《生化分离工程》整理.docx

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《生化分离工程》整理

第一章绪论

1、何为生化分离技术？

其主要研究那些内容？

生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。

第二章预处理、过滤和细胞破碎

6、影响过滤的因素及改善措施？

影响过滤性能的因素主要有:

①混合物中悬浮微粒的性质和大小;②混合液的粘度;③操作条件：

固液分离操作中温度、pH、操作压力、滤饼厚度等;④助滤剂的使用;⑤固液分离设备和技术

改善过滤性能的方法:

工艺上一般采用降低混合液粘度的方法、增大被分离颗粒的粒度或者在混合液中加入助滤剂的方法、提高离心机的转速或提高操作压力、增大真空度、降低滤饼层的厚度，或除去滤饼等方法以改善过滤性能。

1、机械法细胞破碎与非机械破碎相比有何特点？

2、细胞破碎主要有那几种方法？

10、何谓化学法破碎细胞？

其原理是什么？

包括那几种？

细胞破碎技术:

（一）机械法①珠磨法:

在磨腔中装入小玻璃球或小钢球，由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎，释放出内含物。

一般有立式或卧式两种珠磨机;②高速匀浆法:

利用高压使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。

设备是高速匀浆器，由高压泵和均压阀组成;③超声破碎法:

另一种液相剪切破碎法，常为实验室方法.当通过超声探头向悬浮液输入声能，大量声能转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度，使细胞破碎。

（二）非机械方法①酶法溶胞:

利用酶分解细胞壁上特殊的化学键使之破裂。

②化学法:

用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分，改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。

包括酸碱条件改变pH、有机溶剂法、表面活性剂法等。

③物理法如渗透压冲击法、冻融法、干燥法等。

11、何为包涵体？

包涵体中分离产物一般包括哪几个步骤？

所谓包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的，无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。

从包涵体中分离产物的处理步骤为：

收集菌体细胞→细胞破碎→离心分离→包涵体的洗涤→目标蛋白的变性溶解→目标蛋白的复性。

第三章萃取单元

萃取是利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。

液液萃取是以液体为萃取剂，含有目标产物的原料也为液体。

液固萃取或浸取是以液体为萃取剂，含有目标产物的原料也为固体。

反萃取:

调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作。

萃取方法分物理萃取（溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。

例如，用乙酸丁酯萃取青霉素）;化学萃取（用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。

萃取剂与溶质之间的化学反应，包括离子交换和络合反应等）.

1、何谓溶剂萃取？

溶剂萃取是利用物质在互不相溶的水相与有机相间的分配系数不同而达到分离的过程，也称溶媒萃取。

特点是浓缩倍数和纯化倍数较高，可连续、多级操作，溶剂耗量大，对设备、安全要求高；应用在生物小分子物质如抗生素、有机酸、氨基酸等。

操作的一般过程:

萃取–洗涤–反萃取

2‘分配定律及其适用条件是什么？

分配定律:

在温恒压条件下,溶质A在互不相溶的两相中达到分配平衡时,如果两相中以相同的分子形态存在,则在两相中的平衡浓度之比为常数,称为分配常数,这就是溶质的分配定律.K=y/x,y是A在萃取相E中的浓度mol/L,x是A在萃余相中的浓度mol/L

适应条件：

一定温度和压力下，相同分子形态（相对分子质量相同）存在于两相中的溶质浓度之比。

不合适弱电解质的萃取；也不适合于化学萃取，因溶质在各相中并非以同一种分子形态存在

2、在溶剂萃取过程中pH值是如何影响酸碱弱电解质的提取和离子交换（化学）萃取？

弱电解质分配定律公式推导得出:

有机相和水相表面的K表与温度压力有关，还与萃取达到平衡时水相的pH密切相关

1酸性电解质:

K表＝[AH]/[AH]+[A-]=K/1+10（pH-pKp）

②碱性电解质:

K表＝[AH]/[AH]+[A-]=K/1+10（pKp-pH）

化学萃取目的:

由于氨基酸aa和一些极性较大的抗生素的水溶性很强，在有机相中的分配系数很小甚至为零，利用一般的物理萃取效率很低，甚至无法萃取。

化学萃取有阴离子交换萃取和阳离子交换萃取

水相条件的选择:

pH值影响分配系数K和分离因子β以及稳定性

3、何谓乳化现象？

生物料液萃取时形成乳化形成的原因？

乳化:

水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。

发酵产物的萃取操作中产生乳化后使有机相和水相分层困难，出现两种夹带：

①发酵液中夹带有机溶剂微滴，使目标产物受到损失；②有机溶剂中夹带发酵液给后处理操作带来困难。

产生原因:

发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活剂性的作用，使有机溶剂和水的表面张力降低，水易于以微小液滴的形式分散于油相称为油包水型W/O乳浊液；相反，为O/W型乳浊液。

