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脂质体电动色谱用于评价药物透皮吸收

王永军，刘洪卓，孙进，孙英华，刘晓红，何仲贵※

（沈阳药科大学药学院生物药剂学研究室，辽宁沈阳，110016）

摘要：

目的采用脂质体电动色谱法对药物透皮吸收进行评估。

方法测定22个不同种类化合物的保留因子（k），采用逐步回归法在药物透皮参数（logKp）和logk及其它简单理化参数之间建立定量保留活性关系（quantitativeretention-activityrelationships,QRARs）。

结果建立了药物透皮参数（logKp）和logk、分子量、化合物OH、NH键数目之和之间的相关方程，相关系数R2=0.902。

结论脂质体电动色谱在预测药物透皮系数方面展现了良好的应用前景。

关键词：

脂质体；电动色谱；透皮参数；逐步回归

Predictingskinpermeabilityusingliposomeelectrokineticchromatogrpphy

YongjunWang,HongzhuoLiu,JinSun,YinghuaSun,XiaohongLiu,ZhongguiHe※

ABSTRACT:

OBJECTIVEToestimatedrugpenetrationthroughskinusingliposomeelectrokineticchromatography.METHODSTheretentionfactoroftwenty-twostructurediverselycompoundsweredetermined,quantitativeretention-activityrelationshipswereconstructedbetweenskinpermeationcoefficientsandlogkandotherphysicochemicalparametersbystepwiseregressionmethod.RESULTSaquantitativeretention-activityrelationships（QRARs）wasconstructedbetweencompoundskinpermeabilitycoefficient（logKp）andlogk,molecularweight,thecountsofOHandNHofmoleculebystepwiseregressionmethod（R2=0.902）.CONCLUSIONSInaword,LEKCisapromisingrapidtooltopredictdrugpenetrationthroughskin.

课题获国家自然科学基金No.30400563和辽宁省自然科学基金No.20052058资助。

作者简介：

王永军，男，沈阳药科大学药剂系讲师，博士。

email：

i_maple@

※通讯作者：

何仲贵，男，沈阳药科大学药剂系教授。

Tel：

（024）23986320，email：

hezhonggui@

KEYWORDSliposome;electrokineticchromatography;skinpermeationcoefficients;stepwiseregression

借助毛细管电泳仪，把脂质体溶液加入到毛细管中作为运行溶液，脂质体作为一种假固定相（pseudostationary），加压运行后，测试溶质依靠其自身的电泳属性以及分配进入脂质体程度的不同而分离，称之为脂质体电动色谱（liposomeelectrokineticchromatography,LEKC）。

LEKC作为一种定量分析技术，不具有什么特别的优势，但由于脂质体的组成、结构及性质与生物膜的相似性，脂质体作为一种类生物膜，用于研究药物与生物膜的相互作用时有其独特的优势。

目前对于LEKC的研究报道主要集中在基础研究方面，包括脂质体在毛细管电泳中的迁移机制[1-3]，LEKC中药物与脂质体的作用机制等方面[4-7]，应用研究报道较少[8-9]。

当前，药物化学高速发展，化合物数目急剧增加，同时中药中蕴含数目庞大的天然化合物，这些都使得适宜体内药动学特征的药物筛选成为新药开发的瓶颈，脂质体同天然生物膜结构上的相似性与毛细管电泳的快速高效性相结合，为突破这一瓶颈提供了强有力的工具。

皮肤由表皮、真皮和皮下组织三部分组成，此外还有汗腺、皮脂腺、毛囊等附属器。

表皮由内向外可分为五层，即基层、棘层、粒层、透明层和角质层，其中表皮中的角质层性质与其它各层有较大差异，是药物透皮吸收的主要屏障。

角质层主要由角蛋白和脂类成分组成，这些脂类成分包括磷脂、鞘磷脂、胆固醇和一些脂肪酸。

角质层中不存在主动转运的活性蛋白，完全是一个被动转运的屏障。

因此，我们有理由认为药物的透皮吸收与其亲脂性密切相关。

本文收集了22个有皮肤渗透系数（logKp）的化合物，拟在药物在LEKC上的保留因子和透皮参数之间建立一种定量保留－活性关系，用于预测未知化合物的透皮吸收，初步考察它们与透皮参数的相似性。

1实验条件

1.1试药、试剂及仪器

试药：

苯、间苯二酚、氢化可的松、酮洛芬、双氯芬酸等为沈阳药科大学药剂、药分教研室提供。

试剂：

蛋黄磷脂（磷脂酰胆碱含量>97.5%，PC），购自上海东尚实业有限公司；大豆磷脂酰丝氨酸（磷脂酰丝氨酸>91.9%，PS），氢化磷脂（HPC），胆固醇（Chol），购自北京百威昂医药技术开发有限公司；Polybrene（PB）、dextransulfate（DS）（MWav=500000）、壬基苯酮，购自Aldrich-Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）购自，二甲基亚砜（DMSO）、甲醇等均为分析纯试剂。

