高效液相色谱法.docx
《高效液相色谱法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱法.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
高效液相色谱法
高效液相色谱法
1简述
高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离侧定的色谱方法。
注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.1对仪器的一般要求
所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
色谱柱内径一般为3.9～4.6μm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。
1.1.1色谱柱
反相色谱柱：
以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：
用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：
用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：
用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm（lnm=10Å）以下的填料适于分析分子量小于2000。
的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间。
粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm））。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果
可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。
流动相的pH值应控制在2-8之间.当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解;当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，或有机一无机杂化填充剂等。
1.1.2检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的量有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与待测溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数转换。
不同的检测器，对流动相的要求不同。
如采用紫外-可见分光检测器，所用流动相应符合紫外一可见分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。
蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。
1.1.3流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇一水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。
流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时应尽可能使用低浓度缓冲盐。
用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。
各品种项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、填充剂粒径、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。
其中，调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。
若需要用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。
当对其结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种正文项下注明。
1.2系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、重复性和拖尾因子等五个参数。
按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，应符合要求。
2.1.1色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的效能。
由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR和峰宽（W）或半高峰宽（Wh/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。
tR、W、Wh/2可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。
2.1.2分离度（R）用于评价待侧组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标.可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其他难分离
物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与调整。
无论是定性鉴别还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其他色谱峰与相邻色谱峰之间有较好的分离度。
除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
分离度的计算公式为
R=2（tR2一tR1）/（W1+W2）
或R=2（（tR2一tR1）/1.70（W1..h/2+W2..h/2）
式中，tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tRl为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2及W1..h/2、W2..h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。
当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）均以峰宽（W）的计算结果为准。
2.1.3重复性用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。
采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%.100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。
其相对标准偏差应不大于2.0%。