在发酵液溶剂萃取中,有蛋白质引起的乳状液是水包油型（O/W）的,此界面乳状液可放数月不凝聚

4、何为反胶团和反胶团萃取？

反胶团：

是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。

是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。

反胶团萃取:

是利用表面活性剂在有机相中形成分散的亲水微环境,使蛋白质类生物活性物质溶解于其中的一种生物分离技术.其本质仍是液液有机溶剂萃取。

反胶团萃取蛋白质的基本原理:

反胶团萃取是有机相-水相间的分配萃取,是从主体水相向溶解于有机溶剂相中反胶团微水相中的分配萃取,时也是一个浓缩操作,改变水相条件可实现反萃取。

蛋白质融入反胶团的推动力主要包括表面活性剂与蛋白质分子的静电作用力（影响因素是pH值和离子强度）和位阻效应（与含水率W有关）

影响反胶团萃取的主要因素:

水相pH值;离子强度;表面活性剂类型及其浓度

2、反胶团萃取的特点是什么？

其中尤其突出的优点（见划线）是什么？

反胶团萃取技术的突出优点：

①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；②分离、浓缩可同时进行，过程简便；③能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题；④表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；⑤成本低，溶剂可反复使用等。

7、何谓双水相萃取？

目前常用的体系有那两种？

双水相系统是指某些亲水性高分子聚合物之间或亲水性聚合物与无机盐之间,在水中超过一定浓度后形成不相容的两相，并且两相中水分均占很大比例.典型的例子是聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）形成的双水相系统。

双水相萃取是利用物质在互不相溶的两个水相之间分配系数的差异实现分离的方法。

目前常用的体系:

聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）体系和聚合物与无机盐的混合溶液形成的双水相体系如PEG/磷酸钾、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等。

8、为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分离？

在双水相系统中,两相的水分都在85%-95%,且成相的高聚物与无机盐都是生物相容的生物活性物质或细胞在这种环境下,不仅不会丧失活性,而且还会提高它们的稳定性。

9、影响双水相萃取的因素有那些？

①聚合物及成相盐的种类及浓度②聚合物的平均分子量③体系的pH值及其他盐的种类及浓度④菌体或细胞的种类及含量、体系温度等。

10、何谓超临界流体萃取？

其特点有哪些？

超临界流体萃取：

使用介于气体和液体之间的流体作为萃取剂，从固体或液体中进行萃取，以达到分离和提纯的目的。

超临界流体特点：

流体在超临界状态下,其密度接近液体,具有液体溶剂相当的萃取能力,因此萃取能力强;其粘度接近气体,传质阻力小,传质速率大于其处于液态下的溶剂萃取速率,因此传质性能好

11、二氧化碳作为重要的超临界介质的原因？

CO2在工业上应用广泛。

它无毒，无腐蚀性，不可燃烧，纯度高且价格低。

又有优良的传质性能，扩散系数大，粘度低，而且和其他用做超临界流体的溶剂相比，CO2具有相对较低的临界压力和临界温度，适合于处理某些热敏性生物制品和天然物产品。

第四章膜分离

1、何谓膜分离？

常用和新型膜分离方法那几种？

用天然或人工合成的无机或有机薄膜,以外界能量或化学位差为推动力,对双组分或多组分溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法通称为膜分离法.

膜分离实质：

物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依赖于膜孔径大小和分离物质。

常用膜分离技术：

微滤、超滤、反渗透、电渗析、纳滤

新型膜分离技术：

亲和膜过滤、渗透蒸发、膜蒸馏、膜萃取、液膜分离

2、简述各种膜分离技术的原理及其应用!

（纲领性语言即可）（见笔记）

各种膜分离按动力本质分类:

①以静压力差为推动力的过程:

微滤（MF）、反渗透（RO）、超滤（UF）、纳滤（NF）

②以蒸汽分压为推动力的过程:

膜蒸馏（MD）、渗透蒸发（PV）

③以浓度差为推动力的过程:

渗析（D）

④以电位差为推动力的过程:

电渗析（ED）

5、何谓截留率和膜截留分子量？

截留率：

是指对一定相对分子质量的物质，膜能截留的程度。

δ=1－CP/CB,

CP是指某一瞬间透过液浓度（kmol/m3）；CB是指截留液浓度（kmol/m3）。

截留分子量（MWCO）:

相当于一定截留率（通常为90％或95％）的相对分子质量。

第六章蛋白质沉淀

1、蛋白质沉淀的主要方法

①盐析法②有机溶剂沉淀法③|pH水–pI|Value调节法④亲水聚合物沉淀法

⑤聚电解质絮凝法⑥高价金属离子沉淀法⑦亲和沉淀法

2、盐析法沉淀的作用机理

盐析是指在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解度降低而产生沉淀的过程。

盐析沉淀机理:

减弱静电斥力;去水化膜.亲水胶体在水中稳定的因素有两个,即电荷和水膜,蛋白质分子表面极性基团越厚,蛋白质分子与溶剂分子的亲和力越大,溶解也越大,而中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,所以加入大量的中性盐后,夺走了水分子,破坏了水膜,暴露了疏水区域,同时又中和了电荷,破坏了亲和胶体,蛋白质分子即形成沉淀。

4、盐析法中常用无机盐是什么?

