血清蛋白质的分离纯化与鉴定doc.docx

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血清蛋白质的分离纯化与鉴定

刘欢1张唯2赵澜2彭垠婷2徐波2郭小李2

（1．生化专业细胞生物学51041300069导师：

张红锋;2．华东师范大学生命科学学院）

摘要：

通过系统的生化制备与分析实验，让学生基本掌握了包括脱盐、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS-PAGE、HPLC和冷冻干燥在内的生化技术。

从而为以后的科研工作打好基础。

关键词：

层析；电泳；SDS-PAGE

Abstract:

Bydoingbiochemichalpreparingandanalyzingexperiment,technologiessuchasproteinconcentrationdetecting,enzymeactivitytesting,chromatography,acetategreenelectrophoresis,HPLC,SDS-PAGEandotherbiotechnologicaltechniquesaremastered.Studentsaremadequalifiedtotheirresearchwork.

Keywords:

chromatography;electrophoresis;SDS-PAGE

一、前言

生命物质的制备和分析是现代生物化学中必不可少且又非常实用的技术。

本实验通过对兔血清蛋白的分离，让我们基本掌握常用的技术，初步了解了纯化技术的整体步骤和整个生化技术的整体流程，为我们以后自己分离纯化蛋白质产物建立了一个基本的概念，以及为以后的研究工作打下基础。

这些技术都是常用而成熟的技术，但是一个多世纪以来，尽管生物技术有了飞速发展，它们仍一直在发挥着重要的，不可替代的作用。

这些技术包括：

（一）．蛋白质检测技术——电泳技术

Hardy[1，2，3]发现，许多生物胶体，如蛋白质、酶等有特征的电泳迁移率（electrophoreticmobilities）。

此迁移率在很大程度上取决于溶液的pH。

因此利用电泳特征作为对物质的鉴定引起人们广泛的兴趣。

20世纪的20年代和30年代，电泳理论和实践有了很大的发展。

Tiselius教授首先证明了血清是由白蛋白，α、β和γ球蛋白组成的[4]。

人血清蛋白用界面移动方法分离的最佳条件是0.1mol/L（pH8.6）的巴比妥缓冲液，此时白蛋白具有最快的迁移速度，接着依次为α1、α2、β和γ球蛋白[5~8]。

生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。

在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。

迁移的方式目前可分为三类：

根据分子尺寸大小、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特征。

电泳迁移率（mobility）m规定为在电位梯度E的影响下，颗粒在时间t中的迁移距离d。

聚丙烯酰胺凝胶（plyacrylamidegel,PAG）是由丙烯酰胺（acrylamide）和交联试剂N,N＇-甲叉双丙烯酰胺（N,N＇-methylenebisacrylamide）在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的。

聚丙烯酰胺的单体形成长链，由N,N＇-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。

其化学结构已经清楚[9]。

聚丙烯酰胺的特性，包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度以及孔径大小均取决于两个重要的参数T和C。

T是两个单体的总百分浓度。

C是与总浓度有关的交联百分浓度。

Hjerten教授[10]在1962年引入以下两个公式来进行计算。

T=（a+b）/m·100（%）

C=b/（a+b）·100（%）

A为丙烯酰胺的克数（g），b为N,N＇-甲叉双丙烯酰胺的克数（g），m为水或缓冲液的终体积（ml）。

其中a和b的比例是很重要的[11]。

PAGE电泳根据原理，需要在以下方面做选择：

1）pH的选择考虑原则有：

合适的分离胶缓冲系统、先导离子、尾随离子、浓缩胶缓冲系统、反向离子及电泳缓冲液[12,13]。

2）离子强度的选择。

一般来说，离子强度在0.01~0.1mol/L[14],最常用的为0.05mol/L[15]。

3）凝胶浓度的选择。

浓度太大则孔径较小，样品留在加样位置；太小则不能很好分离。

所以必须通过实验来选择最佳的浓度。

4）分子量的测定。

1964年Feerguson[16]首先在淀粉凝胶中证明了蛋白质分子的迁移率m的对数或相对迁移率Rf的对数对凝胶浓度T%作图，可以得到一条直线。

这个现象接着在1968年由Hedrick和Smith[17]在聚丙烯酰胺凝胶中证实。

SDS-PAGE技术首先在1967年由Shapiro[18]等建立，1969年由Weber和Osborn[19]进一步完善。

他们发现在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的轻键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。

强还原剂，如巯基乙醇（β-mercaptoethanal）和二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，消除了分子间原有的电荷差异。

（二）．蛋白质的分离提取

蛋白质是一种极具多相性的生物大分子，离开其天然环境，蛋白质分子极不稳定，在细胞中和抽提液中的蛋白质的性状也不尽相同。

蛋白质有多种类型，通过不同的方法我们可区分为可溶性蛋白、膜结合蛋白、具有催化功能的蛋白或结构蛋白及转录调节蛋白。

从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。

如果不能满足这一条件，蛋白将很快的失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。

因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。

在不同实验中遇到的困难也各不相同，有些式样中的困难是如何维持酶的活性。

在不同实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。

然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。

1）.缓冲液。

缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中的pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要[20,21]。

