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荧光PCR

荧光定量PCR实验指南

一、基本步骤：

1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；

2、引物、探针的设计；

3、引物探针的合成；

4、反应体系的配制；

5、反应条件的设定；

6、反应体系和条件的优化；

7、荧光曲线和数据分析；

8、标准品的制备；

二、技术关键：

1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；

从网点的geank中下载所需要的序列.下载的方式有两种：

一为打开某个序列后,直接点击“save”,保存格式为“.txt”文件.保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号.然后,再打开DNAstar软件中的Editseq软件,点击“file”菜单中的“import”,打开后点击“save”,保存为“.seq”文件.另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件,点击“file”菜单中的“openentrezsequence”,导入后保存为“.seq”文件,保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号.然后要对所有的序列进行排序.用DNAstar软件中的Seqman软件,点击“sequence”菜单中的“add”,选择要比较的“.seq”的所有文件,点击“add”或“addall”,然后点击“Done”导入要比较的序列,再点击“aemble”进行比较.横线的上列为一致性序列,所有红色的碱基是不同的序列,一致的序列用黑色碱基表示.有时要设定比较序列的开始与结尾.有时因为参数设置的原因,可能分为几组（contig）,若想全部放在一组中进行比较,就调整“project”菜单下的“parameter”,在“aembling”内的“minimummathpercentage”默认设置为80,可调低即可.再选择几个组,点击“contig”菜单下的“reaemblecontig”即可.选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下,尽量提高“minimummathpercentage”的值.有时因此个别序列原因,会出现重复序列,碱基的缺失或插入,要对“contig”的序列的排列进行修改,确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列.然后,点击“save”保存即可.分析时,主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色,对于弥散性的红色是不可用的.

2、引物和探针设计

2.1引物设计

细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步.理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火.设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列.下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：

up2序列选取应在基因的保守区段；

up2扩增片段长度根据技术的不同有所分别：

sybrgreenI技术对片段长度没有特殊要求；

Taqman探针技术要求片段长度在50－150；

up2避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；

up2避免引物自身形成环状发卡结构；

up2典型的引物18到24个核苷长.引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性.但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性.较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量.Tm值在55－65℃,GC含量在40%－60%；

up2引物之间的TM相差避免超过2℃；

up2引物的3’端避免使用碱基A；

up2引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基.

up2为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子.

2.2Taqman探针设计一般设计原则：

up2探针位置尽可能地靠近上游引物；

up2探针长度通常在25－35,Tm值在65－70℃,通常比引物TM高5－10℃,GC含量在40%－70%.

up2探针的5’端应避免使用碱基G.

up2整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量.

up2为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针.（www.ncbi.nlm.nih/blast）

2.3TaqmaMGB探针设计介绍

MGB探针的优点：

up2MGB探针较短（14-20）,更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区.

up2短片段探针（14-20）加上MGB后,Tm值将提高10℃,更容易达到荧光探针Tm值的要求.

up2MGB探针的设计原则

up2探针的5’端避免出现G,即使探针水解为单个碱基,与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号.

up2用primerexpre软件评价Tm值,Tm值应为65-67℃.

up2尽量缩短TaqmanMGB探针,但探针长度不少于13.

up2尽量避免出现重复的碱基,尤其是G碱基,应避免出现4个或4个以上的G重复出现.

up2原则上MGB探针只要有一个碱基突变,MGB探针就会检测到（MGB探针将不会与目的片段杂交,不产生荧光信号）.因此,在进行检测时,为了检测到突变子,即TaqmanMGB不与目的片段杂交,不产生荧光信号,探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方.注意：

为了满足上述要求的4个条件,探针的突变位点可向3’端移动,但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方（即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守）,以进行检测.反过来,若要进行同类检测,找的是保守片段区,探针中不应有突变位点.若探针即便是只有13个,探针仍不完全保守.有几个突变,突变位点也应靠近探针的5’端,这样,即便是突变,探针也可与目的片段杂交,产生荧光信号.另一种方法是设计简并探针,也可达到即使是突变,仍可检测到突变.

