凋亡检测.docx

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凋亡检测

一、细胞凋亡的形态学检测

根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

1、光学显微镜和倒置显微镜

（1）未染色细胞：

凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2）染色细胞：

常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有：

HO33342（Hoechst33342），HO33258（Hoechst33258）,DAPI。

三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。

储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5~1mg/ml。

结果评判：

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：

Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（图1）。

3、透射电子显微镜观察

结果评判：

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构（图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

三、线粒体膜势能的检测

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester（TMRM）等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

方法：

将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。

注意事项

1、始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

2、与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。

五、TUNEL法

细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

六、Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

1、Westernblot分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

方法：

收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05%Tween20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→TBS-T洗3次，5~10min/次?

→ECL显影或NBT/BCIP显色。

结果：

2、荧光分光光度计分析

原理：

活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。

根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。

在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。

根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：

收获细胞正常或凋亡细胞?

PBS洗涤?

制备细胞裂解液?

加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?

37°C反应1h?

荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。

结果：

、

3、流式细胞术分析

方法：

收获细胞正常或凋亡细胞?

PBS洗涤?

加Ac-DEVD-AMC?

37°C反应1h?

UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。

细胞凋亡检测技术与方法jmtang转

细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡（PCD:

ProgrammedCellDeath），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。

它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。

细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。

从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。

随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程。

具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法（概括如图1）：

1、早期检测:

1）PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测:

PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生,可能作为免疫系统的识别标志。

AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。

由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的AnnexinV产品，简便快速，10分钟就可完成检测。

其中带荧光标记的AnnexinV-EGFP（EnhancedGreenFluorescentProtein）及AnnexinV-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。

由于融合蛋白AnnexinV-EGFP，EGFP与PS的结合比例为1：

1，还可进行定量检测。

除此之外，还提供生物素偶联的AnnexinV，可通过常用的酶联显色反应来检测。

另外，MACS公司将磁珠包被AnnexinV，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

2）细胞内氧化还原状态改变的检测：

这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。

CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通过荧光染料monochlorobimane（MC体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。

正常状态下,谷光苷肽（glutathione：

GSH）作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。

细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。

这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。

在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。

当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

由于GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。

但有些细胞如：

HeLa和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。

3）细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。

正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后启动caspase级联反应：

细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochromecoxidasesubunitⅣ：

COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。

ApoAlertTMCellFractionationKit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。

4）线粒体膜电位变化的检测：

在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。

随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。

例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。

MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。

正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。

凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。

用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。

CLONTECH公司的ApoAlertMitochondrialMembraneSensorKit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。

但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

2、晚期检测：

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200bp的DNA片段。

对于这一现象的检测通常有以下两种方法：

1）TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end-labeling）

通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP（多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。

美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。

其中，直接标记步骤少，操作简便。

而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。

2）LM-PCRLadder（连接介导的PCR检测）

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。

CLONTECH公司的ApoAlert®LM-PCRLadderAssayKit通过LM-PCR（ligation-mediatedPCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。

此外，LM-PCR检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

3）TelemeraseDetection（端粒酶检测）

这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。

端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。

正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。

研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。

Intergen公司的TRAP-ezeTelemeraseDetectionKit在1996年率先推出。

它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。

如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNALadder现象（参见图4）。

此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.

同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。

3、mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。

据报道，Fas蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxicTcells）等靶细胞。

Bcl-2和bcl-X（长的）作为抗凋亡（bcl-2和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。

一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。

随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。

Intergen公司的Amplifluor™ApoptosisGeneSystems就根据这一新技术原理，通过检测fas,bax-alpha和bcl-X（长的）基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法，随着凋亡机制研究的深入，近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等，CellSignelingtechnology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem&Oncogene公司都紧跟科研潮流，开发了大量的抗体及活性测定产品。

一种深入凋亡机制的高度特异性的检测

——活性Caspase的检测

jmtang转自“基因快讯GeneNews”2001年第1期

随着凋亡机制研究的逐渐深入，对细胞凋亡的检测不再停留在细胞经凋亡诱导后发生的一些普遍现象上。

既然细胞凋亡是一个主动的，高度有序的，多种基因调控，多种酶参与的过程，那么细胞凋亡是怎么触发的？

凋亡信号是怎样在细胞中传递的？

有哪些基因产物参与了凋亡的调控，哪些酶参与了凋亡程序的启动和执行？

近年来的研究取得了很大的进展，研究者们发现了很多与细胞凋亡相关的信号传导途径（参见下图），

对其中一些关键组分，激酶、磷酸酯酶、转录因子等都有了进一步的了解。

同时，发现许多细胞都可通过膜受体与特异性配体，如一些细胞因子，生长因子，肿瘤坏死因子（TNF）等作用，将存活或凋亡信号从胞外传递到胞内，再通过特定的信号传导途径调控细胞凋亡的进程，如通过NF-κB、AKT，PKC等途径抑制凋亡的发生（参见图2）。

