完整版不同年限不同批次普洱茶HPLCUV指纹图谱研究及其质量评价毕业论文.docx
《完整版不同年限不同批次普洱茶HPLCUV指纹图谱研究及其质量评价毕业论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《完整版不同年限不同批次普洱茶HPLCUV指纹图谱研究及其质量评价毕业论文.docx（27页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
完整版不同年限不同批次普洱茶HPLCUV指纹图谱研究及其质量评价毕业论文
2014年度本科生毕业论文（设计）
不同年限不同批次普洱茶HPLC-UV指纹图谱研究及其质量评价
院－系：
理学院化学系
专业：
化学专业
年级：
2010级
学生姓名：
余明星
导师及职称：
吴娜（讲师）
2014年4月
2014AnnualGraduationThesis（Project）oftheCollegeUndergraduate
TheHPLC-UVFingerprintsDisquisitionandQualityEvaluationofDifferentAgeandBatchaboutPu-erTea
Department:
ChemistryDepartment，SchoolofScience
Major:
Chemistry
Grade:
2010
Student’sName:
MingxingYu
Tutor:
NaWu（Lecturer）
FinishedbyApril，2014
毕业论文（设计）原创性声明
本人所呈交的毕业论文（设计）是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。
对本论文（设计）的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。
作者签名：
余明星日期：
2014年5月6日
毕业论文（设计）授权使用说明
本论文（设计）作者完全了解红河学院有关保留、使用毕业论文（设计）的规定，学校有权保留论文（设计）并向相关部门送交论文（设计）的电子版和纸质版。
有权将论文（设计）用于非赢利目的的少量复制并允许论文（设计）进入学校图书馆被查阅。
学校可以公布论文（设计）的全部或部分内容。
保密的论文（设计）在解密后适用本规定。
作者签名：
余明星指导教师签名：
吴娜
日期：
2014年5月6日日期：
2014年5月6日
余明星毕业论文（设计）答辩委员会（答辩小组）成员名单
姓名
职称
单位
备注
吴娜
讲师
理学院化学系
主席（组长）
黄笃树
教授
理学院化学系
组员
冯绍平
助教
理学院化学系
组员
王泽锋
助教
理学院化学系
组员
摘要
论文以普洱茶7542为研究对象，采用超声波提取，将提取液于HPLC-UV仪上检测，建立了不同年限不同批次的普洱茶HPLC-UV指纹图谱。
以样品组分、响应信号为指标，优化了样品提取溶剂和HPLC-UV仪器检测条件。
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）版》软件和SPSS软件对其最佳提取溶剂和检测条件下建立的不同年限不同批次的普洱茶HPLC-UV指纹图谱进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，其结果为：
不同年限不同批次普洱茶相似度均在0.9以上，以此说明各批次普洱茶之间有良好的相似性，各批次的质量相对稳定；通过聚类分析将19个不同年限不同批次的普洱茶可大致分为三类，同一年的不同批次普洱茶存在微小差异，说明各年限各批次普洱茶之间也存在差异性；同时借助主成分分析验证了不同年限不同批次普洱茶聚类分析结果的准确性。
本论文所建立的不同年限不同批次普洱茶HPLC-UV指纹图谱反映了生产批次和质量差异性，可用于评价普洱茶质量和生产批次，能为进一步控制普洱茶的质量提供参考。
关键词：
普洱茶；指纹图谱；HPLC-UV；质量评价
ABSTRACT
Thispaperregarded7542Pu-erTeaastheresearchobject,extractedbyultrasonic,thentheextractedsolutionwouldbedetectedbyHPLC-UV,andworkedthesamplecomponentsandresponsesignalasindicatorsandoptimizedsampleextractedsolventandHPLC-UVinstrumenttestingconditions.DifferentyearsandbatchesPu-erTeafingerprintswasbuiltinbestexperimentalconditions,andthesimilarityoftheirfingerprintswasevaluatedbyusing“Chinesemedicinechromatographicfingerprintsimilarityevaluationsystem（2004A）",theclusteranalysisandprincipalcomponentanalysiswasperformedbyusingSPSS.ThesimilarityofdifferentyearsanddifferentbatchesofPu-erTeaintheexperimentalconditionswasallabove0.9,whichshowedagoodsimilaritybetweendifferentbatchesofPu-erTeaandqualityofeachbatchofwasrelativelystable.Pu-erTeawasdividedintothreecategoriesviaclusteranalysis.ThereforethePu-erTeaofthesameyearanddifferentbatchesexistedminutedifferences.Moreover,thePu-erTeaofthedifferentyearsandbatchesalsoexisteddifferences.TheresultofprincipalcomponentanalysiswasundifferentiatedaboutdifferentyearsandbatchesPu-erTea,whichshowedthesameanalysisresultsastheclusteringanalysisresult.Theaccuracyofallbatchesofclusteringanalysisresultswasvenfiedbymeansoftheprincipalcomponentanalysis.ThisexperimentthatestablishedthedifferentyearsanddifferentbatchesofHPLC-UVfingerprintidentifiedtheproductivebatchesandthequalitydifferencesofthetea,whichprovidedareferenceforthefurtherqualitycontrolPu-ertea.