2.1.4拖尾因子（T）用于评价色谱峰的对称性。
拖尾因子计算公式为：
T=W0.05h/2d1
式中，W0.05h为5%峰高处的峰宽；d1为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离。
以峰高作定量参数时，除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。
以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在各品种正文项下对拖尾因子作出规定。
2.1.5灵敏度用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比（S/N）来表示。
通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。
定量测定
作业指导书
指导书编号TYFDC-SOP-FF-028
高效液相色谱法
第5页共10页
第二版
批准
李忠华
初审
吴雅凝
起草
郭欣
时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。
系统适用性试验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测能力。
1.3测定法
1.3.1内标法
按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。
取一定量进样，记录色谱图。
测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子
校正因子（f）=（As/cs）/（AR/cR）
式中As为内标物质的峰面积或峰高;AR为对照品的峰面积或峰高;cs为内标物质的浓度;cR为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量
含量（cx）=f.Ax/（A’s/c’s）
式中，Ax为供试品峰面积或峰高；cx为供试品的浓度；A’s为内标物质的峰面积或峰高；c’s为内标物质的浓度；f为内标法校正因子。
采用内标法，可避免因样品前处理或进样体积误差对测定结果的影响。
1.3.2外标法
按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积〔或峰高），按下式计算含量
含量（Cx）=CR（Ax/AR）
式中各符号意义同上。
由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜。
1.3.3加校正因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。
在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取待测物对照品和参比物质对照品各适量，配
作业指导书
指导书编号TYFDC-SOP-FF-028
高效液相色谱法
第6页共10页
第二版
批准
李忠华
初审
吴雅凝
起草
郭欣
制待测物校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按下式计算待测物的校正因子。
校正因子（f）=（cA/AA）/（cB/AB）
式中cA为待测物的浓度；AA为待测物的峰面积或峰高;；cB为参比物质的浓度;；AB为参比物质的峰面积或峰高。
也可精密称（量）取主成分对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓度的溶液，进样，记录色谱图，绘制主成分浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分回归直线斜率与杂质回归直线斜率的比计算校正因子。
校正因子可直接载人各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。
需作校正计算的杂质，通常以主成分为参比，采用相对保留时间定位，其数值一并载人各品种项下。
测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液，作为对照溶液，进样，记录色谱图，必要时，调节纵坐标范围（以噪声水平可接受为限）使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%-25%。
除另有规定外，通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%。
然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，除另有规定外，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质含量。
1.3.4不加校正因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时，若无法获得待测杂质的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。
同上述1.3.3法配制对照溶液、进样调节纵坐标范围和计算峰面积的相对标准偏差后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。
除另有规定外，供试品溶液的记录时间应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算杂质含量。
作业指导书
指导书编号TYFDC-SOP-FF-028
高效液相色谱法
第7页共10页
第二版
批准
李忠华
初审
吴雅凝
起草
郭欣
1.3.5面积归一化法
按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量进样，记录色谱图。
测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。
用于杂质检查时，由于仪器响应的线性限制，峰面积归一化法一般不宜用于微量杂质的检查。
4注意事项
4.1流动相的制备与保存用高纯度的试剂配制流动相.必要时照紫外一可见分光光度法进行溶剂检查，应符合要求;水应为新鲜制备的高纯水，可用超纯水器制得或用重蒸馏水。
凡规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节、除另
有规定外，偏差一般不超过±0.2pH单位。
配制好的流动相应通过适宜的0.45μm（或0.22μm）滤膜滤过，以除去杂质微粒。
流动相用前必须脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作、色谱柱的分离效率、检测器的灵敏度以及基线稳定性等。
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯等容器内，不能贮存在塑料容器中。
因许多有机溶剂如甲醇、乙睛等可浸出塑料表面的增塑剂，导致流动相受污染。
贮存容器一定要盖严，以防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶人流动相引起pH值变化，对分离或分析结果带来误差。
