分子实验.docx

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分子实验

实验一、琼脂糖凝胶电泳

实验二、PCR基因扩增技术

实验三、电泳分析

实验四、扩增片段的回收

实验五、扩增片段与T-载体的连接

实验六、感受态细胞制备

实验七、重组质粒的转化

实验八、转化质粒的提取

实验九、提取质粒的电泳检测

实验十、质粒的限制性酶切分析

实验十一、酶切电泳检测小测

实验一、琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

•通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；

熟悉微量移

•

（一）仪器液器的使用；

二、实验原理

•DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

•核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电；pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。

•在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。

•可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。

　共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

三、仪器、材料与试剂

（二）材料

1.提取的质粒DNA

2.相对分子质量标准品（DL2000）

（三）试剂　

1．50×TAE储液（pH8.0）：

使用时稀释50倍1×TAE。

2．凝胶加样缓冲液：

0.2%溴酚蓝，50%蔗糖

3.琼脂糖（1.0%浓度）

4.10000×GoldviewDNA荧光染料（替代溴化乙锭EB）。

四、实验操作步骤

凝胶板的制备、加样、电泳、

结果观察　

C.凝胶电泳检测DNA的浓度1.0%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。

•DNA标准分子量片段（DL2000DNALadder）

　相关知识

❿电泳：

泳动速度决定于分子的相对分子质量大小

•琼脂糖凝胶

　天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。

琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。

而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。

琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

琼脂糖浓度　　0.3　0.6　0.7　0.9　1.2　1.5　2.0

线状DNA大小/kb5-60　1-20　0.8-10　0.5-7　0.4-6　0.2-4　0.1-3

核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

•不同构型DNA的移动速度次序为：

共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

影响迁移率的因素

•DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。

常用染料

•EB:

溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium　Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。

DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。

•EB染料优点：

染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。

•Goldview:

新型低毒，高灵敏度染料，加入凝胶中，价格较昂贵。

实验二、聚合酶链式反应PCR

聚合酶链式反应：

（PloymeraseChainReaction,PCR）诞生于1985年，它是根据生物体内DNA复制的某些特点而设计的在体外对特定DNA序列进行快速扩增的一项技术。

1.PCR技术的发明者：

美国Cetus公司的KaryMullis，因此获得1993年度诺贝尔化学奖。

2.操作过程的简化依赖于以下两项技术：

1）热稳定性TaqDNA聚合酶的应用；2）自动化热循环仪的设计成功。

（二）基本原理PCR的两个重要特征：

1）能合成DNA的特定序列；2）特定序列的大量扩增。

引物的位置将决定合成的DNA序列。

2．PCR包括3个热循环过程：

1）双链DNA的高温变性（解链）；2）引物与模板的低温退火（引物与模板结合）；

3）适宜温度下的引物延伸（互补链的合成）。

PCR的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，达到迅速大量扩增的目的。

计算表明：

用基因特异性引物扩增目的基因时，若假设开始模板分子数为x，经过n个循环后，目的分子个数为x（2n-2n）

（三）反应体系:

模板DNA；引物对；4种脱氧核苷三磷酸；DNA聚合酶；适宜的缓冲液。

1．模板DNA：

template单链DNA或双链DNA，cDNA

注意事项：

1）用DNA粗制品做样品，应避免混有任何蛋白酶，核酸酶，DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白质；2）要被扩增的DNA特定序列不需要事先从样品中分离纯化，因为PCR产物的序列，即反应的特异性，是由寡核苷酸引物序列所决定的。

3）PCR所需的DNA模板量较低

2．引物：

primer1）概念：

是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。

引物序列决定了PCR扩增片段的长度、位置和结果。

2）引物设计上的基本原则：

a:

一般为20—30bp；b:

G+C含量：

应在45%--55%之间；

c:

碱基分布的随机性；d:

引物自身：

不能含有自身互补序列；e:

引物之间：

两个引物之间不形成引物二聚体；f:

特异性：

与非特异扩增序列的同源性应小于10%，或少于连续8个互补碱基；

g:

引物的3’端：

3’端不应发生错配；另外，引物的3’末端不要终止于密码子的第3位，因为此处易发生简并，从而影响扩增特异性

3．4ХdNTPs：

靶DNA序列的扩增原料。

注意事项：

1）dNTPs贮存液PH值应为7.0；2）每种脱氧核苷三磷酸的浓度以50--200μmol/L为宜。

3）4种dNTPs的浓度应相同。

4．DNA聚合酶1）Klenow片段：

又叫Klenow聚合酶或Klenow大片段酶。

它能识别和消除错配的引物末端，以校正复制过程中错配的核苷酸缺点：

反应温度为37℃

2）TaqDNA聚合酶：

最初是从美国黄石国家公园的一个温泉中发现的一种嗜热菌——水生栖热菌（Thermusaquatics）YT菌株中分离而得。

此酶的最适作用温度为72℃。

四）循环参数1．变性温度和时间原则上变性步骤应高温，短时，既要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应的活性。