仪器：

JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）；LS230型激光衍射粒径分析仪（贝克曼－库尔特公司）；HPCE-10毛细管电泳仪（大连江申分离科学技术公司）。

1.2电泳条件

熔融石英毛细管（河北永年锐沣色谱器件有限公司），总长43cm，进样端距检测窗38cm，内径50µm；温度：

室温；电压：

+10~20kV；检测波长210nm。

全新熔融石英毛细管的预处理：

1MNaOH溶液冲洗30min；0.1MNaOH溶液冲洗10min；重蒸水冲洗20min。

涂层毛细管的制备：

将全新熔融石英毛细管预处理后，以5%PB溶液冲洗15min，静置10min；以3%DS溶液冲洗15min，静置30min，重蒸水冲洗10min备用。

1.3脂质体的制备

称取适量磷脂至250mL圆底烧瓶中，加入氯仿－甲醇（9:

1，V/V）10mL溶解；60℃水浴减压蒸馏30min除去有机溶剂；将预热至60℃的20mM的pH5.5磷酸盐缓冲溶液加入烧瓶中，水化分散；探头超声20min，参数设置为超声3s，间歇2s，功率200W；然后经0.22-μm微孔滤膜过滤，充氮气4℃条件下冷藏备用。

1.4溶质在LEKC上保留因子的计算[10]

Eq.

（1）

Eq.

（2）

公式1、2分别为中性和荷电溶质保留因子的计算公式，tr、teo、tlip分别为溶质在LEKC上的出峰时间、电渗流出峰时间（甲醇、二甲基亚砜等标记）、脂质体出峰时间（壬基苯酮等标记），t0为带电溶质在CZE下的运行时间。

2结果与讨论

2.1定量保留-活性关系的建立

为建立一种定量保留－活性关系，用于预测未知化合物的透皮吸收，收集了22个有皮肤渗透系数（logKp）的化合物，分别采用含有胆固醇脂质体和不含有胆固醇脂质体测定其LEKC保留因子，结果见表1。

表1Tab.1

对logkChol或logk与logKp之间进行相关性研究，没有发现它们之间有显著的相关性。

Lien等人曾报道如下的logKp预测模型，见Eq.（4-2）[13]。

logKp=k1logP+k2MW+k3Hb+k4Eq.（3）

logP为正辛醇/水分配系数，MW为分子量，Hb指代的是化合物氢键的数目，k1、k2、k3为回归系数，k4为回归常数。

为建立化合物LEKC保留因子与logKp之间的预测模型，我们引入了MW/100、OsNs、OHsNHs、PSA等理化参数，以逐步回归方法剔除不显著的参数，最后引入的参数中只保留了MW/100和OHsNHs，回归结果见下：

logKp=0.42（0.13）logkChol–0.92（0.09）

–0.37（0.08）OHsNHs+0.20（0.18）Eq.（4）

R2=0.935,SE=0.379,n=22

logKp=0.44（0.17）logk–0.89（0.10）

–0.40（0.09）OHsNHs+0.10（0.19）Eq.（5）

R2=0.923,SE=0.410,n=22

为与正辛醇/水系统作以比较，同样进行回归处理，结果如下：

logKp=0.19（0.10）logP–0.97（0.11）

–0.26（0.13）OHsNHs–0.37（0.31）Eq.（6）

R2=0.911,SE=0.441,n=22

从上述等式看，以含有胆固醇脂质体的LEKC建立了最好的相关模型，即Eq.（4），因为Eq.（4）有着最高的相关系数（R2=0.935）和最小的均方根误差（SE=0.379）；而以正辛醇/水系统建立的模型相对较差，因为Eq.（6）有着最大的均方根误差（SE=0.441）和最低的相关系数（R2=0.911）。

从等式的系数看，logk、logP与logKp正相关，而MW/100、OHsNHs与logKp负相关。

因为logk、logP是化合物的亲脂性参数，这也正说明了化合物的亲脂性增加更有利于其渗透进入皮肤，而亲水性的化合物则不易渗透进入；MW/100代表的是分子体积，描述的是分子体积对其从水相分配进入生物膜及通过生物膜扩散的影响；OHsNHs指代的是化合物分子的氢键供体数目，与logKp的负相关说明化合物分子氢键供体数目增加不利于其渗透进入皮肤。