Keywords:
Pu-ErTea;Fingerprints;HPLC-UV;QualityEvaluation
目录
1绪论1
1.1普洱茶简介1
1.2指纹图谱技术2
1.3HPLC-UV在指纹图谱中的应用2
1.4指纹图谱用于质量评价的研究3
1.5论文研究的目的和意义4
2实验部分5
2.1仪器5
2.2试剂5
2.3主要材料5
2.4液相色谱条件6
2.5实验步骤7
2.5.1普洱茶样品前处理7
2.5.2普洱茶供试液制备7
2.5.3普洱茶供试液分析7
2.6数据处理7
3结果与讨论8
3.1提取溶剂的选择8
3.2高效液相色谱检测条件的选择8
3.2.1流动相选择9
3.2.2检测波长选择9
3.2.3进样量选择10
3.2.4梯度选择11
3.2.5流速选择12
3.2.6色谱柱柱温选择12
3.2.7检测时间选择13
3.3不同年限不同批次普洱茶指纹图谱的建立14
3.4不同年限不同批次普洱茶指纹图谱相似度评价16
3.5不同年限不同批次普洱茶指纹图谱聚类分析20
3.6不同年限不同批次普洱茶指纹图谱主成分分析20
3.7不同年限不同批次普洱茶指纹图谱方法学验证25
3.7.1重复性试验25
3.7.2精密度试验27
3.7.3稳定性试验28
3.8普洱生茶和熟茶比较分析29
4结语31
参考文献33
致 谢35
1绪论
1.1普洱茶简介
普洱茶是以云南特有的大叶茶（CamelliasinensisKuntze.var.assamicaKitamura）的略粗老叶片[1]即晒青毛茶为原料经过特殊的发酵加工工艺生产制成的散茶和紧压茶[2]，也可以称之为黑茶。
其大叶茶是中国著名茶树良种，为云南大叶茶类茶树品种的总称，可以制成青茶、绿茶、红茶[3]。
在制成普洱茶毛茶后，由于其后期处理工序[4]的不同，所以普洱茶大致可以分为两类：
生茶和熟茶。
生茶是以符合普洱茶产地地理环境的条件下生长的大叶茶新鲜茶叶为原料经过杀青、揉捻、干燥、成型等工序而成的茶，其中若以晒青茶为原料生产制的的紧压茶又称为青饼，是在普洱茶历史中演化成的最早的普洱茶。
而熟茶也以符合普洱茶产地地理环境的条件下生长的大叶茶新鲜茶叶为原料经过湿水、渥堆、翻堆。
干燥等工序后经过存放，待其气味平韵，味质平淡后制成的茶。
此外还有一种被称为晒青毛茶，其是将新鲜采摘来的茶叶经过杀青后直接在阳光下晒干而成的茶，由于它未进行任何人工发酵而保留了茶叶原本的口味，其营养成分也几乎未遭到破坏而被称为最初级、保留最完整的茶。
正是由于普洱茶悠久的文化底蕴和独特的风味品质而被国内外广泛认同，也逐渐成为了云南的地理标志产品。
普洱茶中总多酚、黄烷醇和儿茶素类居多[5]，其次是多糖和蛋白质，而平时听闻的咖啡因、可可碱、矿物质、色素、纤维素等含量较前面的物质含量较低，挥发性物质更是微乎其微，在与其它茶类比较时，其化学成分大致相同，只是普洱茶中可溶性糖含量较高[6]。
在其化合物中研究比较多的是儿茶素、茶色素（茶黄素、茶褐素、茶红素）、黄酮类、茶多酚、咖啡碱等几类物质，其中尤以儿茶素类研究居多。
此外其挥发性物质主要出现在气相色谱的研究中。
在社会高速发展的今天，普洱茶由于其独特的品质和功效而逐渐成为人们所喜爱的绿色饮料。
其具有的减肥、降脂、消炎、抗菌、防癌、抗癌和抗肿瘤等[7]保健的功效也逐渐为人们所关注，而抗氧化却是其具有保健功效的关键机理。
在各种动物及人体实验中，通过比较试验普洱茶和晒青毛茶的降血脂作用[8]发现普洱茶具有较为显著的降血脂功效。
通过对普洱茶对其在体内肝组织氧化损伤的保护作用观察发现[9]，普洱茶能降低血清胆固醇的含量、清除机体自由基从而到达减轻甚至延缓脂肪肝的形成。
其机理可能与茶叶中的多糖和多酚类具有的抗脂质过氧化能力和清除氧自由基有关。
在对普洱熟茶片临床中调节血糖的观察得出普洱熟茶片能降低糖尿病患者空腹时血糖的水平[10]，而且在患者血糖升高幅度较大时，其作用更加明显并不造成肝肾功能的影响的结论。