2．退火温度：

退火温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度。

通常反应条件为55℃。

3．引物延伸

1）引物延伸温度：

TaqDNA聚合酶通常为72℃。

2）延伸步骤的时间：

1Kbbp/min。

4．循环次数：

一般为25-40个周期。

PCR扩增仪

1．机械自动装置：

固定温度控制部分，依据每一个保温阶段对温度的要求，将样品在三个控温部分之间模拟手工操作进行机械移动

2．温度循环装置：

整个PCR过程中，样品在样品台上保持相同的物理状态，而用一软件控制的加热/冷却系统进行调控，实现周期性温度改变及恒温过程的自动化。

反应体系

标准加入量（μl）

实际操作加入量（μl）

10×buffer

2.0

4.0

4×dNTPs

1.6

3.2

模板

0.5

2.5

正向引物

0.8

4.0

反向引物

0.8

4.0

Taq聚合酶

0.1

2.0

ddH2O

14.2

0.3

2．PCR扩增反应按下列程序，在DNA扩增仪上进行反应。

94℃3min（变性）；94℃30s,60℃40s,72℃50s,35个循环，72℃10min（延伸）；4℃保存。

3．结果检测扩增样品在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

实验二PCR基因扩增技术

•原理：

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR），是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。

•在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

•1.变性：

在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。

•2.退火：

是模板与引物的复性。

引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。

•3.延伸：

从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。

PCR反应的温度循环周期

PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。

图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。

如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。

实验材料

•1、DNA模板

•2、4种dNTP

•3、引物1、引物2

•4、Taq酶

•5、琼脂糖

•6、DNA相对分子质量标准物

•7、吸头、50ulPCR管

试剂

•10×PCR缓冲液（含Mg2＋）

•4×dNTP（每种1mmol）

•Taq酶1U/ul

•DNA模板

•引物1:

5`-GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3`

•引物2:

5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3`

•引物溶液浓度10pmol/ul

实验步骤

1在0.5mlRCR管内配置20ul反应体系

PCR反应程序

（1）94℃变性5min，

（2）94℃变性1min，

（3）52℃退火1min，

（4）72℃延伸1min。

（5）重复

（2）-（4）30次

（6）72℃延伸1min。

•

实验五DNA片段的连接反应

（将PCR产物连接到T载体）

实验目的

v了解DNA片段连接的原理；

v掌握TA克隆的原理与连接方法。

实验原理

vDNA片段之间的连接：

在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3′羟基与5′磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来；

vPCR扩增用的DNA聚合酶（如Taq）会在扩增产物3’末端多聚合一个A，这个突出的A可以高效地和3’端突出T的质粒载体（T载体）连接而成重组分子，从而方便地实验PCR产物的克隆（TA克隆）。

实验仪器与材料

（一）仪器

微量取液器；

（二）材料

实验三回收得到的DNA片段（600bp）；

TA克隆试剂盒。

实验步骤

v连接反应体系（10μl）制备：

10XLigasebuffer1μl

pUCm-T载体0.5μl

插入片段DNA溶液2μl

灭菌的双蒸水6.0μl

T4连接酶0.5μl

v16℃反应过夜。

连接反应体系

vpMD19-TVector0.5

vPCR产物1.5

vSolutionI5.0

vH2O3.0

v--------------------------------------

v10微升

v16oC连接16h

实验结果及讨论

v反应温度升高（>26℃），较难形成环状DNA。

因此反应必须于16℃进行。

v当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。

当连接效率仍然无所改变时，应当对DNA进行精制后再反应。

v连接反应液可以直接用于转化。

另外，当转化DNA量较大或者利用电刺激转化时，先用乙醇沉淀法精制DNA。

实验六感受态制备

大肠杆菌感受态细胞的制备

6.1实验目的

1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

6.2实验原理

转化（Transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞中，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。

转化中的受体细胞

转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM符号表示。

转化方法：

电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法

感受态细胞处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。

转化细胞（转化子）：

带有异源DNA分子的受体细胞（Transformant）。

常见转化方法：

热激法、电穿孔法等；

热激法转化原理：

感受态细胞处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态，在冷热交替条件下，DNA分子进入到细胞并赋予新性状（如抗性）；

转化细胞（转化子）：

带有外源DNA分子的受体细胞（Transformant）。

影响转化率的因素

细胞生长状态和密度。

转化的质粒DNA的质量和浓度。

试剂的质量。

防止杂菌和其它外源DNA的污染。

6.3实验内容

本次实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用0.1MCaCl2处理对数生长期细菌细胞使其处于易于接受外源DNA的状态（感受态，competentcells）。

影响转化率的因素

细胞生长状态和密度。

转化的质粒DNA的质量和浓度。

试剂的质量。

防止杂菌和其它外源DNA的污染

6.4试验仪器

恒温振荡器

无菌工作台

6.5实验试剂

大肠杆菌DH5α

LB培养基，

0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）

氨苄青霉素

连接产物（重组质粒）

6.6实验步骤

菌株活化

感受态细胞制备

外源DNA的转化

菌株活化

1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时;

