生物仪器学.docx
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生物仪器学
1.1 原理
TaqMan荧光探针：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
SYBR荧光染料：
在传统PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，这样就保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
当PCR循环复制时DNA双链也成倍增长，同样SYBR染料的荧光的信号也随之增倍，通过实时监测整个PCR进程中荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
二者不同点：
实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,由于增加了探针的识别步骤,特异性更高;染料类如SYBRGreenI则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加，不利用杂交原理，则简便易行,成本较低。
荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增,不需要探针的设计,使检测方法变得简便,同时也降低了检测的成本。
然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合,因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合,使实验容易产生假阳性信号。
引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（meltingcurve）分析的软件加以解决。
相同点：
二者都利用荧光，都用于指示扩增产物的增加，
实时定量PCR的化学原理分为探针类和非探针类两种。
探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。
前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
（1）T叫Man荧光探针：
TaqMan探针是一种寡核昔酸探针，他的荧光与目标序列的扩增相关（图15—7，左）。
他设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。
荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。
当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基因接近而被淬灭。
但在反应延伸时，DNA聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与FCR产物形成完全同步。
随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。
因此荧光强度与PCR扩增产物的数量呈正比关系。
（2）SYBR荧光染料：
SYBRGreenI是一种结合于双链DNA小沟的化学染料分子（图15—7，右）。
在PCR反应体系中，通常加入过量的SYBRGreenI荧光染料，染料特异性地掺人DNA双链后，发射强荧光信号，而不掺人链中的染料分子仅有微弱的荧光信号背景，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
二维差异凝胶电泳（two2－dimensionaldifferencegelelectrophoresis，2D-DIGE）是二维电泳技术的另一个突破，该技术应用两种不同的荧光染料Cy3和Cy5，分别标记不同的蛋白质样品，然后将两种样品等量混合，在同一2-DE中分离.通过在同一块胶上对比一个蛋白点处两种不同荧光的强度，比较两种状态下特定蛋白质丰度变化、蛋白质的缺失或是否有新蛋白质的出现等。
DIGE克服了二维电泳过程中不同凝胶间重复性差的问题；同时可以在同一块胶上更精确直观地观察两种样品蛋白质的差异表达并对其定量。
超净工作台与生物安全柜的区别：
1.超净工作台原理：
环境空气经过初效过滤器，由离心风机压入静压箱，再经过高效过滤器过滤后从出风面吹出，形成洁净气流，洁净气流以均匀的断面风速流经需要净化的区域，将该域内的尘埃带走，从而形成高洁净度的工作环境，为加大散流角，扩大净化范围，还可以在出风口设置散流器。
生物安全柜原理：
通过前窗操作口向内吸入的负压气流用以保护人员的安全;经高效过滤器过滤的垂直下降气流用以保护产品;气流经高效过滤器过滤后排出保护环境不受污染。
3超净工作台：
工作区域内为正压。
生物安全柜：
运用风机在循环风和排风之间建立一个柜体内部风量平衡系统,保证大约30%的回风通过高效过滤器,以形成工作区域的负压。
2.超净工作台：
为了保证接种成功率，接种时使用酒精灯，效果更好。
生物安全柜：
在生物安全柜内形成的几乎没有微生物的环境中，应避免使用明火。
明火会对气流产生影响，并且在处理挥发性和易燃物时，使用明火也很危险，可用微燃烧器或电子炉代替。
4超净工作台：
在开始实验前,至少让风机运行5min。
生物安全柜：
应24小时持续开风机。
危险药物的悬浮颗粒和喷溅物通常沉积在工作区中很难吸入高效滤器中，并且生物安全柜的工作区通常为负压，一旦关掉风机，这些危险物便会污染环境。
关掉风机前，必须彻底清洗生物安全柜，然后将其入口及高效滤器的排气口用塑料覆盖后用胶带封住。
5.超净工作台：
需要紫外灯。
生物安全柜：
不需要紫外灯，如果使用紫外灯的话,应该每周进行清洁,以除去可能影响其杀菌效果的灰尘和污垢。
在安全柜重新认证时,要检查紫外线的强度,以确保有适当的光发射量。
6.超净工作台：
没有操作者人身保护,因此不能进行致病菌和可能对人体造成危害的微生物制剂的操作。
操作者必须牢记气流走向,以防不安全因素。
生物安全柜：
可同时对产品和操作人员实施保护。
7.与超净工作台相比较生物安全柜的特殊要求
1） 在使用照明灯和灭菌时,开关必须设置单一选择,不能同时开关。
2）保证回风各有50%分别从工作面的前后两个区域返回,以在柜体开口处形成风帘,保证操作者安全。
3）保证工作区域内没有涡流或向上的气流出现（当操作视窗关闭时,风机将自动关闭以防止不必要的电机过热）。
4）有声、光报警警示,操作视窗最大开口不得超过50cm,以起到保护作用。
5）工作台面下方柜体处设一可开关的排放口以便于清洗工作表面。
6）柜体外应安装福尔马林发生器,以满足灭菌要求。
超净工作台的应用范围：
它用于药品、微生物制剂、组织细胞等的无菌操作,较生物安全柜结构简单,成本低廉,运用广泛。
生物安全柜的应用范围：
A型生物安全柜是用于不涉及有害化学品的日常的微生物实验，B型是为了更好的除去有害气体、烟尘或限制其扩散的生物研究。
BSL-1的处理对象是对人体，动植物和环境危害较低，不会引发健康成人疾病；BSL-2的处理对象是对人体，动植物和环境有中等危害或具有潜在危险的致病因子；BSL-3的处理对象是可通过气溶胶使人感染上严重的甚至是致命的致病因子，对人体，动植物和环境有高度危险，通常有预防治疗措施；BSL-4对人体，动植物和环境有高度危险性。
通过气溶胶途径传播或传播途径不明，没有预防措施。
1）细胞破碎的方法及采用的仪器如下：
机械法：
（1）研磨法：
研钵和研磨。
剪碎的组织至于研钵中，用研磨棒研碎，为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。
（2）磨切法：
球磨机、万能粉碎机
（3）组织捣碎法：
组织捣碎机。
一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等的破碎，捣碎器处理30—45s可以将植物和动物细胞完全破碎。
（4）超声波法：
超声波细胞破碎机，多用于微生物细胞的破碎，破碎时间为3-15分钟，为防止电器长时间运转产生过多的能量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。
（5）高压匀浆法：
高压匀浆器。
（6）压榨法：
压榨机。
用高压力使细胞通过小于细胞直径的小孔，此法温和，破坏细胞彻底。
（7）反复冻融法：
冰箱
非机械方法不需要专门的设备，部分需要恒温加热磁力搅拌器。
2）提取分离的方法及采用的仪器如下：
一般的提取方法是溶剂提取，有的时候有超声波或微波辅助提取，用到的仪器有超声波聚焦处理器、微波炉等
分离
（1）离心分离法：
离心机
（2）高效液相色谱分析（HPLC）法:
HPLC
（3）柱层析法：
层析柱
（4）高速逆流色谱分离法：
高速逆流色谱系统
（5）超滤法，超滤法是一种膜分离法，用到超滤装置
其他的方法还有萃取，是一些常规的仪器。