此外通过研究还发现普洱茶还能够抗病毒，杀菌消炎[11]。
1.2指纹图谱技术
正是普洱茶的功效及保健作用越来越受到人们的喜爱，在市场利益的驱使下，越来越多的不法分子及黑心商家以假乱真，用不正当的手段赢取暴利。
所以在市场调节未起到关键作用的时候，建立起能够正确而又科学的分析方法对普洱茶混乱的市场调节提供参考的基础。
在众多的检测手段中，基于中药材发展起来的中药指纹图谱，正是在十多年的摸索滚爬中为中药的现代化形成了成熟而又先进的检测技术。
普洱茶指纹图谱是指通过多维分析测定手段对普洱茶中复杂多源物质体系进行检测，尽可能全面地获取普洱茶的物质基础——化学成分群的特征信息，并用于普洱茶的质量控制、质量评价以及进一步开发运用的物质信息表征手段和方法[12]。
指纹图谱具有全面性、整体性和关联性特点，能够全面包括检测物有效组分。
近些年来普洱茶指纹图谱技术也得到了迅猛发展，大量批次和产地的普洱茶指纹图谱也逐渐以先进而又强有力的分析手段来建立。
按分析手段可分为薄层色谱指纹图谱（TLC）、高效液相色谱指纹图谱（HPLC）、气相色谱指纹图谱（GC）、紫外光谱指纹图谱（UV）、红外光谱指纹图谱（IR）、质谱指纹图谱（MS）、核磁共振指纹图谱（1H-NMR）。
在其众多分析测定手段中高效液相色谱的重现性好、灵敏度高、分离效果好、适用范围广[13]，已经成为目前研究指纹图谱的主流方法，而且国家标准对于普洱茶中各化学成分的检测也基本采用了HPLC的方法。
UV检测器也具有低噪声，宽线性范围的优点，普洱茶中化学成分的差异能以其特征性的差异性来反映。
所以将HPLC-UV为用于普洱茶指纹图谱的建立提供了强有力的手段。
1.3HPLC-UV在指纹图谱中的应用
在指纹图谱的正式建立之前，各位专家学者需对普洱茶中各类化学成分的指纹图谱进行初步探索和研究，为后面指纹图谱库的正式建立提供基础，所以在普洱茶指纹图谱的研究中大都是先基于高效液相色谱对普洱茶各化学成分和功效的研究。
金裕范[14]在选用云南思茅、红河、大理下关、西双版纳、临沧五个不同产地生产的三年生茶为试药，采用高效液相色谱法检测了茶中咖啡因、（+）儿茶素、没食子酸的含量时发现五个产地的普洱茶中没食子酸含量差异较大，咖啡因和儿茶素含量差异不大。
在倪倩等[15]人对普洱生茶的指纹图谱研究中已经能对不同批次普洱生茶初步建立指纹图谱了。
她们的试验方法所建立的指纹图谱是在充分研究儿茶素及其衍生物类的基础上，既考查了指纹图谱中重复性、精密度、稳定性等方法学，又对主成分峰进行了确认和与两种绿茶（龙井、碧螺春）的指纹图谱进行了比较发现GC，EGCG，ECG这三个峰的的峰差非常显著，而且相似度均在0.9以上，此方法也为普洱生茶质量评价打下了好的基础。
在前面的基础上李文博等[16]人普洱生茶和熟茶中的八种主要成分进行了定性和定量分析并以这八种主要成分含量为指标对普洱生茶和熟茶进行了判别分析、主成分分析和聚类分析。
在充分进行标准曲线和检出限，精密度和稳定性试验，回收率试验的基础上做出统计分析，以此对新样本进行判别分析以提供普洱生熟茶的鉴定，正确率高达92.5%。
在各类研究中我们发现基于高效液相色谱来建立普洱茶指纹图谱已经逐渐成熟，而基于液相中紫外检测建立的指纹图谱大都是中药药材类，并且适用于大批量的样品指纹图谱的建立，也为建立普洱茶的指纹图谱提供了参考。
张志斐[17]先给酸枣仁药材建立HPLV-UV指纹图谱的共有模式，并对不同产地的酸枣仁进行相似度评价。
结果表明建立的指纹图谱可以用于不同产地酸枣仁指纹图谱的测定和质量评价，相似度越高也表明各批次药材的化学成分及其含量的差异性越低，有助于确保药材的质量和疗效。
董海娟[18]建立的穿心莲注射液HPLC/UV特征指纹图谱标示了九个共有峰，并根据10批次测定结果和参照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）[19]制定了此注射液的指纹图谱检测标准，而且还确定了质量控制。