2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时;

3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4;

感受态细胞制备步骤（注意保持低温）

4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15-30min（满管）；

5.4000rpm离心5min，弃上清；

6.加入0.8ml预冷的0.1mol/LCaCl2，重新悬浮沉淀；

7.4000rpm离心2min，弃上清；

8.加入0.2ml预冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油），重新悬浮沉淀，得到感受态细胞；

上述感受态细胞可以立即用于转化；也可在-86℃超低温冰箱中长期保存备用。

转化

9、取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min

10、于42℃水浴90S

11、冰上放置2min

12、加入800μlLB液体培养基于37培养1小时

13、将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上

14、将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果

转化率

统计每个培养皿中的菌落数。

　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（mg）

　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

实验七、连接产物的转化及蓝白斑筛选

7.1实验目的

学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞的方法；

7.2试验仪器

无菌工作台

9cm玻璃平皿

细菌涂布器等

7.3细菌热激转化原理

转化原理：

感受态细菌与质粒冰浴后在较高温度下短时间水浴（热激），之后再冰浴，由于细菌细胞经受温度骤变，磷脂双分子层状态发生改变，对外源DNA的通透性增加，质粒可以高效地进入细菌细胞。

转化子筛选原理：

因质粒携带有筛选标记（如氨苄青霉素抗性基因，Ampr），因而使接受了该质粒的受体菌具有抗性。

如果将转化菌液涂布于抗生素的平板上培养，只有转化体才能存活。

重组子筛选原理：

所用载体克隆位点位于LacZ基因（编码β半乳糖苷酶，受IPTG诱导表达，能分解X-gal成蓝色）编码区内，外源基因插入后（重组子）造成该基因失活，因而菌落呈现白色。

实验步骤

1、取连接产物加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min；

2、42℃水浴90s（温度、计时需准确）；

3、冰上放置2min；

4、加入800μlLB液体培养基（不加抗生素）于37℃振荡培养45min；

5、4000rpm离心2分钟，取出800ul上清弃掉，将剩余菌液混匀，均匀涂布在相应的培养基平板上。

处理组（1个平板）：

将连接产物与1管感受态细胞（及IPTG10μL、X-Gal40μL）混匀后，转化并涂平板；

对照组（2个平板）:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,进行转化，最后分成两份，1份涂布于在含抗生素LB平板上，1份涂布于在不含抗生素LB平板上。

6、将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14h后观察结果

实验八、大肠杆菌质粒DNA的提取

1.目的与要求

通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。

质粒（Plasmid）：

独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。

是一种环状的双链DNA分子。

存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

细菌质粒:

细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。

质粒类型：

严谨型：

这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。

所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；

松驰型：

这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。

如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

载体（Vector）：

用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒（运载工具）。

具备的条件：

•易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。

载体的结构：

1.抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene）

2.启始复制子（ori,Originofreplication）；

3.多克隆位点（MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker）；

4.标记基因（Markergene,suchasLacZgene）。

5.　二、实验原理

碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。

碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。

几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。

由于操作原因提取的质粒可有三种结构：

线形、开环、闭环超螺旋。

DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。

释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。

然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。

离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。

通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

细菌裂解的方法：

碱裂解法：

0.2molNaOH+1%SDS

•煮沸裂解法:

沸水煮沸40秒

•SDS裂解法：

10%SDS,一般用于质粒大量提取。

提纯的思路

•质粒的特性：

共价、闭合、环状的小分子量DNA

•要去除的物质：

　蛋白

　基因组DNA

　脂类及小分子杂质

RNA

DNA浓度的测定：

测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。

另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。

紫外光吸收法：

因为组成核酸的碱基（G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。

但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。

因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。

这种方法常用于测定比较纯的样品。

3.材料与试剂

材料:

含有质粒大肠杆菌JM83+。

三、实验仪器、材料与试剂

（一）仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅

（二）材料：

含有质粒的大肠杆菌JM83+、LB液体培养基

（三）试剂：

▪溶液I

　　作用：

分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活

▪溶液II

　　作用：

细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。

▪溶液III

　　作用：

酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋　　　　　　　可中和DNA

溶液1－GET缓冲液：

50mmol/L葡萄糖，

10mmol/LEDTA，

25mMTris-HClpH8.0。

溶液2－0.2mol/LNaOH,1%SDS

溶液3－乙酸钾溶液（3M,pH=4.8）：

60mL的5mol/LKAc,

11.5ml冰醋酸，

28.5mLH2O

TE缓冲液或水（+20g/mlRNase）:

10mmol/L，Tris-HCl,

1mmol/L，EDTA，pH8.0,

100%乙醇，70％乙醇

▪平衡酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1）

　作用：

氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。

平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。

异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）

注：

用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。

无水乙醇：

除去DNA水化层，使DNA沉淀

TE缓冲液：

溶解DNA

四、实验步骤

接含质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中

370C，190rpm振荡培养过夜

取1.5菌液入1.5ml的dorf管中

6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体

100uL溶液I