绿色荧光蛋白的基因克隆与表达论文.docx

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绿色荧光蛋白的基因克隆与表达论文

湖北师范学院

分子生物学综合试验论文

论文题目

绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆和表达

作者姓名

樊恒达

专业名称

生物技术

准考证号

2008114020308

指导教师

王友如

中国·黄石

绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆和表达

樊恒达

（湖北师范学院生命科学学院0803班学号：

*************，湖北黄石）

摘要

目的：

研究绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达。

方法：

从E.coliDH5ɑ中用碱法提取质粒的方法提取质粒pET-28a-GFP。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对酶切后的质粒进行电泳，用以确定已经提取的质粒中含有GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coliBL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

最后用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

结论：

本实验对学生掌握最基本的分子生物学试验技术奠定了基础。

关键词：

绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化

GreenFluorescentProtein（GFP）GeneCloningandExpression

FanHengda

（class3grade8,collegeofbiologyscience,HubeiNormaluniversity,HuangShi）:

Abstract

Objective:

searchingforthephenomenonofgreenfluorescentproteingene’scloningandrestructuringexpressionintheE.coli.Method:

drawingplasmidpET-28a-GFPfromE.coliDH5ɑbyusingthemethodofAlkaliDistillation.ThentheselectedproductioncanbeelectrophoredbyusingtheAGE,inordertomakesuredrawingsuccessfullyplasmidfromE.coli.TheselectedplasmidiscuttingbytheextinctionenzymesBamHIandNotIandtheslicedplasmidcanbeelectrophoredbyusingtheAGEinordertoensuretheselectedplasmidcontainingGFPgene.ConvertingtheplasmidhavinggeneofGFPintothefeelingstatesE.coliBL-21cellsandcultivatingitlargelythroughtheLBmedium.FinallytheIPTGcanguidetheexpressionofGFPgeneandwecanseelightgreenclonies.Conclusion:

Thisexperimentsetsupfoundationforstudentstomasterthebasicalexperimentaltechnologyofmolecularbiology.

引言：

2008年10月8日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白（GFP）的发现者和推广者。

【1】绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。

近年来在生物化学和细胞生物学中成为应用最为广泛的标记性蛋白之一。

基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。

在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。

材料与方法

1材料

1.1材料：

大肠杆菌DH5ɑ购自微生物实验室，质粒pET-28a-GFP由本实验室保存，限制性内切酶BamHI和NotI购自TaKaRa公司。

1.2仪器：

GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）；雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）；超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）；电子天平TE412-L，TE2101-L；BS-1E振荡培养箱（江苏省金坛市亿通电子仪器厂）；SW-CJ-1FD双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱；高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）；蓝盾可见光透射仪、凝胶成像仪、酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、离心管、高速冷冻离心机、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、恒温水浴锅等。

1.3试剂：

溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0）10mMEDTA），溶液Ⅱ（0.2NNaOH，1%SDS），溶液Ⅲ（5MKAc60ml，冰醋酸11.5ml）由上海生工公司提供；BL21，琼脂糖，LB培养基，冰块等其他材料均为本实验室保存。

2方法

2.1重组质粒（pET-28a-GFP）的构建（该过程由指导老师完成）

DH-5ɑ（Pds-RFP-N1）DH-5ɑ（pET-28ɑ）

质粒提取质粒提取

质粒Pds-RFP-N1质粒pET-28ɑ

酶切回收酶切回收

插入片段载体片段

连接

重组质粒（pET-28ɑ-RFP）

转化

DH-5ɑ（pET-28ɑ-RFP）

2.2碱法提取质粒

取1.5ml培养液倒入eppendorf管中，10000rpm离心1min。

重复以上操作。

弃上清，菌体沉淀悬浮于200ul溶液I中，室温下放置10min。

加入新配置的溶液II300ul,盖紧管口，倒置离心管，温和震荡三次，使沉淀混匀，冰浴3min，10000rpm离心10min。

上清液移入eppendorf,管中，加入等体积的氯仿/已戊醇（24：

1），震荡混匀，10000rpm离心2min。

将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，震荡混匀后，置室温下2min，然后10000rpm离心5min。

弃上清,室温干燥。

将沉淀溶于30ulTE缓冲液（Ph8.0,含20ulRNase）中,保存在20℃冰箱中。

2.3质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳

配胶：

加20ml1×TBE缓冲液于三角瓶中,精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，冷却至60℃左右，轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上，将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，取5μl质粒DNA及2μlGeneFinder混匀上样，80v约电泳2小时，蓝盾可见光透射仪观察结果。

