菠萝蛋白酶的提取初步分离纯化及活性测定.docx
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菠萝蛋白酶的提取初步分离纯化及活性测定
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定
14食安
（1）班杨泽杰
摘要：
本文结合考马斯亮蓝G250染色法，研究了不同纯化方法，包括硫酸铵沉淀法、透析法，对菠萝蛋白酶活性的影响。
实验结果表明，两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶，但是会对菠萝蛋白酶的活性造成一定的损失。
关键词：
菠萝蛋白酶沉淀法透析法纯化酶活性
前言
菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33000，等电点9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。
菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。
金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，它能帮助迅速结痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
1实验材料与仪器
1.1实验材料与试剂
1.1.1实验材料
新鲜菠萝（3个），透析袋
1.1.2实验试剂
（1）盐析粗提液
0.1mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4000mL），0.01mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4000mL）
（2）酶活力测定试剂
1％酪蛋白（进口分装）（配100mL），激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/LEDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠）]，10％三氯乙酸（TCA）
1.2实验仪器和用品
1.2.1实验仪器
HJ-6多头磁力搅拌器：
常州国华电器有限公司
MC-H18S012多功能红外炉：
广东美的生活电器制造有限公司
DS-1高速组织捣碎机：
上海标本模型厂
GKC110R2可控硅恒温水浴锅：
赏花锦屏仪器仪表有限公司
TD5M低速离心机：
长沙湘智离心机仪器有限公司
TDL-60B台式离心机：
上海安亭科学仪器厂
722型可见分光光度计：
上海舜宇恒平科学仪器有限公司
UV5100B型紫外可见分光光度计：
上海元析仪器有限公司
PL1502-S电子天平：
梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司
BCD-539WT冰箱：
青岛海尔股份有限公司
1.2.2实验用品
（1）以组为单位的用品
大试管18mm×200mm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL×1，100mL×2，200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2mL×1）、漏斗（3个）、量筒（100mL×1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。
（2）全班共用的用品
试剂瓶（1000mL×7，250mL×3，60mL×20）、烧杯（1000mL×4）、塑料烧杯（2000mL×2）、量筒（500mL×2，1000mL×2）、广泛pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋（截留相对分子质量8000~14000）。
2实验方法
2.1菠萝蛋白酶的粗酶提取
称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/LpH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性[1]。
2.2盐析
根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C4000rpm离心10min，收集沉淀，加入0.1mo1/LpH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性[2]。
2.3透析
将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：
取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。
若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性[3]。
2.4酶活性测定方法
取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。
取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。
对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。
离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。
酶活单位定义：
在上述条件下，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。
实验步骤按照表格中完成。
试剂（ml）
对照组
平行样品1
平行样品2
平行样品3
TCA
3
—
—
—
酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
激活剂
0.9
0.9
0.9
0.9
酪蛋白
1
1
1
1
37°C准确反应10min
TCA
—
3
3
3
A280nmOD值
2.5蛋白质含量测定方法
2.5.1标准曲线的绘制
0~1000μg/mL标准曲线的绘制：
另取6支试管编号，按下表加入试剂。
管号
1
2
3
456
1000μg/mL牛血清白蛋白（mL）
蒸馏水（mL）
蛋白质浓度（μg/mL）
0
1.0
0
0.2
0.8
200
0.4
0.6
400
0.60.81.0
0.40.20
6008001000
得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000μg/mL标准曲线。
2.5.2样品的测定
准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤2.5.1操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。
3实验结果与分析
3.1蛋白质含量计算
由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（mg/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
样品蛋白含量（μg/g鲜重）=
3.2酶活力计算
最后酶活结果取3次重复实验的平均值。
酶液活力（U/mL）=