为何选用它们?

无机盐的挑选原则：

a较高的盐析效能;b高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；c溶解度受温度的影响小;d盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离;

e不易引起蛋白质的变性;f格低廉.

最常用（NH4）2SO4.优点:

符合上述要求；缺点:

水解后溶液pH降低，在高pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。

次常用Na2SO4.缺点：

在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。

盐析法影响因素:

①无机盐的种类（不同种类的盐主要影响Ks;离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好）；②无机盐的添加方式（分批操作和连续操作）；

③溶液pH（pH影响Cohnx方程中的值）；④温度（T亦影响值,T,T）

Cohnx经验公式:

;

式中,S为蛋白质的溶解度（g/L）;I为离子强度;m为盐的摩尔浓度；

β值指盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。

与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关;Ks为盐析常数,与蛋白质和无机盐的种类有关,与温度、pH值无关.

第七章吸附

第九章电泳技术

电泳是指荷电的胶体粒子在电场中的移动.电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。

1、带电粒子在电场中的迁移方式主要依据哪些因素？

带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。

第十章离心技术

1、常用离心技术：

一般包括差速离心法和密度梯度离心，密度梯度离心又分速率区带离心和等密度离心。

（一）差速离心法：

采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法；

常用于从组织匀浆中分离细胞和病毒

（二）速率—区带离心：

不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。

可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分

（三）等密度梯度离心：

当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。

常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。

第十一章结晶

1、结晶：

溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列；结晶的实质是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程

2、结晶的步骤：

①过饱和溶液的形成；②晶核的形成；③晶体生长

其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。

2、冷冻干燥的原理与特点（p175）

使被干燥的液体在极低的温度下，冷冻成固体；然后在低温低压下利用水的升华性能，使冰升华汽化而除去，以达到干燥的目的。

2.1简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。

①胞捣碎法，原理：

机械运动产生剪切力适用于动植物组织

②高速匀浆法，破碎程度较上法好，且机械剪切力对生物大分子的破坏较小，处理量大。

原理：

利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然的减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。

适用于：

较柔软、易分散的组织细胞。

③研磨法和珠磨法适用于微生物与植物细胞④挤压瓶适用于细菌（G-）

⑤超声破碎⑦物理法（反复冻融动物材料、渗透压冲击细胞壁脆弱的微生物、急冷骤热（细菌病毒等热不敏感的物质））⑧干燥法（热空气干燥法适用于酵母，真空干燥法适用于细菌，冷冻干燥法适用于不稳定的酶）⑨化学法，1、溶剂处理法丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂可溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。

2、表面活性剂法添加如十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠等，通过破坏细胞膜而破碎细胞，释放目的物。

此法常需与其它方法结合应用⑩酶解法，1．自溶法，将欲破碎细胞在一定条件（pH、T）下保温一定时间，通过细胞本身存在的酶系的作用，将细胞破坏，使胞内物质释放。

2．外加酶法利用各种水解酶专一性地将细胞壁分解，使内含物释放出来。

细菌：

加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA）酵母：

采用β-葡聚糖酶霉菌：

添加几丁质酶植物材料：

加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。

发展方向：

㈠多种破碎方法相结合㈡与上游过程相结合㈢与下游过程相结合（如:

利用金黄色葡萄球菌,发酵生产A蛋白。

通常A蛋白结合于菌体胞壁上,需要进行细胞破碎,然后将A蛋白从胞壁上剪切下来,过程繁琐,难度大。

若用生物技术培养出A蛋白分泌型菌来生产,A蛋白的分离纯化就容易得多.）

2.2、简述盐析分级范围的选择依据？

某纯酶和粗酶的盐析分级范围是否相同？

为什么？

可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得P8，回收率和纯度考虑。

纯酶的分级范围比粗酶宽一些，因为纯酶的纯度比较高一些，在采用盐析时更注重回收率，可以适当加宽分级范围，而粗酶由于杂志较多则注重纯化倍数。

2.5怎样选择细胞破碎的方法？

总原则：

最大提取、不易变性、减少干扰

具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。

1．材料细胞的特性  动物细胞易破碎，只需用温和方法植物细胞较难破碎，须用中等或强度大的方法，微生物细胞较复杂，一般用较强方法2.目的物的特性⑴细胞中的位置游离状：

