高效液相色谱法在食品工业上的应用doc课件.docx

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高效液相色谱法在食品工业上的应用doc课件

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环境与化学工程学院

给水排水101班

董丹丹

41004050133

高效液相色谱法在食品工业上的应用

高效液相色谱法是六十年代末、七十年代初发展起来的快速分离分析的方法。

它的基础是液相柱层析［1］。

由于新型固定相、性能良好的高压输液泵以及具有选择性的高灵敏的检测器的使用,尤其是近年来利用电子计算机进行自动化控制及数据处理,使液相色谱法得到了很大的发展。

高效液相色谱法被广泛应用于许多领域,同样亦被应用于食品分析领域。

它不仅可以对食品中各类营养成分及含量进行分离和测定,而且还可以对食品中残留的一些有害的微量物质及在食品腐败过程中产生的各种毒素进行分析［2］,从而向人们展示出高效液相色谱法在食品分析中的重要地位。

食品是人类生活中不可缺少的必需品。

各种食品具有不同的特性和营养成分,直接关系人体的健康。

在食品生产过程中往往需要添加防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素、甜味剂、保鲜剂等化学物质,它们的含量过高对人体健康不利。

此外食品在生产、包装和运输过程中可能会被化学物质污染,如发生农药残留、兽药残留等,危害人体健康。

因此食品分析的重要性日益显著。

在食品分析中应用较广泛的是高效液相色谱法（HPLC）。

因此广泛应用于食品、生物、医药、环境等方面,为食品工业中原材料筛选、生产过程中质量控制、成品质量检测等提供了有效的分析手段。

1、食品中营养成分的分析

1．1糖类的分析

糖的含量是食品质量控制的一个指标。

由于糖的结构特殊及其本身中不含有强紫外和荧光吸收的官能团,一般采用示差折光检测器检测,但该检测器灵敏度较低,对糖的检测限一般在微克级水平,且不能使用梯度洗脱,使糖的分离测定受到一定限制，对糖类物质的检测已报道多种方法，如高效液相色谱法、气相色谱法、纸层析法及酶法等[3]。

其中气相色谱法是测定糖及酸类物质较常用的方法，但因糖类物质沸点高，不易气化而需对其进行衍生化处理，方法繁琐且易产生误差[4]；纸层析法灵敏度较低，操作过程繁琐，定量困难，难以满足检测需求；酶法进行样品测定时常受微生物培养基成分的干扰，且用该法对乳糖测定需先将其还原为单糖再进行，样品处理较复杂，易产生误差；高效液相色谱法（highpressureliquidchromatography，HPLC）用于测定糖类物质，可快速、准确、可靠的对样品组分进行定性或定量检测，样品处理方法简单、快速【5】。

1．2　食品中蛋白质的分析

蛋白质是由几十到几千个氨基酸分子借助肽键和二硫键相互连接的多肽链,相对分子质量达104～106,而且在溶液中的扩散系数比较小,粘度大,易受外界温度、pH、有机溶剂的影响而发生变性,并引起结构改变。

这些特性使它们的色谱分离行为远非理想情况,给其HPLC分离带来了实际困难。

因此蛋白质的分离和分析问题至今仍是具有挑战性的课题。

目前,主要采用灌注色谱对蛋白质进行分离,根据灌注色谱的种类可分为以下4种:

灌注反相色谱,灌注离子交换色谱,灌注疏水色谱,灌注亲合色谱。

1．3　有机酸的测定

食品中有机酸和酸味剂是食品酸味和鲜味的重要成分,也对食品的防腐保鲜起重要作用。

食品中的有机酸主要有乙酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸等,少量存在的有机酸还有甲酸、顺丁烯二酸、马来酸、草酸等。

HPLC分析有机酸不仅简便快速,而且选择性好,准确度高。

用HPLC法检测食品中的有机酸,一般用反相C18柱进行分离,流动相为磷酸盐缓冲溶液,磷酸调pH至215～219,常用的磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢铵等。

2、HPLC在食品中的各种添加物质检测中的应用

食品添加剂，指为改善食品的质、色和香味以及防腐保鲜和加工工艺的需要而加入食品的人工合成或者天然物质主要分为防腐剂、甜味剂、天然或人工合成色素抗氧化剂、香精香料等天然食品添加剂一般对人体无害，但目前所使用的绝大多数是化学合成添加剂，有的具有一定的毒性，如不加以限制使用，对人体健康会产生危害因此，测定食品中添加剂的含量以控制其使用量，对保证食品质量保障人民健康具有十分重要的意义。