1.4指纹图谱用于质量评价的研究
指纹图谱应用于普洱茶的质量评价及质量控制一直是研究普洱茶的难点和重点问题[20]。
普洱茶不仅种类繁多，成分复杂，而且产地、储藏时间和生产工艺也不相同，这些诸多原因造成了普洱茶的品质的不同。
在普洱茶大部分化学成分研究清晰的成果基础上建立起质量评价的分析方法是为普洱茶的检验标准提供可行的参考，而且随着分析技术的发展普洱茶评价甚至质量控制技术也会相对成熟和健全。
但就目前而言，指纹图谱评价技术已经运用于各个领域。
而在茶叶指纹图谱中大部分是通过优化色谱条件来分析各种有效成分，建立良好的线性范围，并以相似度和聚类分析作为参考来评价此色谱条件下茶叶指纹图谱。
余静[21]通过建立分离度、精密度和重复性较好的玄参药材指纹图谱并用于10批次的测定，发现各批次指纹图谱相似度在0.98以上而且各成分存在的差异也可以在图谱中得以反映，由此可以得出指纹图谱可以为中药和天然药物质量评价甚至控制的有效手段之一。
蒋海峰[22]也通过相似度分析和主成分分析法对不同收集地的乳香药材质量进行了综合评价。
结果表明各药材质量不均一且分析结果支持广东的乳香优于其他省区的。
胡燕[23]对南路边茶建立的指纹图谱以48批次样品为对象发现与指纹图谱共有模式相似性良好的八家南路边茶生产企业生产的样品所含化学成分及其相似且质量稳定。
1.5论文研究的目的和意义
通过以上文献的阅读参考，我们发现在应用于质量控制、评价和新药的研发的指纹图谱以其具有的先进性、独特性和合理性而被广泛的开发运用，不仅是中药的发展的可行性工具，更为其应用于其他种类的物质的研究开发提供了参考思路，正式基于以上的分析和考察。
所以参考了中药指纹图谱的研究技术把它应用于普洱茶的指纹图谱的建立和质量评价，不仅能够更好的为普洱茶的评价服务，也更好的为普洱茶的品质提供了重要的保障。
在此基础上通过此次的实验研究能够充分贡献于普洱茶指纹图谱的研究，更为普洱茶的进一步质量控制和制定普洱茶标准研究寻求更可信的研究思路和分析方法。
本篇论文以普洱茶7542及其不同年限不同批次普洱茶为研究对象，通过采用HPLC-UV对不同年限不同批次普洱茶提取液进行检测，建立不同年限不同批次普洱茶指纹图谱，并采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）版》软件对指纹图谱进行相似度评价和SPSS软件进行聚类分析和主成分分析，以此来分析不同年限不同批次普洱茶的整体性和差异性，从而对普洱茶的质量作评价，为其进一步质量控制提供参考。
2实验部分
2.1仪器
表2-1仪器
仪器名称（Name）
型号（Model）
厂家（Producer）
高效液相色谱仪（HPLC）
8030
日本岛津
超声波清洗器
HS-3120
北京恒奥德仪器仪表有限公司
循环水式多用真空泵
SHZ-D（Ⅲ）
天津华鑫仪器厂
旋转蒸发仪
EYELAOSB-2100
天津华鑫仪器厂
数显电子天平
AR1140
奥豪斯仪器（上海）有限公司
2.2试剂
表2-2试剂
试剂
级别
厂家
乙腈（Acetonitrile）
GR
Tedia,USA
甲醇（Carbinol）
AR
天津市凤船化学试剂科技有限公司
甲醇（Carbinol）
GR
Tedia,USA
娃哈哈矿泉水
大理娃哈哈食品有限公司
2.3主要材料
化学分析滤纸、Ⅰ级蒸馏水（实验室自制）、2.5mL一次性针筒、0.45μm有机相滤膜、0.45μm水相滤膜、2mL进样瓶、大益牌（7542）普洱茶生茶和熟茶、不同年限不同批次大益牌（7542）普洱茶生茶。
表2-3不同年限不同批次普洱茶编号
（Thenumberofdifferentyearsandbatches）
编号（Number）
年限批次（YearsandBatches）
1
2000年01批次（001）