2.4实时多重PCR探针的选择：

多重实时PCR的多种含意有两种：

一为选择保守的探针和引物,利用不同的染料标记探针,在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物.另一种为选择保守的引物,扩增不同长度的目的片段,反应中加入SYBRN染料,最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品.

多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：

如同时为Taqman探针、或同时为MGB探针、或同时为Beacon探针.

在多重PCR中,多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析:

设计好各对引物和探针后,重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件,打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件,然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后,在“report”菜单下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers.弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer,并对此对引物用dG值进行评价（通常给出最差的dG值,理论上是dG值越大越好）.

3、影响PCR及荧光PCR的其他因素

引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要.可以说,不合理的设计意味着绝对的失败.但是,好的设计并不等于好的实验结果,影响PCR和荧光PCR的因素非常多,下面择其重要进行介绍.

3.1引物退火温度

引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）.这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合.合理的退火温度从55℃到70℃.退火温度一般设定比引物的Tm低5℃.

设定Tm有几种公式.确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法.大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性.所有oligo软件会自动计算引物的Tm值.在设置退火温度时可以如下进行：

以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度,以2℃为增量,逐步提高退火温度.较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成.为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值.引物对的Tm差异如果超过5℃,就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始.如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃.或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环.这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝.

3.2引物浓度

引物的浓度会影响特异性.最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM.较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增.为了确定引物浓度,可以在260nm（OD260）测量光密度值.然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD）,通过Beers法则（公式1）计算引物浓度.微摩消光系数可以使用公式2计算.与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同,确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数.这是因为引物较短,碱基组成差异很大.在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）.

一般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少,在一般情况下,20个碱基长的引物,1个O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul（50μM）.也可以用OLIGO软件,根据引物的的消光系数（OD/μmol）,计算出一定的工作浓度下,引物的加水量.

浓度（μM）＝A260（OD/ml）×稀释系数×消光系数的倒数（nmol/OD）

举例：

计算某寡核苷酸（溶于1ml水中）,取其中的10μl稀释100倍（加入990μl）水中.在A260处测吸光度为0.2.计算消光系数的倒数为4.8nmol/OD,代入得：

浓度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM

3.3引物、探针的纯度和稳定性

定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的.部分应用需要纯化,以除去在合成过程中的任何非全长序列.这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％.这是个循环过程,在每个碱基加入时使用重复化学反应,使DNA从3'到5'合成.在任何一个循环都可能失败.较长的引物,尤其是大于50个碱基,截断序列的比例很大,可能需要纯化.

引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响.定制引物以干粉形式运输.最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM.也可以用双蒸水溶解.

引物的稳定性依赖于储存条件.应将干粉和溶解的引物储存在-20℃.以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周.干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月.

探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记,标记本身有效率的区别.探针标记以后一般应该纯化,纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以高达一年以上.不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别.

由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2uM（10×）,作为工作浓度分装多支,避光保存.

3.4热启动

热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一.尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性.因此,在进行PCR反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物.这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增.在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时,如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作,热启动PCR尤为有效.

限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热的PCR仪.这种方法简单便宜,但并不能完全抑制酶的活性,因此并不能完全消除非特异性产物的扩增.

热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR仪达到变性温度.包括延缓加入TaqDNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐,尤其是对高通量应用.其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,如镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开.在热循环时,因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起.象手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用.

Traitor?

HotStartTaq酶对于自动热启动PCR来说高效可靠.Traitor?

HotStartTaq是在常规Taq酶的基础上进行了化学修饰,使得该酶在低温或常温下没有酶活,因此在加样至PCR扩增前,不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增.高温条件下,化学修饰集团会被剪切,从而释放酶活.此外,随着PCR扩增的进行,酶活会被逐步释放,有效提高扩增效率及产物量.Traitor?

HotStartTaqDNA聚合酶在变性步骤的95℃保温过程中要持续20分钟才会被释放到反应中,从而完全恢复聚合酶活性.