3.3酶比活的计算
酶比活（U/mg·蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量
3.4酶纯化过程中回收率计算
回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100
=〔（纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100
3.5酶纯化倍数的计算
纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力
3.6实验结果
3.6.1蛋白质含量
3.6.1.1绘制标准曲线
根据标准曲线测量数据
管号
1
2
3
456
1000μg/mL牛血清白蛋白（mL）
蒸馏水（mL）
蛋白质浓度（μg/mL）
吸光度/A
0
1.0
0
0
0.2
0.8
200
0.203
0.4
0.6
400
0.316
0.60.81.0
0.40.20
6008001000
0.4910.6310.633
绘制标准曲线如下：
3.6.1.2蛋白质含量
组别
粗酶
盐析
透析
吸光度/A
0.361
0.286
0.228
蛋白质浓度mg/mL
0.440
0.352
0.272
总体积/mL
36.00
17.00
17.00
蛋白质含量/mg
15.840
5.984
4.624
样品蛋白含量=
（鲜重）
3.6.2酶活力
组别
对照组
平行样品1
平行样品2
平行样品3
均值
A280mmOD值
粗酶
0
0.457
0.587
0.619
0.554
A280mmOD值
盐析
0
0.846
0.488
0.503
0.612
A280mmOD值
透析
0
0.461
0.459
0.473
0.464
透析酶液活力（U/mL）=
粗酶酶液活力（U/mL）=
盐析酶液活力（U/mL）=
3.6.3酶活比
透析酶活比（U/mg·蛋白）=
（U/mg·蛋白）
粗酶酶活比（U/mg·蛋白）=
（U/mg·蛋白）
盐析酶活比（U/mg·蛋白）=
（U/mg·蛋白）
3.6.4酶纯化回收率
盐析回收率（%）=（盐析纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100
=〔（盐析纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100
=（6120
）/（
）
=52.17%
透析回收率（%）=（透析纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100
=〔（透析纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100
=（4640
）/（
）
=39.55%
3.6.5酶纯化倍数
盐析纯化倍数=盐析纯化酶比活力/粗酶比活力
=20571.43
6994.95
=2.94
透析纯化倍数=透析纯化酶比活力/粗酶比活力
=20217.86
6994.95
=2.89
菠萝蛋白酶分离纯化表
步骤
总体积（mL）
总蛋白质含量（mg）
总活力（U）
比活力（U/mg·蛋白）
回收率（%）
纯化倍数
粗提取
36.00
15.840
199440
6994.95
--
--
盐析
17.00
5.984
78880
20571.43
52.17
2.94
透析
17.00
4.624
104040
20217.86
39.55
2.89
3.7实验结果与讨论
理论上，在蛋白质浓度中，粗酶的蛋白质浓度应该要比透析、盐析的蛋白质浓度低，但是结果是粗酶蛋白质的浓度最高，原因可能是后面盐析以及透析时操作不当导致菠萝蛋白酶损失严重，导致整体浓度降低和蛋白质含量减少。
盐析时，盐析出来的沉淀不能完全溶解也可能导致溶液中蛋白质含量降低。
盐析以及透析后的酶活力比粗酶的高。
Fe3+、Fe2+、Cu2+存在对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响较大,可能是与它们具有氧化还原性性有关[4]，在未盐析透析之前，菠萝蛋白酶受金属离子影响，导致粗酶的酶活力和酶比活较盐析和透析低。
盐析回收率不高，可能是因为加入的固体硫酸铵并没有完全溶解，或者提取液中，部分区域的硫酸铵浓度过高导致菠萝蛋白酶失活，从而导致回收率低[5]。
盐析纯化倍数比透析纯化倍数高，这是因为盐析后酶的浓度比透析的要高，所以盐析的酶比活比透析的高，盐析的单位酶活力比透析的高。
因此，盐析的纯化倍数会更高。
思考题：
1.如何防止酶在分离纯化过程中发生变性失活。
答：
酶变性失活主要因为金属离子、高温、有机溶剂等不可逆因素的影响
所以在纯化的时候要做到：
1.不使用自来水做透析液；2.不靠近红外电炉；3.不使用不洁净的仪器。
2.常见的酶活性表示方法有那些（如：
U/mL酶液；U/mg蛋白质;U/g干重或鲜重；U/g酶粉等）？
它们各有什么含义，适用哪些场合？
答：
U/mL酶液：
表示每单位体积样液中酶活力的情况，适用于表示液体酶中的酶活大小。
U/mg蛋白质：
表示每单位质量样品中酶活力的情况，适用于含一种或多种蛋白质的样品中的酶活大小。
U/g鲜重或干重：
表示每g原始样品中的酶活力的情况，适用于原始样品的酶活力表示。
U/g酶粉：
表示每g酶粉中的酶活力情况，适用于酶制剂的酶活力测定或者酶制剂的相应浓度配制。
3.蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？
哪些变性了？
哪些没有变性？
答：
变性：
重金属法，有机溶剂法，生物碱法[6]
未变性：
盐析法
4.实验中硫酸铵盐析为什么要选择0%~30%饱和度？
答：
根据易元龙[7]的文献，可以知道，在0-40%的饱和度范围之内，菠萝蛋白酶的酶活回收率随着饱和度的增大而增大，当饱和度大于40%时，菠萝蛋白酶的酶活回收率随着饱和度的增大而减少。
因此，选择了该饱和度进行实验。
参考文献
[1]李建武，萧能，余瑞元等，生物化学实验原理和方法，北京，北京大学出版社，1994
[2]余冰宾．生物化学实验指导．北京：
清华大学出版社，2003
[3]赵亚华，高向阳．生物化学与分子生物学实验技术教程．北京：
高等教育出版社，2005
[4]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族大学学报,2008,12，Vol.14，No.4
[5]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月
[6]田亚平，生化分离原理与技术，化学工业出版社，2010年
[7]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月
附
菠萝蛋白酶实验原始数据
粗液：
36.00mL
盐析液：
17.00mL
透析液：
17.00mL
硫酸铵：
7.04g
组别
粗酶
盐析
透析
吸光度/A
0.361
0.286
0.228
组别
对照组
平行样品1
平行样品2
平行样品3
均值
A280mmOD值
粗酶
0
0.457
0.587
0.619
0.554
A280mmOD值
盐析
0
0.846
0.488
0.503
0.612
A280mmOD值
透析
0
0.461
0.459
0.473
0.464
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