与变性都会对蛋白含量的测定产生影响。
6．测定蛋白质/DNA浓度的其他应用方法简介
紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法虽然因其操作简单、快速的特点已经被广泛应用，但是因其准确度较差，测量过程中干扰物质较多，不能满足用户精确测量的需求。
本节将介绍一些使用化学试剂来测定蛋白质/DNA浓度的应用方法。
（1）考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白质浓度
这是目前最常用的使用化学试剂测量蛋白质浓度的方法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，溶液的颜色由棕黑色变为兰色，同时使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm。
目前普遍认为，G-250染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合而变色。
因此，在595nm下测定溶液的吸光度值A595，该吸光度值与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
①灵敏度高。
本方法灵敏度可达1ug/mL。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有非常高的消光系数。
②测定快速、简便。
本方法只需加一种试剂考马斯亮蓝G-250，而且染料与蛋白质结合非常快，大约只要2分钟即可完成，其颜色又可以在1小时内保持稳定，其中在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
测量时，将染料与样品混合摇匀，测定其A595值即可，完成一个样品的测定，只需要1分钟左右。
③干扰物质相对较少。
主要的干扰物质有：
去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH等。
值得注意的是，该法也有一些缺陷：
①由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，该法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，因此，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
②标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（2）微量凯氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质浓度
这是一种经典方法。
蛋白质样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨；经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之含氮量。
该方法灵敏度较低（0.2－1mg/mL），操作复杂，比较费时（约8－10小时），不过干扰物质非常少。
该方法目前已经很少使用。
（3）双缩脲法（Biuret法）测定蛋白质浓度
双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）是两个分子脲（NH2-CO-NH2）经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
蛋白质可以和CuSO4发生双缩脲反应，形成的紫色络合物的颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
此法的优点是较快速，干扰物质少（主要干扰物质有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等），不受蛋白质差异的影响；主要的缺点是灵敏度差（1~10mg/mL）。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（4）Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质浓度
Folin-酚试剂法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深蓝色的原因都是：
在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。
在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
该法的优点是灵敏度高（5ug/mL），比双缩脲法灵敏得多，缺点是时间较长（大约2小时），要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，也会干扰Lowry反应，而且对后者的影响还要大得多。
例如酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
依干扰物质的不同，本方法常作为考马斯亮蓝法的备选方法，交替使用。
（5）BCA（Bicinchonincacid）法测定蛋白质浓度
BCA法与Lowry法相似，主要差別在碱性溶液中，蛋白质使铜离子由二价转变成一价后，进一步的以BCA取代Folin-酚与一价铜离子结合产生很深的紫色，在波长562nm有很强的吸光度，该吸光度值与蛋白质浓度成正比。
本法的优点在于碱性溶液中BCA比Folin-酚稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。
本法的灵敏度与Lowry法相似，以微量分析（microassay）灵敏度可测至约0.5-10g/ml。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂、盐酸胍和尿素较具容忍度，不易受干扰，但也会受原糖以及EDTA的干扰。
BCA法和Folin-酚法一样，通常作为考马斯亮蓝法的备选方法，交替使用。
（6）琼脂糖凝胶电泳法测定DNA浓度
从生物体中提取的总DNA浓度一般是通过紫外吸收法（A260法）来测定，当需要测定某些特定DNA浓度时，通常先进行琼脂糖凝胶电泳分离DNA，然后用溴化乙锭进行染色（溴化乙锭能够插入到DNA的双链上，而且在紫外灯的照射下又会产生荧光），再用凝胶成像系统进行分析，最后可以得出各个特定DNA的浓度。
此方法灵敏度很高，可以ng级的DNA，干扰物质少；不过操作较为复杂，时间也比较长（约2小时），而且溴化乙锭毒性较大。
因此一般不用来测定总DNA的浓度。
结束语：
普析通用本着用户为本、服务至上的原则，不断完善我们的服务体系和服务内容，用户指导书就是基于这样的原则新鲜推出的。
希望该指导书能对大家的分析工作有一定的帮助，也希望大家能提供宝贵的建议和意见，以便我们更好地掌握用户的需求，完善我们的工作。
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