只需温和破碎，除去不溶部分。

结合状：

可能结合在膜或细胞器内,需先收集膜或细胞器，再破碎⑵敏感性温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响⑶处理量有些处理量大，如组织捣碎机、匀浆器等。

有些处理量少，如超声波破碎等。

3.2、简述微滤膜的主要种类，特点和主要分离机理。

种类据材质分成：

1）有机微滤膜，具韧性，适应性强，制备简单，易成形，工艺较成熟。

常用聚乙烯、聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯等聚烯烃类聚合物组成。

2）无机微滤膜，无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、耐高温、孔径分布窄、可高压反冲洗、再生能力强、分离效率高、不易老化等优点。

3）复合微滤膜，复合微滤膜充分利用了有机与无机微滤膜的各自优点。

复合微滤膜的制备包括三种形式1）将一层微滤膜的薄膜和常规过滤介质利用层压技术复合在一起；2）通过不同的工艺手段实现有机与无机的黏合改性；3）将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器（IMBR）分离机理

（1）筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。

（2）吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。

（3）架桥，固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。

（4）网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。

（5）静电，分离悬浮液带电颗粒时，可采用带相反电荷的微滤膜。

能用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通量。

10.3、请比较NativePAGE与SDS-PAGE在原理和应用上的主要差别。

一、常规的PAGE电泳，原理：

根据分离物质的电荷密度，电荷种类，分子大小，分子的形状不同在电场中迁移的速率不同而得到分离。

应用其特点是天然高分子化合物的分离，而保持其活性。

缓冲液系统：

⑴pH决定生物分子溶解性、稳定性、电泳时间、分辨率

酸性蛋白质——阳极电泳（pH8.0～9.5）

碱性蛋白质——阴极电泳（pH4.0左右）

三种不连续系统：

高pH系统（9.5、8.9）

“中性”pH系统（8.0）低pH系统（5.5、4.8、3.6）

⑵离子强度一般控制在0.01-0.1mol/L

凝胶浓度的选择样品分子量未知，一般可先选7.5%的均匀胶，理想的Rf范围在0.25～0.85之间；也可根据凝胶浓度与分子量的关系来选择：

测定蛋白质分子量：

天然PAGE测定蛋白质的分子量需排除电荷的影响，因此需测量蛋白质分子在不同浓度凝胶中的相对迁移率从而得到蛋白质的分子量。

具体方法：

先用不同浓度的凝胶同时测量未知和已知分子量的蛋白质的相对迁移率；对不同蛋白质分子，以其相对迁移率的对数对凝胶浓度作图，直线的斜率为阻滞系数；用已知分子量的蛋白质的阻滞系数对它们的分子量作图，得到一条直线，在此直线上根据未知蛋白质的阻滞系数可查得它的分子量。

二、SDS-聚丙烯酰胺Gel电泳十二烷基硫酸钠CH3（CH2）11OSO3Na

原理：

样品中加入：

1.含-S-S-的还原剂，打开Pr分子二硫键

2.SDS破坏Pr分子的氢键和疏水键，并与之形成Pr-SDS复合物

结果导致：

⑴.复合物带大量负电，不同Pr电荷密度相同⑵.球状Pr变成雪茄状，长轴∝MW（3）泳迁移率仅与MW（长轴）有关。

注意：

1.SDS的加量：

一般10gSDS/gPr2.Gel浓度3.多亚基的Pr……

SDS凝胶分离高分子化合物后失活，需要进行生物活性的修复从蛋白中去除SDS，许多蛋白可恢复活性或局部恢复活性，其影响因素为：

①SDS纯度；②蛋白酶；③二硫键；④其它：

去除速度、辅因子、DTT等（胶中进行，局限于单肽链或亚基相同）

SDS凝胶分为，连续电泳，和不连续电泳均匀胶，不连续电泳梯度胶。

10.5、常用测定蛋白质分子量的方法有哪些？

（手写板第③页）

①sds-page用于测定蛋白质分子量。

特点：

所测得的是变性蛋白的分子量或接力亚基的分子量。

②天然PAGE:

用于蛋白质分子量的测定，特点：

测得的是天然蛋白质的分子量，但需要较多步骤。

③凝胶过滤色谱：

有效分配系数Kav或Ve与溶质相对分子量的对数之间存在线性关系。

特点：

分离天然非变性的蛋白质分子分子量，且不受带点和量的影响。

④超速离心在离心力场中，沉降系数，扩散系数，与分子量有一定的对应关系。

通过测定某种颗粒的沉降系数后可以计算出他的分子量。

特点：

无需做标准曲线但需要测定溶质的扩散系数。

名词解释：

超滤：

（126）

纳滤：

（131）

盐溶（）

等电点沉淀法：

（25）

喷雾干燥（176）