3）纯化精制：
（1）高效液相色谱分析（HPLC）法:
HPLC
（2）柱层析法：
层析柱
4）浓缩：
（1）超滤浓缩法：
超滤装置
（2）真空减压浓缩：
真空浓缩罐
（3）薄膜浓缩法：
高效薄膜蒸发器
其中2和3在生产中应用比较广泛，实验室常用的浓缩方法还有盐析、有机溶剂沉淀、常压蒸发，无专门的仪器。
5）结晶，干燥：
常压吸附干燥：
常用干燥剂
烘箱
减压真空干燥：
真空干燥器，冷凝管、真空泵。
冷冻干燥：
冷冻干燥机
6）冷藏冻存：
冰箱
机械法：
主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。
1.组织捣碎机
将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。
由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。
2.匀浆器
先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。
匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。
制作匀浆器的材料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。
此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。
3.研钵
多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。
4.细菌磨
是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。
操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。
物理法：
主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。
在生化制备中常用的方法有：
1.反复冻溶法
原理：
因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。
方法：
将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
特点：
此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。
2.急热骤冷法
将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。
3.超声波处理
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。
其破碎机理：
可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。
超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。
特点：
操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。
存在问题：
超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。
而且大容量装置声能传递，散热均有困难，应采取相应降温措施。
对超声波敏感和核酸应慎用。
空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂。
化学及生物化学法：
1.自溶法:
在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。
此过程需较长时间，常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。
2.酶溶法
利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。
有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。
特点：
a）此法适用多种微生物；b）具有作用条件温和；c）内含物成分不易受到破坏；d）细胞壁损坏的程度可以控制。
存在的问题：
易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。
而且溶酶价格高，限制了大规模利用。
若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。
另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。
有一定局限性，不适宜大量的蛋白质提取，给进一步纯化带来困难。
3.化学渗透法
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。
其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。
特点：
多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。
存在的问题：
时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：
某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。
小结
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。
结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
细胞破碎阻力
细菌
几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycanchain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。
短肽一般由四或五个胺基酸组成，如L-丙氨醯-D-谷氨醯-L-赖氨醯-D-丙氨酸。
而且短肽中常有D-胺基酸与二氨基庚二酸存在。
破碎细菌的主要阻力是来自於肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决於聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。
酵母菌
酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。
在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。
与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
真菌
黴菌的细胞壁主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷键连接，某些以β-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。
最外层是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层主要是蛋白质，最内层主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。
与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。
植物细胞
对於已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。
初生壁是细胞生长期形成的。
次生壁是细胞停止生长後，在初生壁内部形成的结构。
目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的「经纬」模型，依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行於细胞壁平面的方向一层一层敷著在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网路，构成了细胞壁的「经」，模型中的「纬」是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直於细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网路系统。
半纤维素和果胶等胶体则填充在网路之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。
在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。