2.4质粒的限制性内切酶反应分析

按如下双酶切体系（30μL）混合。

反应物加入量uL

质粒8

BamHI0.5

NotI0.5

10×bufferK2

TritonX-1001

ddH207

0.1%BSA缓冲液1

混匀离心10s，混匀，37℃水浴酶切2h，之后进行电泳。

配置1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶30ml。

适当放置冷却，45℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。

待凝胶凝固好以后，拔下梳子。

酶切样品中加入5ul溴酚蓝GeneFinder混合液混匀，上样。

1×TBEBuffer，80V（3-4V/cm）下电泳30min。

荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况，并照像。

2.5.E.coliDH5α感受态细胞的制备及转化

将菌种在LB37℃250rpm过夜培养。

将菌液分装在干净eppendorf管中，放置冰上10min。

4000rpm离心2min，弃上清得菌体。

加入0.1mol/LCaCl2600uL缓和悬菌，放置冰上10min。

4000rpm离心10min.弃上清得菌。

再加入0.1mol/LCaCl2100uL缓和悬菌放置冰上待用。

向管中加入8uL重组质粒，成分混合后置冰上10min。

在42℃恒温水浴锅中热激70s，马上置冰上10min。

再向管中加入400uL液体LB培养基在37℃振荡培养箱中100rpm培养1h。

取200uLLB培养基涂平板，平板正放2h后在倒放摇床培养。

取100uL菌液涂于相应的选择培养皿，37℃过夜培养。

挑取培养皿中的单菌落于试管培养基（100uL）中再加卡那100uL，37℃恒温培养。

2.6扩大培养

挑取平版中的菌落于含有卡纳霉素的LB培养基中，进行扩大培养。

2.7GFP蛋白的诱导表达

加入IPTG（1：

1000）至终浓度1mmol/L.取1.5mL菌液于干净eppendorf管中，

10000rpm，离心2min；弃上清得蛋白；再加1.5mL菌液10000rpm离心2min，弃上清得蛋白。

用紫外线照射菌体沉淀及培养平板，可以看到绿色荧光。

分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相，保存照片。

分别取IPTG诱导培养液20μl涂布在含Kan＋的固体培养基上，37℃培养20小时。

结果

1：

实验现象

1.1碱法提取质粒的过程中，加入溶液Ⅰ后混合液呈现乳白色浑浊；加入溶液Ⅱ后混合液变为白色无浑浊现象；加入溶液溶液Ⅲ后有絮状沉淀生成并且有分层现象，上沉下清。

1.2碱法提取质粒电泳图,如图1。

有标准相对分子质量DNA的电泳条带和重组质粒pET-28a-GFP的电泳条带相比较，可以得出用碱法提取的是重组质粒pET-28a-GFP。

RNA

图1：

碱法提取质粒电泳图

图的左列数据分别是标准相对分子质量DNA片段的大小，1列是标准相对分子质量DNA的电泳条带；

2列是质粒pET-28a-GFP的电泳条带

Figure1:

AlkaliDistillationPlasmidElectrophoresisPicture

ThedataontheliftofthepicturewerethesizeofstandardrelativemolecularmassDNAfragments

The1werealistwithstandardrelativemolecularmassofDNAelectrophoresisstrip,

The2columnweretheelectrophoresisstripplasmidpET-28a-GFP

1.3酶切质粒电泳，如图2。

质粒经酶切后得到的载体质粒pEGFP-N3和GFP基因，而RNA的含量很高。

图2对取出的质粒进行酶切后的电泳结果

Figure2resultsofelectrophoresisofcuttingobtainedplasmidbyenzyme

M为标记组（marker）,第一泳道为实验组。

1.4重组质粒的转化及阴阳性对照阴性对照显示抗性平板上无菌落出现，表明感受态细胞中不含目标质粒DNA。

阳性对照显示抗性平板上的出现较多菌落，表明感受态细胞活力较好；

图3阴性对照

完全不加质粒DNA的感受态细胞涂平板

Fig3Negativecontrol

ThecompetentcellwithoutplasmidDNAINtheplating

图4阳性对照

标准超螺旋质粒DNA的感受态细胞涂平板

Figure4positivecontrol

ThecompetentcellwithstandardsupercoillingplasmidDNAintheplating

1.5GFP蛋白的诱导表达结果，如图5，图6。

从图5可以看出经扩配后的绿色荧光蛋白沉淀在试管底部，效果不是很明显，从图6可看出，经离心后的绿色荧光蛋白效果很明显。

图5含绿色荧光蛋白的LB培养基

Figure5theLBmediumcontaininggreenfluorescentprotein

图6离心后得到的绿色荧光蛋白

Figure6thegreenfluorescentproteinaftercentrifugalling

1.6紫外灯下看到的绿色荧光蛋白，如图7，图8。

图7紫外灯下的绿色荧光蛋白

Figure7thegreenfluorescentproteinundertheUVlamp

图8紫外灯下各组绿色荧光蛋白

Figure8eachgroupofgreenfluorescentproteinundertheUVlamp

讨论

自GFP被发现以来，一直作为一个监测完整细胞和组织内基因表达及蛋白质定位的理想标记，广泛应用于转基因动物的研究，融合标记，基因治疗，蛋白质在活细胞内功能定位及迁移变化，病原菌侵入活细胞的分子过程等[2]。

由于GFP没有种属的特异性，在真核和原核细胞中都可以表达，不受生物类型，基因型或者细胞类型的限制，因此我我们选用技术较为成熟的大肠杆菌作为受体细胞。

【3】DH5α是扩增菌，BL21是表达菌；DH5α可以使质质粒高拷贝数扩增，BL21利于蛋白的表达。

。

DH5a是是一种常用于质粒克隆的菌株。

E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。

可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

BL21（DE3）菌株，该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。

T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

该菌适合表达非毒性蛋白。

GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。

LacI基因编码调节蛋白，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达。

IPTG可与四聚体调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。

接着BL21编码的T7RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达。

外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。

感受态指细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。

大肠杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生：

将正在生长的大肠杆菌细胞在0℃下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。

除了操作的规范性对感受态制备及转化效率存在一定影响外，CaCl2溶液的浓度也对感受态转化效率也存在很大的影响【4】。

参考文献

1ZhangYuli，ZhangGuizheng，SuHongmei，MengYiying，BiLihui

ApplicationsofGreenFluorescentProteininTransgenicResearch（GuangxiResearchAcademyofSericulturalScience,Nanning530007）

2曲萍隋延仿叶箐张秀敏。

增强型绿色荧光蛋白的基因克隆，表达及蛋白纯化。

山西医学杂志2006年10月第35卷第10期。

3郑婷。

绿色荧光蛋白的原核表达，纯化以及抗体制备。

氨基酸和生物资源。

2005.27

（1）:

40～43

4王友如.大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化（湖北师范学院生物系,湖北黄石

435002）