磷酸盐、醋酸盐缓冲液容易发霉变质，应尽量新鲜配制使用。
如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。
4.2溶液的配制与保存除另有规定外，采用规定溶剂配制对照品溶液和供试品溶液，定量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别配制两份。
供试品溶液在注人液相色谱仪前，一般应经适宜的0.45μm（或0.22μm）滤膜滤过，以减少对色谱系统产生污染或影响色谱分离。
应根据试验要求和供试品的稳定性，设置待测溶液的贮存条件（如温度、遮光等）。
4.3色谱柱的使用.与保存根据实验要求和流动相的pH值范围，参照色谱柱说明书，选用适宜的色谱柱。
安装色谱柱时应使流动相流路的方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致。
除另有规定外，不宜反向使用，否则会导致色谱柱柱效明显
作业指导书
指导书编号TYFDC-SOP-FF-028
高效液相色谱法
第8页共10页
第二版
批准
李忠华
初审
吴雅凝
起草
郭欣
降低，无法恢复。
进样前，色谱柱应用流动相充分冲洗平衡。
经色谱系统适用性试验测试，应符合要求。
色谱柱在使用过程中，应避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。
温度的突然变化或者机械震动都会影响柱内固定相的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流动相流速时应该缓慢进行。
试验结束后，可按色谱柱的使用说明书，对色谱柱进行冲洗和保存。
一般来讲，对于反相色谱柱，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，在试验结束后，应用10倍柱体积0（如150mm柱长，约15mL）的低浓度的甲醇/乙睛一水溶液（10%--20%）冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出，再用较高浓度
的甲醇/乙睛一水溶液（50%）冲洗，最后用高浓度的甲醇/乙腊一水溶液（80%---100%）冲洗，使色谱柱中的强吸附物质冲洗出来。
如色谱柱需长期保存，反相柱可以贮存于甲醇或乙睛中，正相柱可以贮存于经脱水处理后的正己烷中，离子交换柱可以贮存于含5%甲醇或含0.05叠氮化钠的水中，并将色谱柱的两端密封。
以免于燥，室温保存。
4.4流动相的调整为满足色谱系统适用性要求，试验中有时需要调整流动相组分的比例。
在调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。
下面举例说明。
4.4.1二元流动相系统。
例1两组分比例为50:
50按上述原则，X=50%，＞33%该流动相比例调节的范围是X-10%～X+10%，即40:
60至60:
40。
例2两组分比例为2:
98，X=2%，＜33%按上述原则，2%的允许改变范围为0.7X～1.3X，即1.4～2.6故该流动相比例调节的范围是1.4:
98.6至2.6:
97.4。
4.4.2三元流动相系统
例3三组分比例为60:
35:
5按上述原则，可每次调节流动相系统中比例较低的两个组分。
对35%的组分，其流动相比例调节的范围是X-10%～X+10%，即25%-45%，则流动相系统比例的调节范围是50:
45:
5至70:
25:
5。
作业指导书
指导书编号TYFDC-SOP-FF-028
高效液相色谱法
第9页共10页
第二版
批准
李忠华
初审
吴雅凝
起草
郭欣
对于5%的组分，其允许改变范围为0.7X～1.3X，即3.5%～6.5%，则流动相系统比例的调节范围是58.5:
35:
6.5至61.5:
35:
3.5。
4.5杂质检查时色谱参数的设置
在进行杂质检查时，选择适宜的检测灵敏度和设定适宜的积分参数非常重要。
国内药品质量标准中，通常制备与杂质限度相当浓度的对照溶液，用以调节检测灵敏度，使对照溶液的主成分色谱峰的峰高达满量程的10%～5%，再进行供试品溶液的测定，以峰面积计算单个杂质量和总杂质量。
目前国内色谱数据处理系统大致有积分仪和色谱工作站两种类型，对于传统的积分仪，由于记录仪的满量程是固定的，因此检测灵敏度的调节通常是调节检测器的灵敏度使色谱峰高达到记录仪满量程的某个范围;而对于色谱工作站，由于记录标尺的满刻度是可调的，所以通常是调节满刻度的设定值，使色谱峰的量程占满刻度的某个范围。
无论使用的是积分仪，或者是色谱工作站，如质量标准中没有明确规定峰面积的取舍限值，或没有设定灵敏度测试溶液，则在实际检验中，实验者通常根据以往经验设定积分参数和小峰面积，由此也出现了同批样品的杂质总量在不同实验室（或不同实验者）之间差异较大的现象。
如遇到这种情况，建议实验者在检测灵敏度调节（或工作站标尺量程调整）完毕后，采用对照溶液逐步稀释法配制系列溶液来确定此色谱系统的检测限，在与供试品溶液及对照溶液相同的标尺下记录色谱图，通常以信噪比3：
1时的相应浓度作为检测限，以该检测限对应的峰面积作为计算杂质总量时色谱峰峰面积的舍弃限值。
4.6梯度洗脱梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。
要注意溶剂的互溶性，不相棍溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。
有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。
当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时须特别小心。
混合溶剂的黏度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。
例
作业指导书
指导书编号TYFDC-SOP-FF-028
高效液相色谱法
第10页共10页
第二版
批准
李忠华
初审
吴雅凝
起草
郭欣
如甲醇和水乳度都较小，当二者以相近比例混合时黏度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。
因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。
样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，如洗脱过程中基线漂移较大，亦可对色谱图进行空白扣除处理。
5报告格式
5.1鉴别
检验项目
标准规定
检验结果
单项判定
高效液相色谱法
按检验标准项下描述
与X对照品一致
符合规定
5.2有关物质
5.2.1面积归一化法
检验项目
标准规定
检验结果
单项判定
有关物质
应符合规定
（不）符合规定
（不）符合规定
5.2.2自身对照法
检验项目
标准规定
检验结果
单项判定
有关物质
应符合规定
（不）符合规定
（不）符合规定
5.2.3杂质对照外标法
检验项目
标准规定
检验结果
单项判定
有关物质
按检验标准项下描述
实际测定数据
（不）符合规定
5.3含量测定
检验项目
标准规定
检验结果
单项判定
含量测定
按检验标准项下描述
实际测定数据
（不）符合规定
——本规范依据《中国药典》20155年版四部通则0512高效液相色谱法制定。
升级会员 