3.5镁离子浓度

镁离子影响PCR的多个方面,如DNA聚合酶的活性,这会影响产量；再如引物退火,这会影响特异性.dNTP和模板同镁离子结合,降低了酶活性所需要的游离镁离子的量.最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同,但是包含200μMdNTP的实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液（普通PCR是1.5mM）.较高的游离镁离子浓度可以增加产量,但也会增加非特异性扩增,降低忠实性.为了确定最佳浓度,普通PCR从1mM到3mM,以0.5mM递增,进行镁离子滴定.为减少对镁离子优化的依赖,可以使用Traitor?

HotStartTaq酶.Traitor?

HotStartTaqDNA聚合酶能够在比一般的TaqDNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能,因此仅需较少的优化.

3.6模板质量

模板的质量会影响产量.DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR.一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂,如SDS,在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应.分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol,一种胍去垢剂裂解液,以及FTAGeneGuardSystem,其可以同基质结合,在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA.应注意进行PCR反应的模板质量,以增加PCR反应的成功率.

3.7模板浓度

起始模板的量对于获得高产量很重要.对大多数PCR扩增和荧光PCR扩增,104到106个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）.所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）.举例说,100ng到1μg的人类基因组DNA,相当于3×104到3×105个分子,足以检测到单拷贝基因的PCR产物.质粒DNA比较小,因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的.对于一般的检测样品,10－100ng的量就足够检测了.当然对模板做一个梯度稀释,对于定量PCR而言是非常容易,且能分析扩增效率.

表1.基因组大小和分子数目的比例

基因组DNA

Size（）*

TargetMolecules/μgofGenomicDNA

AmountofDNA（μg）for-10^5Molecules

E.coli

4.7×10^6

1.8×10^8

0.001

Saccharomycescerevisiae

2.0×10^7

4.5×10^7

0.01

Arabidoisthaliana

7.0×10^7

1.3×10^7

0.01

Drosophilamelanogaster

1.6×10^8

6.6×10^5

0.5

Homosapie

2.8×10^9

3.2×10^5

1.0

Xenopuslaevis

2.9×10^9

3.1×10^5

1.0

1.0Musmusculus

3.3×10^9

2.7×10^5

1.0

Zeamays

1.5×10^10

6.0×10^4

2.0

pUC18plasmidDNA

2.69×10^3

3.4×10^11

1×10^（-6）

3.8防止残余（Carry-over）污染

PCR易受污染的影响,因为它是一种敏感的扩增技术.小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增.当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时,会发生共同来源的污染.这称之为残余污染.从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源（非残余污染）.

可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染.使用带滤芯的移液管可以阻止气雾剂进入eendorf管内.为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域,在准备新反应前更换手套.总是使用不含有模板的阴性对照检测污染.

使用预先混合的反应成分,而不是每个反应的每个试剂单独加入.

一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）.这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶.在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来.因为前面的扩增产物对UDG敏感,所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物.

4、高产量,特异和灵活的定量PCR试剂体系

影响PCR的因素如此之多,您有时很难区分是什么导致您的实验结果不佳.降低实验的不稳定因素是使用优质可靠的产品.

使用优质、性能可靠的热启动酶、优质的dNTP、Mg离子、UNG/dUTP防污染系统预混成的定量PCR试剂体系,最大程度的降低了反应变量,提高了实验的可重复性和可靠性.您还需要进行以下步骤的准备：

设计引物和探针、合成引物和探针、正确储藏、得到高质量的模板,随后,您仅需要进行退火温度的优化,就能得到好的实验结果.

FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）同竞争对手的定量PCR体系相比提供了更优异的结果.使用这种产品,您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度,同时可以灵活地选择您所喜欢的扩增条件,检测方法和设备.

实时定量PCR是快速增长的PCR方法,它可以精确、可重复地定量起始物质.FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）是一种方便使用的反应混合液,为定量分析进行了优化.它包含了荧光PCR所必须的成分（如缓冲液,dNTP,聚合酶）.只需加入您的模板,扩增引物和荧光标记探针.您就可以得到实时qPCR所需的特异性和灵活性.