因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。
细胞破碎技术
目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。
破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。
[编辑]机械法
高压匀浆破碎法（homogenization）
高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positivedisplacenemtpump）和排出阀（dischargevalve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由於突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用乾冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。
在工业规模的细胞破碎中，对於酵母等难破碎的及浓度高或处於生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。
振汤珠击破碎法（SkakingBead）
将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积,用6500RPM振汤机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法.一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便.
高速搅拌珠研磨破碎法（finegrinding）
研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机。
超声波破碎法（ultrasonication）
超声波破碎法利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。
超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。
超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果後者比前者好。
[编辑]非机械法
渗透压冲击破碎法（osmoticshock）
渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由於渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡後，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由於渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。
冻融破碎法（freezingandthawing）
将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然後在室温中融化，反覆多次而达到破壁作用。
由於冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。
对於细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。
酶溶破碎法（enzymelysis）
酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏後，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。
溶菌酶（lysozyme）适用於革兰氏阴性菌细胞的分解，应用於革兰氏阳性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用於细胞壁。
真核细胞的细胞壁不同於原核细胞，需采用不同的酶。
化学破碎法（chemicaltreatment）
采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。
常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂
去垢剂破碎法（detergents）
蛋白质复性
利用包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了乾净的包含体，再对包含体溶解复性。
这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使後面的分离纯化简单了。
从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。
1.2 荧光化学 目前real2timeQ2PCR所使用的荧光化学方法主要有五种,分别是:
DNA结合染色,水解探针,分子信标,荧光标记引物,杂交探针。
它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。
扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子,如SYBRgreen1[3]
等荧光染料。
Real2timeQ2PCR发展早期就是运用这种最简单的方法,在PCR反应体系中,加入过量SYBRgreen1荧光染料,SYBRgreen1荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号。
荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增,不需要探针的设计,使检测方法变得简便,同时也降低了检测的成本。
然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合,因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合,使实验容易产生假阳性信号。
引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（meltingcurve）分析的软件加以解决。
扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物,它又可分为直接法和间接法。
间接的方法就是利用水解探针的策略[4]。
目前在real2timeQ2PCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团,此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移,FRET）,因此探针完整时,检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光。
但在PCR扩增中,溶液中的模板变性后低温退火时,引物与探针同时与模板结合。
在引物的介导下,沿摸板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq酶的5’-3’外
切酶活性（此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响）将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光。
分子信标（molecularbeacon）
就属于这一类,它本质上是一种标记荧光的发夹探针,当探针分子呈发夹结构时,结合在其两端的荧光基团距离上接近,使得产生能量转移应,而不发生荧光。
当互补序列出现时,探针与DNA杂交,探针转变成一个开放的结构,呈线性,报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离,荧光基团脱离了淬灭基团的影响,从而产生可被检测到的荧光。
荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统,它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合,从而使
荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。
目前主要有两种:
日出引物（sunriseprimes）和蝎子引物（scorpionprimes）[6、7]杂交探针（hybridizationprobe）[8]使用两个特异的探针,其中上游的探针的3’端标记
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