生物分离复习总结.docx

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生物分离复习总结

第一章绪论

1、生物分离技术概念

生物分离技术是指从动、植物细胞、微生物代谢产物和酶反应产物等生物物料中分离、纯化目的组份的技术。

是由一系列分离纯化单元操作技术组成。

包括：

制备型和分析型两类生物分离技术。

2、生物分离一般工艺流程及四个阶段

1）.生物料液预处理、固液分离及细胞破碎—预处理：

加热、调pH、沉淀、絮凝、凝聚;固液分离：

离心、过滤;细胞破碎：

均质、酶解、超声波等.

2）.初步纯化（提取）——浸提和萃取、浓缩、分子蒸馏、沉淀、膜分离、层析等

3）.高度纯化（精制）——层析、结晶、干燥等

4）.最后纯化——再次高度纯化或HPLC法纯化

3、生物分离所用原材料特性及生物分离过程特点

1）：

所用原材料特性组成复杂：

目的物质浓度很低；容易腐败变质；待分离物质通常不稳定；不同批次间物料组成和特性不尽相同；要求有毒有害成分残留达到允许的范围内

2）：

生物分离过程特点:

a工艺常由好几步分离操作组成，不易获得高收;b工艺的选择和操作要注意保持目的组份的生物活性;c工艺条件要有一定弹性;d对基因工程产品，应注意生物安全性

第二章生物材料的与处理技术

对料液进行分离纯化，在进行固液分离之前，必须进行预处理。

固液分离处理——过滤、离心

料液存在大量杂质，会导致以下问题：

如料液粘度过大、产生膜污染、高价无机离子和杂蛋白降低离子交换的吸附能力、萃取时乳化严重等等

预处理的目的：

除去部分杂质；改变料液的物理性质（pH、黏度等）——使后续分离纯化工序顺利进行

料液中的胶体性质：

预处理应破坏料液的胶体的稳定性。

胶体：

粒度（0.1um－1um），丁达尔现象

生物料液中的胶体粒子：

大分子DNA，蛋白质，细胞，细胞碎片等

胶体稳定性条件：

双电层（以及带同种电荷）；水化层

一、凝聚和絮凝技术

（一）凝聚技术：

原理：

中性盐作用下，中和胶体粒子表面电荷和脱去其水化层而使胶体粒子沉淀。

中和电荷：

一般，菌体或细胞带负电荷，其周围吸附正电荷，加入中性盐后，阳离子会中和负电荷，减少了胶体间斥力，胶体粒子由于热运动碰撞而聚集沉淀。

去水化：

中性盐离子的水化作用而破坏胶体粒子的水化层，使胶体粒子能相互碰撞而凝聚沉淀。

Ø常用的凝聚剂

金属离子凝聚能力比较：

Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+

常用的凝聚剂中性盐：

Al2（SO4）3·18H2O（明矾净水原理）；AlCl3.6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3

Ø凝聚法缺点：

得到的凝聚颗粒比较小，分离仍较困难。

；絮凝法可克服这一困难。

（二）絮凝技术

1：

原理：

在高分子絮凝剂的作用下，通过架桥作用，使细胞和蛋白质聚集成粗大的絮凝团而沉淀。

Ø高分子聚合物絮凝剂，是长链线状、水溶性的聚合物

Ø在长的链节上含有相当多的活性功能团—可以带有多价电荷（如阴离子或阳离子），也可以不带电性（如非离子型）。

Ø通过静电引力、范德华分子引力或氢键作用，强烈地吸附在胶粒的表面

2絮凝效果的影响因素

A.絮凝剂的相对分子质量：

结合考虑架桥效果及水溶性

B.絮凝剂的用量;C.料液的pH值;D.搅拌速度和时间：

变速搅拌

3常用的絮凝剂

A,人工合成高分子聚合物

聚丙烯酰胺类：

用量少（10-6级）、絮凝体粗大、效果好，速度快，种类多，适用范围广。

聚乙烯亚胺衍生物类;聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。

无机高分子聚合物絮凝剂：

聚合铜盐，聚合铁盐。

B,天然有机高分子絮凝剂:

壳聚糖，葡聚糖，明胶，海藻酸钠等

C.微生物絮凝剂:

主要为糖蛋白、黏多糖、纤维素及核酸等高分子物质。

安全，无毒，不污染环境。

二、其他预处理方法

1.杂蛋白去除方法：

•等电点沉淀法（常需结合它法）

•变性沉淀法：

加热变性、大幅度改变pH、加有机溶剂、加表面活性剂等

•吸附法：

与高价盐形成胶态沉淀

•加沉淀剂法：

能与蛋白质形成复合沉淀的化学试剂

2.高价无机离子去除方法：

离子交换法;沉淀法：

加入阴离子盐形成不溶性盐沉淀，如Ca2+加草酸，Mg2+磷酸盐，Fe3+加黄血盐

3.杂质多糖的去除方法：

酶解法

4.杂质DNA的去除法：

核酸酶水解;超声波破碎;离子交换层析或亲和层析

（三）．应用实例：

发酵液的预处理

一、降低发酵液黏度—加热法：

将发酵液温度升高到80℃，保温即可将其黏度降低数十甚至数百倍

二、凝聚沉降分离悬浮物—凝聚剂法：

如明矾凝聚法（测产品澄清液浊度）

三、絮凝法沉降分离悬浮物—絮凝剂法：

如壳聚糖絮凝法（测产品澄清液浊度）

第三章固液分离技术

固液分离——固相、液相分离:

单元操作是过滤与离心

一、过滤：

（原理）以多孔性物质作为过滤介质，在外力（重力、真空度、压力或离心力等）作用下，流体（液体、气体）及小颗粒固体通过介质孔道，而大固体颗粒被截留，从而实现流体与颗粒分离的技术。

适用于较大的固体颗粒，包括丝状菌体等。

1.过滤介质分类

介质种类：

介质材料以及应用

无定形颗粒：

无烟煤、砂颗粒活性碳、铁矿砂填于过滤器内作澄清过滤用。

成形颗粒：

烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状用于澄清过滤

非金属织布类：

非金属织布棉，化学纤维（维尼龙、尼龙等）、

金属织布类：

不锈钢丝及铁丝等的织布，主要用于预涂助滤剂的场合

无纺品：

滤纸、毡、石棉板以及合成纤维无纺布、各种滤膜等、大多用于精密过滤

2.过滤的分类

A．按照过滤推动力:

重力过滤、加压过滤、真空过滤、离心过滤（书上P14-15）

B．按照固体颗粒截留机理：

绝对过滤、深层介质过滤

C．按照操作方式：

间歇过滤、连续过滤

3.常用的过滤设备

a板框过滤机:

是加压过滤的代表；

优点：

可达到很大的压力（如1.5atm）对原料适应范围广

缺点：

设备笨重，间歇式操作，劳动强度大，生产周期长

b叶滤机:

垂直叶片式过滤机;水平式叶滤机（常用于滤啤酒的酵母）

c真空转鼓过滤机:

抽真空过滤;

优点：

设备紧凑，密封操作，劳动条件较好，槽体容易实现保温或加热，可以再高温高压下运作。

循环滤布不用装卸，机械化程度较高，节省劳动力。

缺点：

不适合高粘度的液体；料液中固形物含量不得过高

4.提高过滤效率的方法

A.降低料液黏度：

预处理技术（加热、去杂等）

B.加助滤剂（p19）：

硅藻土、珍珠岩粉、石棉粉、纸浆等。

方法原理：

助滤剂预涂;混滤

注意：

若要回收固体物质又不允许混入其他物质，不宜使用助滤剂

C.选择恰当的过滤工艺条件：

先恒速后恒压（即操作上为：

先逐渐加压，再保持恒压。

保证过滤能较彻底地进行）

二、离心:

适用于颗粒较小的物质，如细菌、酵母菌等。

离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。

1.离心机的分类

（1）a按离心方式分：

沉降式离心机、过滤式离心机。

b按操作方式分：

间歇式、连续式、半连续式。

c按结构特点分：

管式、转鼓式、碟式等

（2）按转速分：

a常速离心机（低速离心机）：

小于8000r/min。

（实验室中常用于分离制备。

）

组成：

转头（转头带有放置离心管的孔;转头的中央位于离心机的驱动轴上）、电动机特点：

离心机的转速和温度控制不够准确；一般最高转速在6,000rpm以下

b高速离心机：

10000-25000r/min，常带有冷冻系统。

最高转速在25,000rpm以下

组成：

较低速离心机增加温度控制系统（制冷系统）；制冷设备温度控制在0-4℃范围内；实际速度和温度可通过仪表或指针显示；制动器；配有一定类型及规格的转头

常用于生物大分子的分离制备，如用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器（如核蛋白体）或单个分子。