2.1食品防腐剂的分析测定

苯甲酸和山梨酸是食品中最常使用的两种防腐剂。

对于它们的分析过去常用分光光度法和气相色谱法进行,但要经过繁杂的预处理操作。

近年来发展了高效液相色谱法只需经过简单的处理,就可直接进行测定。

我国秦皇岛卫生检验所的赵惠兰等报导了用高效液相色谱法快速测定饮料中苯甲酸、山梨酸的方法［6］。

他们将饮料过滤后直接注入液相色谱系统。

10—20min可同时测定这两种防腐剂及糖精钠的含量。

该法的色谱条件是：

以uBandapakC18柱为分析柱，含有0.02M醋酸胺的甲醇水（35：

65）溶液为流动相,洗脱速度1ml/min,在254um的紫外检测器进行检测。

该法的回收率97%。

标准差为0.29，变异系数为0.038。

武汉市产品质量监督检验所的周胜银、李增也报导了用高效液相色谱法测定酱油及软饮料类的样品中防腐剂的方法［7］。

2.2测定食品中非食用色素

酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O均为工业染料，用于染丝、麻、皮革等，这3种物质均可以使人致癌，根据GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》规定，这3种物质严禁作为品使用。

但不法商贩利用其颜色鲜艳、着色稳定、价廉的特点非法添加于豆制品中，使腐竹、豆皮的色泽光亮，欺骗消费者，严重危害了广大消费者的身体健康[8]。

建立食品中的酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O染料残留的高效液相色谱同时测定的方法，样品通过提取之后，采用基质固相分散法净化，然后分别用乙醇和乙醇-氨水-水（7∶2∶1）分步洗脱，最后进行HPLC分离、检测。

此法的回收率平均为79％，酸性橙Ⅱ的检出限为0.01mg/kg、碱性橙2的检出限为0.02mg/kg，碱性嫩黄O染料的检出限为0.01mg/kg，相对标准偏差平均为3.53％[9]。

3.HPLC在食品中农药和兽药残留检测中的应用

高效液相色谱法是常用来测定沸点高和热稳定性差的农药残留，使用的色谱分析柱常为C18或C8，常用的检测器有紫外检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器以及极具应用潜力的蒸发光散射检测器（ELSD）。

荧光检测器当前应用较质监园地多，根据氨基甲酸甲酯类农药在碱性条件下易产生甲胺，甲胺与苯二醛反应能产生高灵敏度荧光的特点，可用柱后衍生法、荧光检测器测定氨基甲酸酯类农药残留量。

3.1蔬菜水果中农药残留量的测定

目前蔬菜水果中不同种类农药的残留测定方法主要是气相色谱法（GC）或气相色谱－质谱法（GCMS），但GC对沸点高或热稳定性差的农药需进行衍生化处理，这样就不可避免地增加了样品前处理的难度，也使它的应用受到一定程度的限制。

李永新［10］等建立了同时测定蔬菜水果12种农药残留的反相高效液相色谱分析方法。

将样品捣碎，用乙酸乙酯超声提取，经Florisil固相萃取柱净化、正己烷二氯甲烷（1∶1）洗脱、氮气吹干、甲醇溶解并定容后，采用高效液相色谱柱分离、紫外检测，以外标法定量。

结果表明：

5种有机磷农药、6种拟除虫菊酯类农药和除草剂二甲戊乐灵的检测限为0.114～2.65ng。

应用该法对从市场上随机购买的莲白、小白菜、黄瓜等20个蔬菜样品和苹果、梨等20个水果样品进行检测，其中氧化乐果的检出率分别为55%和45%，辛硫磷的检出率分别为50%和30%，由此可见，国家明文规定的不得用于蔬菜、瓜果的剧毒、高毒农药仍有检出。

测定蔬菜中苯甲酰脲类农药残留量的报道较多。

何红梅等建立了高效液相色谱法分离，紫外检测器检测同时测定蔬菜中除虫脲、氟铃脲、氟苯脲等7种苯甲酰脲类残留量的方法，色谱柱为SunFireTMC18（250mm×4.6mm.id.,5μm），柱温为室温，检测波长为260nm，同时分离的农药种类多，但需梯度洗脱，对仪器要求较高。

丁慧瑛等建立了同时测定蔬菜中除虫脲等11种苯甲酰脲农药残留的液相色谱-串联质谱分析方法，C18柱分离，甲醇-0.005mol/L醋酸铵溶液为流动相梯度洗脱，电喷雾负离子模式离子化，三重四极杆质谱测定，方法回收率为69%～109%，所需仪器并不普及。

苯甲酰脲类农药中除虫脲和氟铃脲的测定居多，胡敏等采用反相高效液相色谱法，C18色谱柱，甲醇-水（75∶25）流动相，254nm波长下用DAD检测器，测定除虫脲的含量。

3.2肉类中残留兽药量的测定

激素是由内分泌腺和散在其它器官的内分泌细胞所分泌的微量生物活性物质，动物和人体内正常时含量甚微，残留于动物性食品中的激素常为性激素，当性激素超过人体正常水平时，会破坏机体的正常生理平衡而呈现不良后果。

