菠萝蛋白酶的提取初步分离纯化及活性测定.docx

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菠萝蛋白酶的提取初步分离纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定

14食安

（1）班杨泽杰

摘要：

本文结合考马斯亮蓝G250染色法，研究了不同纯化方法，包括硫酸铵沉淀法、透析法，对菠萝蛋白酶活性的影响。

实验结果表明，两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶，但是会对菠萝蛋白酶的活性造成一定的损失。

关键词：

菠萝蛋白酶沉淀法透析法纯化酶活性

前言

菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。

菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。

菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33000，等电点9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。

菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。

金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。

在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。

在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，它能帮助迅速结痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。

1实验材料与仪器

1.1实验材料与试剂

1.1.1实验材料

新鲜菠萝（3个），透析袋

1.1.2实验试剂

（1）盐析粗提液

0.1mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4000mL），0.01mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4000mL）

（2）酶活力测定试剂

1％酪蛋白（进口分装）（配100mL），激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/LEDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠）]，10％三氯乙酸（TCA）

1.2实验仪器和用品

1.2.1实验仪器

HJ-6多头磁力搅拌器：

常州国华电器有限公司

MC-H18S012多功能红外炉：

广东美的生活电器制造有限公司

DS-1高速组织捣碎机：

上海标本模型厂

GKC110R2可控硅恒温水浴锅：

赏花锦屏仪器仪表有限公司

TD5M低速离心机：

长沙湘智离心机仪器有限公司

TDL-60B台式离心机：

上海安亭科学仪器厂

722型可见分光光度计：

上海舜宇恒平科学仪器有限公司

UV5100B型紫外可见分光光度计：

上海元析仪器有限公司

PL1502-S电子天平：

梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司

BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司

BCD-539WT冰箱：

青岛海尔股份有限公司

1.2.2实验用品

（1）以组为单位的用品

大试管18mm×200mm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL×1，100mL×2，200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2mL×1）、漏斗（3个）、量筒（100mL×1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。

（2）全班共用的用品

试剂瓶（1000mL×7，250mL×3，60mL×20）、烧杯（1000mL×4）、塑料烧杯（2000mL×2）、量筒（500mL×2，1000mL×2）、广泛pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋（截留相对分子质量8000~14000）。

2实验方法

2.1菠萝蛋白酶的粗酶提取

称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/LpH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性[1]。

2.2盐析

根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C4000rpm离心10min，收集沉淀，加入0.1mo1/LpH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性[2]。

2.3透析

将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：

取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。

若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性[3]。

2.4酶活性测定方法

取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。

取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。

对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。

离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。

酶活单位定义：

在上述条件下，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。

实验步骤按照表格中完成。

试剂（ml）

对照组

平行样品1

平行样品2

平行样品3

TCA

—

酶液

0.1

激活剂

0.9

酪蛋白

37°C准确反应10min

TCA

—

A280nmOD值

2.5蛋白质含量测定方法

2.5.1标准曲线的绘制

0~1000μg/mL标准曲线的绘制：

另取6支试管编号，按下表加入试剂。

管号

456

1000μg/mL牛血清白蛋白（mL）

蒸馏水（mL）

蛋白质浓度（μg/mL）

1.0

0.2

0.8

200

0.4

0.6

400

0.60.81.0

0.40.20

6008001000

得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000μg/mL标准曲线。

2.5.2样品的测定

准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤2.5.1操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。

3实验结果与分析

3.1蛋白质含量计算

由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（mg/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。