2
2001年01批次（101）
3
2001年05批次（105）
4
2002年（02）
5
2003年03批次（303）
6
2004年26批次（426）
7
2004年36批次（436）
8
2005年01批次（501）
9
2005年02批次（502）
10
2005年04批次（504）
11
2005年05批次（505）
12
2006年05批次（605）
13
2006年06批次（606）
14
2006年08批次（608）
15
2006年10批次（610）
16
2007年03批次（703）
17
2008年01批次（801）
18
2009年01批次（901）
19
2009年12批次（912）
2.4液相色谱条件
岛津高效液相色谱仪（HPLC），岛津紫外检测器（SPD-20A），色谱柱：
岛津（VP-ODS-C18,5μm,2.2mm×150mm），流动相：
甲醇-水，梯度洗脱（见表2-4），流速：
0.3mL/min，分析时间：
45min，柱温：
35℃，检测波长：
210nm，进样量：
1μL。
表2-4高效液相色谱梯度洗脱程序
时间（Time）/min
娃哈哈矿泉水/%
甲醇（Carbinol,GR）/%
0
90
10
4
75
25
15
65
35
45
0
100
2.5实验步骤
2.5.1普洱茶样品前处理
将购买的普洱茶样品茶叶按样品处理方法中的四分法平均将其分成四份，取其中一份用研钵进行粉碎，过60目的筛子。
将粉碎好的茶叶粉末置于干燥的具塞广口瓶中密闭保存。
2.5.2普洱茶供试液制备
称取粉碎茶粉约0.5000g，置于具塞三角瓶中加入50mL甲醇，在提取温度（T）为30℃，功率（W）为3KW的超声仪中超声30min。
将超声好的普洱茶样液常压过滤，过滤后转移至50mL梨形瓶中。
在水浴温度为60℃的旋转蒸发仪上真空浓缩至近干，再加入甲醇（GR）定容至2mL。
用安好0.45μm有机相滤头的2.5mL一次性针筒过滤并注入进样品瓶。
2.5.3普洱茶供试液分析
将装有普洱茶供试液的样品瓶放入高效液相色谱仪自动进样室按照2.4中液相色谱条件进行分析。
2.6数据处理
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004（A）版》、SPSS19.0软件和《中药色谱图分析和数据管理系统》处理。
3结果与讨论
3.1提取溶剂的选择
在常用的样品制备方法中选取醇提和水提作比较。
参照2.5.2中普洱茶供试液制备方法制备甲醇提取液和水提取液并以2.4中高效液相色谱条件来做分析，其结果如图3-1。
图3-1普洱生茶提取溶剂选择对照图
从图中可以看出用甲醇制备样品较水制备样提取成分较多，峰的分离也较好，化学成分的响应信号也较强。
由此确定用甲醇来作为制备普洱茶的供试液的试剂。
3.2高效液相色谱检测条件的选择
检测条件的准确性不但影响各化学成分的分离，还直接影响了指纹图谱的建立，所以分别选择流动相、流速、波长、梯度、进样量、柱温和检测时间为对象来确定指纹图谱建立的高效液相色谱条件，最后以各种实验条件下检测的谱图作参考来确定各个实验条件并确定指纹图谱建立的检测条件。
得出的最佳检测条件为：
将普洱茶甲醇提取供试液以A：
娃哈哈纯净水和B：
甲醇（GR）为流动相，在35℃柱温、210nm波长和0.3mL/min流速条件下进1μL的普洱茶样品液并以0~4min,10~25%B;4~15min,25~35%B;15~45min,35~100%B梯度洗脱，分析时间为45min。
3.2.1流动相选择
高效液相色谱中流动相的选择大都选择有机试剂，而且实验室中的自动进样针的洗液为1:
1的甲醇-水，则将甲醇-水作为参考流动相。
此外常用的有机试剂流动相还有乙腈，因此也选择了乙腈-水为对比流动相。
结果如下（见图3-2）
图3-2高效液相流动相的选择对照图
升级会员 