c超速离心机：

25000r/min以上，带有冷冻和真空系统，以减少空气阻力和摩擦力。

组成：

驱动和速度控制;温度控制;真空系统;转头。

区别：

增加真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。

应用：

常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白质分子。

2.常用制备型离心机介绍

1）.管式离心机：

转速可达50000r/min;管直径70~160mm,长径比4~8;

常用于处理固体含量少于1%的料液，特别适合于菌体和蛋白质分离。

2）.碟片式离心机

3）.螺旋卸料沉降离心机

4）.离心过滤机

3.离心条件的选择

a离心力Fc=m.r.w2；相对离心力（又称离心分离因素）RCF=Fc/Fg=1.12x10（-5）.r.n2相对离心力的单位——xg注意：

对于不同离心机，同一转速，实际离心力可能不同，而实际离心力才是离心效果的关键；在说明离心条件时，低速离心常以转速表示，高速离心特别是超速离心以“相对离心力”表示。

b离心时间w2（t2-t1）=1（lnr2-lnr1）/s

在要求一定的离心效果（沉降距离）时，即对于某一定的样品，离心时间与转速乘积为一定数，因此在离心效果上有：

低转速+长时~~~~高转速+短时

c温度和pH（保持活性）

4.离心机的使用

5个步骤（实训卡单）;注意事项

注意：

a.高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程：

b.使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各离心机说明书所规定的范围。

c.装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。

d.每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护.

f.若要在低于室温的温度下离心时。

转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

g.离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常声音应立即停机检查，及时排除故障。

h.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时。

i.离心时不准开盖，不准用手停止转头。

第四章细胞破碎技术

生物分离的目的组分：

胞内产物;胞外产物

细胞破碎的难易：

与细胞种类有关;与目的物的稳定性有关

细胞：

细菌;酵母;霉菌;动物细胞;植物细胞

一、细胞壁的结构

二、常用细胞破碎方法

（一）机械破碎法

1.实验室方法（小规模）：

a.旋刀匀浆法（注意：

防止升温）

原理：

通过固体剪切力释放细胞内含物进入溶液进行破碎，剧烈

效果：

能完全破坏动、植物细胞，但酵母、细菌细胞不同（加入石英砂才有效）

b.研磨法

原理：

利用磨料与细胞间的剪切及碰撞作用，温和，常在研钵内进行（或细胞匀浆器）

常用磨料：

石英砂、氧化铝；增效方法：

预先冷冻样液

2.大规模方法

a.高压匀浆法（高压剪切破碎）

过程：

高压（可达50-100Mpa）喷出—碰撞—释放到低压

高压造成升温2-3℃/10MPa，需注意冷却料液；影响因素：

压力、循环次数、温度

适用于酵母和绝大多数细菌，不适于丝状菌。

处理能力可达0.1-100m3/h

b.X挤压法（改进的高压匀浆法）：

对冷冻－融解敏感的生物物质不适合（细胞匀浆机）

原理：

浓缩的菌体悬浮液冷却至-30℃~-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击；适用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低、活性保留率高；主要用于实验室

c.高速珠磨法

原理：

利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞获得破碎。

；提高破碎效率的方法：

提高搅拌速度、增加小珠量、降低细胞浓度、降低通过珠磨机的循环速率

3.超声波破碎法：

常用间歇处理，冰浴冷却。

多在实验室规模用。

原理：

利用超声波振荡器，15-25kHz的超声波处理细胞悬浮液。

超声波作用机理：

空化作用；超声设备：

槽式（超声清洗仪），探头式（超声细胞破碎仪）

破碎作用影响因素：

超声波的声强、频率、处理时间、液体的温度等；优点：

操作简单，液量损失少；缺点：

易失活，噪声，大容量时声能不易传递、不易散热。

（二）非机械法

1.物理破碎法：

物理法总体不适于大规模生产，因破碎率低、效果较差

a.反复冻融法:

将细胞在-15℃下急剧冻结、室温缓融，反复多次

机理：

冷冻促进细胞膜疏水键结构破裂，增强其亲水性能；胞内水形成冰晶粒胀破细胞;缺点：

溶质释放、扩散慢

b.渗透压破碎法（溶胀法）:

机理：

低渗溶液细胞溶胀，也称渗透压冲击法

操作：

一定体积的浓细胞液，加入2倍体积的水中

操作方法改进：

细胞预先置于高渗介质中

特点：

最温和，用于易破碎的细胞，如动物细胞、G-等

2.化学破碎法:

通过化学试剂使细胞壁和细胞膜结构改变或破坏。

常用有：

酸、碱、表面活性剂、有机溶剂等类别。

表面活性剂、碱--溶解细胞壁上的脂质或使细胞内组分渗漏。

表面活性剂如胆酸盐、SDS、TritonX-100、Tween等;酸--蛋白质水解成氨基酸，常用6MHCl。

有机溶剂--可溶解磷脂层，使细胞结构破坏。

如丁酯、丁醇、丙酮、氯仿、甲苯等。

优点：

产物释出性好、细胞外形完整、碎片少、胞内杂质释放少，便于后步分离

缺点：

易引起目的物失活，可能给后续产物纯化带来困难，从而影响最终纯度

3.酶法破碎法:

应用酶破坏细胞壁，可部分或完全破坏细胞壁，再结合其他方法破坏细胞壁。

细菌:

溶菌酶，G-还需加入EDTA;酵母:

消解酶、β-葡聚糖酶、甘露糖酶、蜗牛酶

霉菌:

几丁质酶、蜗牛酶;植物:

纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶

自溶法:

细胞内酶（调节温度、pH或添加有机溶剂诱导细胞自溶）。

优点:

条件温和、反应迅速、选择性强；

缺点:

价格贵、通用性差、有时存在产物抑制、难适用于大规模工业操作，受影响因素多

△三、细胞破碎率的评价

细胞破碎率：

被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数.即：

Y=（N0-N）/N0×100%

N0—原始细胞的数量;N—经细胞破碎处理后余下的完整细胞数

细胞数的计算方法：

直接计数法：

血球计数板

间接计数法：

细胞破碎后，测定细胞悬浮液中特定细胞释出物的浓度

四、细胞破碎方法的选择依据

应从以下方面考虑：

细胞的处理量;细胞壁的结构、强度;目标产物对破碎条件的敏感性;破碎程度；具体操作条件应以下三方面权衡：

高的产物释放率；低的能耗；便于后续提

五、实际应用中常采用多种方法结合：

主要为机械法与非机械法的结合：

酶+高压匀浆；酶+超声。

其他如：

化学法+冻融法

第五章萃取技术

1概念：

利用目标物在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，将目标物从一种溶剂中转移到另一种溶剂中的分离技术。

萃取仍是一种初级分离技术。

萃取剂：

萃取所用的流体；萃取液（相）：

萃取所得的溶液或混合物；萃余物：

被萃取出溶质后的原料

萃取方式：

固－液萃取，液－液萃取，溶剂萃取，超临界萃取

2原理:

利用溶质在两互不相溶的液相中的竞争性溶解和分配性质上的差异进行分离

分配系数（反映目标物在两相中的分配情况）：

K=目标物在萃取液中浓度/在萃余液中浓度

K值>1时，才能达到萃取目的。

K越大，萃取剂对溶质的萃取效果越好。

分离因素β=Ka/Kb（反映萃取剂对两种溶剂的选择性）β越大或越小，分离效果越好

第一节溶剂萃取技术

△一、萃取剂的选择

对目标物有较大溶解度和好的选择性；与被萃取的液相互溶度小；

回收再生容易，化学性质稳定；价廉易得；安全性好：

闪点高、低毒

生化工程常用萃取剂：

乙酸乙酯，乙酸丁酯，丁醇

二、萃取工艺

（一）典型工艺流程:

混合→分离→溶剂回收

混合：

搅拌罐中混合，管道混合，喷射泵涡流混合;分离：

碟式或管式离心机，混合分离一体化;溶剂回收：

蒸馏

（二）萃取方式（各种方法原理见PPT）

1.单级萃取特点：

萃取不完全；萃取液浓度不高；工艺简单

2.多级错流萃取特点：

溶剂消耗大，萃取剂中目的物浓度低，萃取完全

3.多级逆流萃取特点：

溶剂消耗较少，萃取剂中目的物浓度高，萃取不很完全

三、影响萃取效果的因素

1.pH：

影响选择性及稳定性

2.温度：

影响分配系数和稳定性，一般室温或低温

3.盐析：

使目标物在水中溶解度降低而易转移至萃取剂中

4.带溶剂：

能和目标物形成复合物而易溶于萃取剂中，此复合物在一定条件下又易分解。

5.乳化和去乳化:

△第二节超临界萃取技术

一、超临界萃取概念:

以超临界流体为萃取剂，在临界温度和临界压力附近的状态下，从液体或固体物料中萃取出目的组分的技术。

二、超临界流体:

是指处于超过物质本身的临界温度和临界压力状态时的流体。

处于既非气体也非液体的超临界状态，气体和液体界面消失。

临界温度：

指高于此温度时，无论施加多大压力也不能使气体液化；

临界压力：

指在此临界温度下，液体汽化所需的压力。

三、超临界流体的性质

1.超临界流体的密度接近其液体——故其溶解度接近液体

2.超临界流体的黏度接近其气体，扩散性好，渗透性佳——故溶解速度接近气体

3.在临界点附近温度或压力的微小变化，会引起密度和溶解度很大变化，从而引起溶解能力较大变化

一种物质对另一种物质的溶解效果取决于：

溶解度（能力），溶解速度

△四、超临界流体的选择原则

1、操作温度与临界温度接近，在目的物稳定温度内

2、超临界流体对目的物有较大溶解度和较好选择性

3、超临界流体化学性质稳定、无毒、无腐蚀、不易燃易爆

4、超临界流体价廉、易得

常用超临界流体：

CO2（最常用）、C2H6、C3H8、C4H10、C5H12、CClF3

△五、CO2作为最常用超临界萃取剂原因

1、萃取操作温度为常温：

31.4℃;2、临界压力7.4MPa;3、化学性质稳定，不易燃易爆、无腐蚀;4、无色、无臭、无毒，无污染;5、具防氧化和防好氧微生物活动作用，防腐

6、价廉易得

六、超临界萃取过程中携带剂的作用

作用：

增加超临界流体的极性;常用携带剂：

甲醇、乙醇;用量：

5%左右

△七、超临界流体操作工艺流程（图示原理书上52）

八、影响超临界萃取效果的因素及控制

1、温度：

影响密度和黏度，控制在临界点附近；2、压力：

影响密度和黏度，控制在临界点附近或较高压力；3、原料颗粒度：

影响流体渗透和溶解速度，控制在20-80目；4、萃取时间：

影响萃取率，稍长些好，太长耗时；5、流速：

太高----浪费，太低----萃取效率低

6、携带剂：

影响极性，进而影响溶解度，5%左右

九、超临界萃取应用PPT

食品工业 ：

啤酒花、咖啡豆脱咖啡因，植物动物油提纯，植物色素的提取、保健因子提取

第六章浓缩技术

浓缩—从溶液中去除部分溶剂或水使目的物浓度增大的过程。

浓缩的目的：

去除部分水或溶剂，便于运输;提高溶质浓度，便于保藏或纯化

常见浓缩过程：

蒸发浓缩、冷冻浓缩、膜浓缩

第一节蒸发浓缩

使含有不挥发性溶质的溶液沸腾汽化并移出蒸气，从而使溶液中溶质浓度提高的单元操作称为蒸发浓缩，所用的设备称为蒸发器。

一、类型

常压蒸发浓缩、真空浓缩;单效蒸发、多效蒸发;间歇蒸发、连续蒸发

二、几个概念

生蒸汽：

第一次引入第一个蒸发器的蒸汽;二次蒸汽：

从第一个蒸发汽蒸发出的蒸汽

单效蒸发：

单次蒸发;多效蒸发：

将二次蒸汽引入下一级作蒸发热源

三、蒸发浓缩设备:

膜式、非膜式（分类依据）（掌握原理及分类图示）

（一）非膜式蒸发器:

也称再循环式蒸发器

1.中央循环管式蒸发器:

缺点:

循环速度小、热损失大、清洗检修麻烦

2.悬筐式蒸发器,3.外加热式蒸发器;4列文式蒸发器5,强制循环蒸发器

△

（二）膜式：

料液在加热面呈膜状流动，也称单程型蒸发器（原理优缺点，适用见PPT）

1.升膜式蒸发器

2.降膜式蒸发器

3.升降膜式蒸发器

4.刮板蒸发器

第二节冷冻浓缩

1.原理：

在溶液中溶质的浓度低于低共熔点条件下，将溶液降温至冰点，水或溶剂结晶析出。

cf:

低共熔点——共沸点

低共熔点温度：

低共熔点就是在降温的过程中，料液组织内溶质浓度增加到一定浓度后冰晶体不再析出，溶剂和溶质一起凝结时的温度。

低共熔点浓度：

此时溶质的浓度，是水或溶剂可结冰的溶质最高浓度。

2.冷冻浓缩的优点：

活性成分保存好；缺点：

受溶液浓度的限制（多不超过40-50%）；微生物和酶得不到抑制；溶质流失。

3·其他浓缩方法：

吸收浓缩（通过吸收剂直接吸收除去溶液中溶剂分子使溶液浓缩的方法）；膜浓缩

第七章沉淀技术

概念：

加入有机或无机沉淀剂或改变环境条件，使目标物溶解度降低而沉淀下来的分离方法。

（从液相中析出固相，属初级分离纯化技术；具有浓缩和初步分离作用）

缺点：

形成不定形固体颗粒，构成成分复杂，易夹杂共存的杂质、盐、溶剂等物质。

分类：

盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；成盐沉淀法等。

第一节盐析沉淀法

一、盐析原理

概念：

利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。

原理：

※低盐浓度——盐溶，高盐浓度——盐析

1.盐离子的水合作用降低了自由水的浓度，摧毁了蛋白质的水化层，疏水区露出使生物分子相互聚集而沉淀。

2.盐离子中和了蛋白质表面的电荷。

二、常用的盐析剂

选择依据：

价廉，废液可肥田；分级效果好；溶解度大且随温度变化小；能使蛋白质稳定

常用盐析剂：

硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠等

几种盐的特点：

硫酸铵缺点：

水解变酸；高pH释放氨气；残留影响风味；有一定的毒性。

硫酸钠：

低温时溶解度较低，但不含氮，适于热稳定性高的胞外蛋白的盐析。

磷酸盐、柠檬酸盐：

缓冲能力强，但溶解度低，易与某些金属离子生成沉淀。

三、硫酸铵的使用规则

A,硫酸铵的加入方式：

直接加入固体粉末；加入硫酸铵饱和溶液

B,使用硫酸铵应注意的问题

1,加50mmol/L磷酸缓冲溶液，防止变酸。

2.进行硫酸铵盐析要预先进行分级试验，逐级沉淀分离。

3.温度升高蛋白质溶解度降低（高盐），一般控制在4℃左右。

4.pH一般控制在等电点。

5.盐析沉淀产品最后要脱盐。

应用：

免疫球蛋白和酶的提取纯化，中药三七皂甙的提取，人干扰素等

第二节有机溶剂沉淀法

一、原理;概念：

向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。

机理：

1.亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，溶质分子的水化度降低，溶质分子间静电引力增加，易聚集形成沉淀。

2.亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

优点：

溶剂易蒸发除去或离心除去，分辨率较盐析高

缺点：

易使蛋白质变性；溶剂易挥发、易燃、易爆，安全性要求高；使用量较大，成本高

△二、常用的有机沉淀剂:

乙醇:

沉淀作用强，沸点适中，无毒，最常用

丙酮：

沉淀作用大于乙醇，沸点较低易损失，燃点低，有肝脏毒性

选择时考虑的因素：

介电常数小，沉淀作用强;;对生物分子变性作用小

毒性小，挥发性适中;能与水无限互溶

三、使用原则

A,低温、少量多次加入，加入时缓慢搅拌:

有机溶剂加入水中——发热，控制温度

B,等电点沉淀:

控制适宜pH值，注意使同种溶液中目的物与主要杂质带同种电荷

C,少量盐存在能保护蛋白质:

助沉剂：

低浓度的单价盐，如醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等Zn2+、Ca2+等

第三节等电点沉淀法

原理：

两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。

调节溶解的pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。

优点：

操作简便，溶剂消耗