样品蛋白含量（μg/g鲜重）=

3.2酶活力计算

最后酶活结果取3次重复实验的平均值。

酶液活力（U/mL）=

3.3酶比活的计算

酶比活（U/mg·蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量

3.4酶纯化过程中回收率计算

回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100

=〔（纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100

3.5酶纯化倍数的计算

纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力

3.6实验结果

3.6.1蛋白质含量

3.6.1.1绘制标准曲线

根据标准曲线测量数据

管号

456

1000μg/mL牛血清白蛋白（mL）

蒸馏水（mL）

蛋白质浓度（μg/mL）

吸光度/A

1.0

0.2

0.8

200

0.203

0.4

0.6

400

0.316

0.60.81.0

0.40.20

6008001000

0.4910.6310.633

绘制标准曲线如下：

3.6.1.2蛋白质含量

组别

粗酶

盐析

透析

吸光度/A

0.361

0.286

0.228

蛋白质浓度mg/mL

0.440

0.352

0.272

总体积/mL

36.00

17.00

蛋白质含量/mg

15.840

5.984

4.624

样品蛋白含量=

（鲜重）

3.6.2酶活力

组别

对照组

平行样品1

平行样品2

平行样品3

均值

A280mmOD值

粗酶

0.457

0.587

0.619

0.554

A280mmOD值

盐析

0.846

0.488

0.503

0.612

A280mmOD值

透析

0.461

0.459

0.473

0.464

透析酶液活力（U/mL）=

粗酶酶液活力（U/mL）=

盐析酶液活力（U/mL）=

3.6.3酶活比

透析酶活比（U/mg·蛋白）=

（U/mg·蛋白）

粗酶酶活比（U/mg·蛋白）=

（U/mg·蛋白）

盐析酶活比（U/mg·蛋白）=

（U/mg·蛋白）

3.6.4酶纯化回收率

盐析回收率（%）=（盐析纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100

=〔（盐析纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100

=（6120

）/（

）

=52.17%

透析回收率（%）=（透析纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100

=〔（透析纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100

=（4640

）/（

）

=39.55%

3.6.5酶纯化倍数

盐析纯化倍数=盐析纯化酶比活力/粗酶比活力

=20571.43

6994.95

=2.94

透析纯化倍数=透析纯化酶比活力/粗酶比活力

=20217.86

6994.95

=2.89

菠萝蛋白酶分离纯化表

步骤

总体积（mL）

总蛋白质含量（mg）

总活力（U）

比活力（U/mg·蛋白）

回收率（%）

纯化倍数

粗提取

36.00

15.840

199440

6994.95

盐析

17.00

5.984

78880

20571.43

52.17

2.94

透析

17.00

4.624

104040

20217.86

39.55

2.89

3.7实验结果与讨论

理论上，在蛋白质浓度中，粗酶的蛋白质浓度应该要比透析、盐析的蛋白质浓度低，但是结果是粗酶蛋白质的浓度最高，原因可能是后面盐析以及透析时操作不当导致菠萝蛋白酶损失严重，导致整体浓度降低和蛋白质含量减少。

盐析时，盐析出来的沉淀不能完全溶解也可能导致溶液中蛋白质含量降低。

盐析以及透析后的酶活力比粗酶的高。

Fe3+、Fe2+、Cu2+存在对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响较大,可能是与它们具有氧化还原性性有关[4]，在未盐析透析之前，菠萝蛋白酶受金属离子影响，导致粗酶的酶活力和酶比活较盐析和透析低。

盐析回收率不高，可能是因为加入的固体硫酸铵并没有完全溶解，或者提取液中，部分区域的硫酸铵浓度过高导致菠萝蛋白酶失活，从而导致回收率低[5]。

盐析纯化倍数比透析纯化倍数高，这是因为盐析后酶的浓度比透析的要高，所以盐析的酶比活比透析的高，盐析的单位酶活力比透析的高。

因此，盐析的纯化倍数会更高。

思考题：

1.如何防止酶在分离纯化过程中发生变性失活。

答：

酶变性失活主要因为金属离子、高温、有机溶剂等不可逆因素的影响

所以在纯化的时候要做到：

1.不使用自来水做透析液；2.不靠近红外电炉；3.不使用不洁净的仪器。

2.常见的酶活性表示方法有那些（如：

U/mL酶液；U/mg蛋白质;U/g干重或鲜重；U/g酶粉等）？

它们各有什么含义，适用哪些场合？

答：

U/mL酶液：

表示每单位体积样液中酶活力的情况，适用于表示液体酶中的酶活大小。

U/mg蛋白质：

表示每单位质量样品中酶活力的情况，适用于含一种或多种蛋白质的样品中的酶活大小。

U/g鲜重或干重：

表示每g原始样品中的酶活力的情况，适用于原始样品的酶活力表示。

U/g酶粉：

表示每g酶粉中的酶活力情况，适用于酶制剂的酶活力测定或者酶制剂的相应浓度配制。

3.蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？

哪些变性了？

哪些没有变性？

答：

变性：

重金属法，有机溶剂法，生物碱法[6]

未变性：

盐析法

4.实验中硫酸铵盐析为什么要选择0%~30%饱和度？

答：

根据易元龙[7]的文献，可以知道，在0-40%的饱和度范围之内，菠萝蛋白酶的酶活回收率随着饱和度的增大而增大，当饱和度大于40%时，菠萝蛋白酶的酶活回收率随着饱和度的增大而减少。

因此，选择了该饱和度进行实验。

参考文献

[1]李建武，萧能，余瑞元等，生物化学实验原理和方法，北京，北京大学出版社，1994

[2]余冰宾．生物化学实验指导．北京：

清华大学出版社，2003

[3]赵亚华，高向阳．生物化学与分子生物学实验技术教程．北京：

高等教育出版社，2005

[4]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族大学学报,2008,12，Vol.14，No.4

[5]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月

[6]田亚平，生化分离原理与技术，化学工业出版社，2010年

[7]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月

附

菠萝蛋白酶实验原始数据

粗液：

36.00mL

盐析液：

17.00mL

透析液：

17.00mL

硫酸铵：

7.04g

组别

粗酶

盐析

透析

吸光度/A

0.361

0.286

0.228

组别

对照组

平行样品1

平行样品2

平行样品3

均值

A280mmOD值

粗酶

0.457

0.587

0.619

0.554

A280mmOD值

盐析

0.846

0.488

0.503

0.612

A280mmOD值

透析

0.461

0.459

0.473

0.464

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