高产量和特异性的扩增

FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）提供了强大的PCR扩增,可以使用多个模板组.所使用的TaqDNA聚合酶具有热启动特性.这极大地降低和消除了错误配对和非特异性扩增,使您得到较高产量,并增加特异性.整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止残余污染的能力防止了非模板DNA的扩增,从而降低了假阳性,使结果更可靠.

在产量和灵敏度方面,QuantitativePCRMASTERMix-UDG（hotstart）的灵敏度极高（阈循环）.您可以更精确地定量低拷贝的基因,并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反应.

高度灵活性

除了灵敏度和特异性外,UniversalPCRMasterMixKit在分析设置,检测方法和设备上给您提供了较高的自由度.使用UniversalPCRMasterMixKit,您可以：

对扩增的不同模板优化镁离子浓度,由于提供了附加的氯化镁,所以您可以方便地配置Mix体系.

可以更灵活的进行普通PCR和荧光PCR.

可以在多种设备上使用,如ABIPrism?

7700,ABIGeneAmreg;5700和Bio-Rad的I-Cycler.

可以利用多种检测方法的优点,包括TaqMareg;探针和MolecularBeacon,您不必局限于特定的试剂盒.

5、反应体系配制：

eA2010A0101试剂盒：

（探针体系）

FQ-PCRMasterMix-UNG混合物（2X）25ul（终浓度为1×）；

上游引物（终浓度为50~900nM）,下游引物（终浓度为50~900nM）；

探针（终浓度为200nM）；

待检样品5ul（终浓度为10~100ng）；

无菌去离子水补足,使总体积达到50ul.

eA2010A0106试剂盒:

反应体系终浓度：

1-2U的hotstartTaq酶、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2－0.4mM的dNT、1×PCRbuffer（A2010A0106）；50－900nM的上游引物、50－900nM的下游引物、200nM的探针、通常取2-5ul的模板,反应总体积通常为20－50ul

e自配热启动荧光－UNG体系：

1-2U的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0104）；0.2-1U的UNG酶（A2010A0107）、0.2－0.4mM的d（A,C,G）T、0.3-0.6mMdUTP（A2010A0108）；50－900nM的上游引物、50－900nM的下游引物、200nM的探针、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为20－50ul

6、反应体系和条件的优化；

使用高产量,特异和灵活的定量PCR试剂体系FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）,最大程度降低了需要优化的参数.您只需要优化退火温度,就可以得到更灵敏、更可靠的定量结果.对于特殊结构的荧光PCR,您可以优化引物浓度,来得到更特异或更灵敏的结果.

使用通用PCRMasterMix试剂盒进行反应体系的配制,可以适合更多的反应体系,如mRNA的普通RT-PCR检测,适用于合成质粒的PCR,同时也适用于荧光PCR,范围更宽.

采用成套的hotstartTaq酶,您需要对酶量、镁离子浓度、UNG浓度、dUTP浓度、引物浓度、退火温度等参数进行优化（参照3：

影响PCR及荧光PCR的其他因素）进行优化,优化的指标越多,实验的不确定性就越大.避免在操作中引入更大的不确定性和不可重复性.注意：

同样可参照的QPCRMASTERMix-UDG（hotstart）使用注意事项.

7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析；

目前市场上有许多种实时PCR仪：

其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000（AliedBiosystems）；MX4000（Stratagene）；iCycler（Bio-Rad）；Smartcycler（Cepheid）；Robocycler（MJResearch）；Lightcycler（Roche）；ROTORGENE（CORBERT）；杭州博日（Linegene）.

不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman探针和sybgreen染料法的检测波长和检测能力.QPCRMASTERMix-UDG（hotstart）和通用PCRMasterMix均适合在这些仪器上进行使用.

为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔.

基线或阀值的设定通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线.

三、疑难解答

1.定量PCR无扩增产量或很少的扩增产量

DNA模板质量不好,含有抑制剂.应提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制TaqDNA聚合酶.如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA

2.PCR引物设计较差

避免在引物3'端含有互补序列.避免可以形成内部发卡结构的序列.设计Tm类似的引物.

3.探针设计较差

对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针

4.PCR引物合成较差

用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现.

5.荧光探针无功能

确保探针设计的有效性和fluorophore和que