而在凋亡程序的启动及执行过程中，有一大类蛋白酶家族：

Caspases，有人称它们为凋亡的效应器，起了非常重要的作用。

它们直接参与了凋亡早期启动，凋亡信号的传递以及凋亡晚期作用于不同凋亡底物（主要是一些DNA酶和一些细胞骨架蛋白），产生细胞皱缩，膜出泡，DNA断裂等等凋亡特征现象。

其中研究得较多是胞外配体FasL、TNF、APO-3L、APO-2L诱导的途径（参见中心插页2彩图）。

细胞膜上有一类被称为死亡受体的膜受体，Fas、TNFR1、DR3、4、5等，它们受到特定的胞外配体诱导后发生低聚合作用，这样它们膜内侧部分就能与特异性接头蛋白（FADD、RAIDD、Apaf1等）结合，再通过特异性接头蛋白激活特定的Caspase，引起Caspase的级联反应，将凋亡信号传至不同的凋亡底物，诱发凋亡特征。

那么，为什么Caspase能够担负凋亡过程中如此重要的角色？

与它的工作相适应，它具有什么样的特征？

从已发现的一大类Caspase家族中，可以归纳出它们的共同特征。

Caspase（Cystein-containing,aspartat-specificproteases）的本质是一些半胱氨酸蛋白酶，其剪切位点是在特异的天冬氨酸（Asp）残基。

它们是ICE（Interleukin-1beta-ConvertingEnzyme）相关蛋白酶家族的成员。

在正常的状态下，它们以无活性的原酶（proenzymes）形式存在，凋亡信号刺激其特异性Asp残基处被剪切后激活，同时释放N-端结构域（Pro-domain）。

所有的Caspase都被剪切在特异的Asp残基，一些上游的Caspase就能次序地激活其它下游的Caspase，形成Caspase级联反应，将凋亡信号一级级传至凋亡底物。

早期研究细胞凋亡机制的生物模型：

线虫，其死亡基因产物CED-3就是一种Caspase，而在脊椎动物中则已衍生出一大类Caspase家族。

表1是目前已发现的一些Caspase的特性，从这张表上可以看到，

Zymogen（kDa）         Activesubunits（kDa）   Activationadapter   Tetrapeptidepreference

Apoptoticinitiators   

Caspase-2（51）         20/12                  RAIDD                DXXDb,c

Caspase-8（55）         18/11                  FADD                （L/V/D）EXDd

Caspase-9（45）         17/10                  APAF-1              （I/V/L）EHD

Caspase-10（51）        17/12                  FADD                 Unknown        

Apoptotic

executioners           17/12                  NAe                  DEXD

Caspase-3（32）         18/11                  NA                   （V/T/I）EXD

Caspase-6（34）         20/12                  NA                    DEXD           

Caspase-7（35）  

CytokineProcessors

Caspase-1（45）         20/10                 ?

CARDIAK             （W/Y/F）EHD

Caspase-4（43）         20/10                  Unknown             （W/L/F）EHD

Caspase-5（48）         20/10                  Unknown             （W/L/F）EHD

mCaspase-11f（42）     20/10                  Unknown              Unknown

mCaspase-12（50）       20/10                  Unknown              Unknown

Caspase-13（43）        20/10                  Unknown              Unknown        

mCaspase-14（30） 20/10                  NA                   Unknown

Invertebrate

caspases               17/14                  CED-4                DEXD

CED-3（56）             22/13                  NA                   Unknown

DCP-1g（36）  

Caspase按照它在凋亡途径中所处位置可分为上游起始性的Caspase（Apoptoticinhibitors）和下游执行的Caspase（Apoptoticexecutioners），此外还有一些与细胞因子信号传递有关的Caspase。

Caspase都由活性亚基和非活性亚基组成，但要在被特异性剪切后才暴露出活性亚基，才具有蛋白酶活性，每种Caspase活性亚基的大小在不同的生物及不同途径中还有所不同。

Caspase的激活需要一些特异性接头蛋白。

它们与底物作用部分有其偏爱的四肽序列。

正由于Caspase在细胞凋亡机制中的重要作用及它们具有的上述特性，针对它们来进行凋亡检测以及凋亡调控机制的研究日益广泛，检测的技术和方法也不断地更新。

目前Caspase的检测主要有两类方法：

抗体法，人工底物及抑制剂法。

确立了Caspase在凋亡过程中起关键作用之后，很容易想到用抗体方法对其进行直接检测，但同信号传导途径中许多其他组分的抗体检测一样，这涉及到活性问题。

并不是能检测到有这个组分就行了，