a.应对pKa相近的一些缓冲液进行实验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用[22]。

b.当选定一种缓冲溶液后，一般使用其最低的浓度以避免非特异性的离子强度的影响。

通常以50mmol/L的缓冲液浓度作为实验的起始浓度。

c.当缓冲液pKa值的变化超过一个1pH单位时其有效的缓冲能力明显降低。

而许多酶在极限pH值时往往发生不可逆的变性[23]。

d.大多数动物细胞在37℃的生理状况下的pH值为7.0~7.5，而在温度下降至接近0℃时可达8.0[24]。

e.要根据所选用的分离方法选用缓冲溶液：

凝胶过滤方法大多数缓冲液均可适用。

阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选Tris缓冲液。

阳离子交换和羟基磷灰石层析，阴离子缓冲液首选磷酸盐缓冲液[22]。

f.混合缓冲液在一定的离子强度下往往具有更宽的缓冲范围[25]。

g.在低温时缓冲液和冰点溶剂的情况可参考文献[26]。

h.所采用的化学试剂应该达到试剂级或更高纯度。

2）盐、金属离子和螯合剂

必须保证保持酶活性所需的离子。

同时用螯合剂来螯合对酶保存不利的金属离子。

3）还原剂

可以添加一定还原剂来保证酶的还原环境。

4）去垢剂

用适当浓度的去垢剂来抽提、沉淀蛋白。

也必须选择合适的浓度。

5）其他条件

包括表面效应、温度、储存条件等。

同时可以用蛋白酶抑制剂来去除蛋白酶对目的蛋白的降解。

常用的抑制剂有：

PMSF、EDTA、pepstatin、leupeptin、aprotinin等。

为了纯化细胞蛋白质，采用有效的方法进行细胞破碎和固液分离是必要的。

它是全过程的第一步，通常是将处于细胞不同位置的待纯化蛋白释放出来，溶入已知成分的溶液内。

该步骤是目的蛋白初级分离纯化阶段的重要环节，它直接影响产物的回收率，也可能影响产物的纯度。

目前建立很多破碎细胞，释放细胞内容物的方法。

根据作用方式不同，基本可以分为两大类：

机械法和非机械法。

此类方法和原理可以参看文献[27]和1990年出版的酶学方法（英文）182卷。

（三）蛋白质分离纯化技术

蛋白质分离纯化除了简单的离心、沉淀等方法以外，目前常用和最为有效的方法是层析技术，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析以及由此技术延伸的HPLC等技术。

1.离子交换层析在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛。

它对蛋白质的分辨率高，操作简单，重复性好，成本低。

此方法适合于蛋白质粗提物的初始纯化。

a）蛋白质的等电点是进行离子交换层析的重要依据。

b）离子交换剂与蛋白质的结合。

离子交换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷结合。

c）蛋白质纯化的一般程序。

蛋白质溶液进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱。

d）常用蛋白质洗脱策略。

常用方法是加大反荷离子的浓度。

e）不同反荷离子对洗脱的影响。

f）其他蛋白质洗脱策略。

离子交换时改变液相中缓冲体系的pH值是一种降低蛋白质与树脂亲和力的办法。

g）缓冲液。

离子交换用的缓冲液必须慎重选择，若缓冲能力不够强，导致液相pH值的波动，会影响蛋白质与树脂的结合。

利用离子交换层析纯化蛋白质在一开始时应该作好两个决定：

选择最佳的离子交换树脂和缓冲体系；如何洗脱蛋白质。

2.凝胶过滤层析又称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析[28,29]。

这种方法利用分级分离，明显降低了因不可逆结合所造成的蛋白质损失和失活。

此外，可利用此方法更换蛋白质的缓冲液活降低缓冲液的离子强度。

纯化一个分子量较大的蛋白质。

纯化的第一步可以使用凝胶过滤层析。

溶质分子在移动相和固定相之间的分配系数Kd来表示凝胶过滤层析的特性：

Kd=（Ve-Vo）/Vi。

凝胶过滤层析还可以运用于：

分子量测定，去除低分子量的杂质，从二聚体和其他寡聚体中分离目的蛋白，更换蛋白质的缓冲液，研究蛋白质与配基的结合[30,31]等。

3.亲和层析是一类纯化方法，它包含各种各样的形式，但其共同特征是均以蛋白质和结合在介质上的配基间的特异亲和力为工作基础。

配基可以是生物学特异的，例如一个肽、一个抗体、一个底物、一个抑制剂、一个辅酶或核酸等；配基也可以是具有相对特异相互作用的凝集素、染料或疏水分子等。

很多情况下，蛋白质和某些生物大分子的生物学功能在于它们能够特异地和可逆地与相应配基相互作用。

所以说，亲和层析选择性强、纯化效率高，常常可以一步获得满意的纯化效果。

因为它应用的是生物特异性而不是依赖于物理化学性质，故常用于分离低浓度的蛋白质。

（四）蛋白质的分析方法。

我们得到了很纯的蛋白后就要对其进行一些性质的测定。

本实验我们主要测定了蛋白的浓度、酶活和米氏常数等性质。

1）考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合[32]，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线形关系，故可以用于蛋白质的测定。

样品蛋白质含量应该在10-100μg为宜。

一些阳离子和乙醇对测定无影响，而大量的去污剂会严重干扰实验[33,34]。

2）在一定发pH和温度下，待测液中的碱性磷酸酶作用于基质中的磷酸苯二钠，使之水解放出酚。

酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用并经铁氰化钾氰化，生成红色醌类化合物，根据红色深浅可以测定酶活力高低，从而计算出酶的活力单位。

每克组织蛋白在37℃与基质作用15mi