2.2模型验证

由于所收集的化合物数目较少，只有22个，不足以分为测试集和验证集对相关模型进行验证，所以我们采用了leave-one-out的方法进行模型验证。

所谓leave-one-out模型验证就是在总的数据（n）中去掉一个数据，用余下的数据（n-1）建立模型来预测去掉的这个数据，如此类推，经过n次迭代计算，即可获得n个预测数据，将原试验值与测试值进行相关比较来考察所建立模型的预测能力。

采用该方法分别对Eq.（4）、Eq.（5）、Eq.（6）进行模型验证，各预测值见表2，相关散点图见图1、2、3。

表2Tab.2

图1Fig.1

图2Fig.2

图3Fig.3

从图1、2、3可看出，基于LEKC建立的Eq.（4）预测的logKp值与试验值有最好的相关性（R2=0.934），而基于正辛醇/水系统建立的Eq.（6）的预测能力相对较差（R2=0.911）。

这是由于脂质体与正辛醇/水系统的本质差别造成的，logP描述的仅是化合物分子形态在两相中的分配，而化合物的解离状态强烈影响其在皮肤中的渗透性。

2.3与文献模型的比较

把文献报道的皮肤渗透模型与我们建立的模型加以比较，总结见表3。

Flnn等[14]最先报道了logKp与logP之间的相关性，R2=0.26，所测试的化合物有90种，分子量从18~750，logP从-3~6；Potts等[14]在Flnn研究的基础上，引入了分子量，并减少了化合物数量至42种，R2=0.82；Lien等[15]又在Potts的基础上引入氢键项Hb，进一步减少测试化合物至23种，R2=0.93；Barbato等[16]用IAM考察了10种药物的亲脂性，经过考察发现除疏水作用力外其它作用力强度的总和（ΔlogkIAM）与logKp呈负相关，R2=0.91；Medina-Hernandez等[17]用BMC测定化合物亲脂性，在引入熔点项的基础上，测试了43种化合物，R2=0.79。

各个预测模型所测试的化合物数目种类不一样，无法进行直接比较。

但从相关系数看，我们所建立的模型给出了最好的结果，并且所测试的化合物性质、结构更多样，更具代表性，另外LEKC技术的高通量筛选优势也是上述模型所无法比拟的。

表3Tab.3

3结论

测定了22个化合物pH5.5条件下的LEKC保留因子，采用逐步回归的方法，引入其它理化参数，建立了药物透皮参数logKp与logk、MW/100、OHsNHs之间的预测模型。

结果表明含有胆固醇脂质体所建立的模型比没有胆固醇脂质体所建立的模型，相关系数更高、方程均方根误差更低。

采用leave-one-out方法对模型进行了验证，结果也表明了较之正辛醇/水系统，脂质体在本质上更为接近于生物膜。

与文献报道的其它预测模型相比较，本研究所测试的化合物性质、结构更多样，模型更具代表性，LEKC技术也更具高通量筛选优势。

参考文献

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530-537

表1渗透系数的试验值以及各种试验和计算的理化参数

Table.1Experimentalpermeabilitycoefficientsandexperimentalandcalculatedphysicochemicalparameters.

Compounds

ExperimentallogKp（cm/h）[12]

logP

logkChola）

logkb）

MW/100c）

OHsNHsd）

Amobarbital

-2.64

2.11

-0.69

-0.64

2.26

2.00

Aniline

-1.66

0.84

-1.37

-1.04

0.93

2.00

Phenol

-1.90

1.46

-1.16

-0.64

0.94

1.00

Anisole

-1.60

2.11

-0.35

-0.11

1.08

0.00

Benzylalcohol

-1.77

1.10

-1.27

-0.45

1.08

1.00

Ibuprofen

-1.44

3.68

0.11

0.13

2.06

0.00

Indomethacin

-3.67

3.08

-1.05

-0.99

3.58

0.00

Ranitidine

-4.05

0.63

-1.13

-0.76

3.14

3.00

Hydrocortisone

-4.72

1.43

-0.36

-0.12

4.33

2.00

Famotidine

-4.79

-0.52

0.15

0.16

3.37

5.00

Chlorphenamine

-2.66

5.80

0.62

0.62

2.75

1.00

4-Chlorophenol

-1.48

2.40

-0.49

-0.20

1.29

1.00

4-Bromophenol

-1.44

2.59

0.17

0.18

1.73

1.00

4-Methylphenol

-1.82

1.97

-0.50

-0.10

1.08

1.00

Ethylbenzene

0.08

3.17

0.62

0.60

1.06

0.00

Toluene

0.00

2.64

-0.02

-0.02

0.92

0.00

Benzaidehyde

-0.85

1.48

-0.88

-0.79

1.06

0.00

2-Naphthol

-1.55

2.84

0.80

0.80

1.44

1.00

Phenobarbital

-3.35

1.24

-0.83

-0.54

2.26

2.00

Ephedrine