因此对食品中激素残留的测定十分重要。

王帆［11］等研究检测大豆异黄酮类保健食品中三种雌激素（雌二醇、雌酮、己烯雌酚）含量的分析法。

采用HypersilODS2Cl8色谱柱，流动相为甲醇水（体积比53∶47），流速1.0ml/min，检测波长280nm，该方法的线性范围在0.5～250mg/L，三种雌激素的最低检出限分别为0.8、0.9、0.4mg/L。

4、食品贮藏过程产生毒素的测定

一些食品在加工过程中会产生化学变化，生成对人体有害的物质。

2002年4月瑞典斯德哥尔摩大学MargaretaTornqvist教授，首次在油炸及焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物——丙烯酰胺（Acrylamide），该毒物很容易经消化道、皮肤、肌肉或其他途径吸收，并能通过胎盘屏障，是一种公认的神经毒素和准致癌物，已被WHO国际癌症研究中心（IRAC）列为可能致癌物质（ⅡA类）。

2005年4月13日我国卫生部发布了“建议全国消费者避免食用油炸薯片和油炸薯条”的公告，呼吁采取措施减少食品中丙烯酰胺可能导致对健康的危害。

柳其芳［12］等检测食品中致癌物丙烯酰胺的固相萃取，二极管阵列检测，反相高效液相色谱测定，用水提取食品中丙烯酰胺，采用C18固相萃取小柱对样品液进行纯化，流动相为甲醇水（体积比5∶95），DAD扫描波长范围190～370nm，检测波长210nm。

结果丙烯酰胺在0.1～10mg/L浓度范围内线性良好，方法检出限为10ng/g。

用建立的方法分析了59份面包、谷类、豆类、坚果类和土豆类食品，结果显示，食品炸焦的程度越深，则丙烯酰胺含量越高。

食品贮藏不当，会引起真菌生长，造成食品的腐败变质，同时有些霉菌产生的霉菌毒素，具有较强的毒性和耐热性。

5、HPLC在联合检测当中的应用

随着人们对检测技术要求的提高，往往需要HPLC联合其他技术手段同时检测，以达到更高效和更灵敏的检测效果液相色谱串联质谱法就是其中常用的一种，它分析速度快，分离能力高，选择性强.

宋欢等采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定了坚果中抗蚜威等18种氨基甲酸酯类的农药残留，HSS色谱柱（50mm*2.1mm），流动相乙腈-10mmol/L醋酸氨，梯度洗脱，电喷雾电离，正离子扫描，选择性离子监测，加标回收率70.16%~89.23%，RSD在1.75~4.65%之间.胡贝贞等建立了液相色谱串联质谱测定了小麦中9种氨基甲酸酯类农药的检测方法，色谱柱为ZORBAXEclipseXDB-C8（5um,150mm×4.6mm），流动相为甲醇醋酸胺溶液（5mmol/L），梯度洗脱，流速0.3mL/min，柱温20℃，正离子模式电喷雾接口，加标回收率65.48%~109.38%之间，RSD为1.25%~8.28%..

6小结

目前，在食品分析中高效液相色谱法是一种高效能、高灵敏度、高准确度及操作简便的分析办法。

随着新型检测的问世及与计算机的联用,高效液相色谱法将在食品分析中发挥更大的作用，为人们的食品安全带来了保障.HPLC技术与其他技术的联用也越来越受到研究者的欢迎，相信在不久的将来，食品检测技术将越来越精细，越来越高效.

参考文献

[1]曾泳怀分析化学（仪器分析部分）（第三版）

[2]于世林.高效液相色谱方法及应用［M］.北京：

化学工业出版社，2000，3.

[3]段善海,缪铭.现代分析技术在酸奶研究中的应用[J].食品科学,2006,27（12）:

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[4]张英春,董爱军,杨鑫,等.高效液相色谱法测定蓝莓果浆糖的组成和含量[J].食品科学,2009,30（6）:

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[5]李琦，张兰威，张英春等，高效液相色谱法测定发酵乳中的乳糖、葡萄糖和半乳糖［J］食品科学，2012,162（04）

[6]周胜银，李珺、色谱、1990；8

（1），54—55

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[9]高效液相色谱法测定食品中非食用色素王荣艳，贾丽，范筱京北京市理化分析

[10]李永新,孙成均,赵剑虹，等.高效液相色谱法同时测定蔬菜水果中的12种农药残留［J］.色谱，2006，24（3）：

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[11]王帆，胡小钟，王勇，等.快速同时检测大豆异黄酮保健食品中三种雌激素的HPLC法［J］.中国卫生检验杂志，2004，14（4）：

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[12]柳其芳，吕玉琼，黎雪慧，等.二极管阵列检测高效液相色谱法测定食品中丙烯酰胺的研究［J］.中国热带医学，2005，5（6）：

1186-1188.中心，北京100089）