生化实验方法.docx
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生化实验方法
实验一准备实验
（一）
分光光度计的使用
一.目的
通过电化教学方式学习分光光度计的工作原理
掌握比色测定的基本操作方法
二.原理
光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。
肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：
小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。
当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。
分光光度法依据Lambert-Beer定律：
=KCL
令A=
，T=
，则A=KCL，A=-lgT
其中：
T：
透光率A：
吸光度（有时用光密度OD表示）
I：
透射光强度I0：
入射光强度
K：
吸收系数L：
溶液的光径长度
C：
溶液的浓度
从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。
三.实验材料及设备
1.仪器
分光光度计放相机电视机
2.器材
普通试管：
20mL×3
移液管：
5mL×2
烧杯：
250mL×1
洗耳球：
2
洗瓶、试管架、移液管架：
各1
四.试剂的配制
重铬酸钾（K2Cr2O7）溶液（0.2mg/mL）
称取0.2gK2Cr2O7，蒸馏水溶解后定容至1000mL。
五.操作步骤
1.在电教室中看录像
了解721型分光光度计的工作原理。
2.在分光光度室中练习操作
详细步骤见附录六。
3.在实验室中应用练习
取3支试管，按下表所示顺序操作。
管号
操作
空白
样品
0
Ⅰ
Ⅱ
重铬酸钾溶液（mL）
5.0
5.0
蒸馏水（mL）
5.0
比色
以0号管为空白参比，测定λ=450nm处的吸光度
记录吸光度（A450）
六.结果处理
1.求两个样品管A450的平均值
450；
2.计算重铬酸钾的摩尔消光系数。
七.思考题
1.到分光光度室中进行比色测定应携带哪些器材？
它们分别起什么作用？
2.比色时，设一个“0”号管的意义是什么？
实验二
3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量
一.目的
了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理
掌握总糖定量测定的操作方法
二.原理
还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。
它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。
遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。
黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。
对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。
再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。
由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-
=0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。
三.实验材料及设备
1.材料
面粉
2.仪器
分光光度计电子天平沸水浴
3.器材
刻度试管：
25mL×8
容量瓶：
100mL×2
锥形瓶：
100mL×1
移液管：
1mL×22mL×210mL×2
烧杯：
250mL×150mL×1
滴管：
2
洗耳球：
2
滤纸：
φ11cm
坐标纸
漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：
各1
四.试剂的配制
1.葡萄糖标准液（1mg/mL）
预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
2.3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）
将5.0g3,5-二硝基水杨酸溶于200mL2NNaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。
再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。
暗处保存备用。
3.碘液
称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。
4.酚酞指示剂
称取0.1g酚酞，溶于250mL70%（V/V）的乙醇中。
5.HCl溶液（6N）
取500mL12NHCl，用水稀释至1000mL。
6.NaOH溶液（6N）
取240gNaOH，加水溶解，定容至1000mL。
五.操作步骤
1.样品中总糖的提取
（1）取材：
称取0.7g面粉，准确记录实际质量（W），放入100mL锥形瓶中。
（2）溶解：
先用几滴蒸馏水调成糊状；加入15mL蒸馏水；再加入10mL6NHCl，搅匀。
（3）水解：
置于沸水浴中水解30分钟。
用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加1滴碘液，检查淀粉水解程度。
如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。
如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。
（4）中和：
加1滴酚酞指示剂，加入10mL6NNaOH中和至微红色。
（5）定容：
将溶液转移至100mL容量瓶（B1）中，定容。
（6）过滤：
用滤纸过滤。
（注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。
）
（7）稀释：
精确吸取滤液10mL，移入另一个100mL容量瓶（B2）中，定容。
（B2）液作为总糖待测液备用。
2.标准曲线制作及样品测定
取8支25mL刻度试管，按下表所示顺序操作。
管号
操作
空白
标准葡萄糖浓度梯度
样品
0
1
2
3
4
5
Ⅰ
Ⅱ
葡萄糖标准液（mL）
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
样品待测液（mL）
1.0
1.0
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
1.0
1.0
DNS试剂（mL）
各2.0
反应
各管混匀，沸水浴5分钟
定容
冷却；分别用蒸馏水定容至25mL
比色
以0号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光度
记录吸光度（A540）
六.结果处理
1.由0～5号管的数据，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；
2.求两个样品管A540的平均值
540；
3.由
540从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量（mg）；
4.计算你所取的生物材料中总糖的百分含量。
七.思考题
1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？
而在其测定前，又为何要用NaOH中和？
2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？
实验三
Folin-酚比色法测定蛋白质含量
一.目的
学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法
二.原理
Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：
试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。
在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。
该方法灵敏度高，测定范围为25μg～250μg，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。
注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。
三.实验材料及设备
1.材料
绿豆芽
2.仪器
分光光度计电子天平
3.器材
普通试管：
20mL×8
容量瓶：
100mL×1
移液管：
1mL×45mL×1
烧杯：
250mL×150mL×1
滤纸：
φ11cm
滴管：
2
洗耳球：
2
坐标纸
研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：
各1
四.试剂的配制
1.牛血清白蛋白标准液（250μg/mL）
精确称取0.0250g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2.Folin-酚试剂甲
●
溶液A：
Na2CO310g
NaOH2g用蒸馏水溶解后定容至500mL；
酒石酸钾钠0.25g
●溶液B：
CuSO4·5H2O0.05g用蒸馏水溶解后定容至10mL；
●使用前，将溶液A和溶液B以50:
1相混合。
该混合液只能保持一天。
3.Folin-酚试剂乙
●在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25g钼酸钠（NaMoO4·2H2O）及700mL蒸馏水，再加入50mL85%正磷酸和100mL浓盐酸，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。
●回流结束后，趁热加入150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴，再继续开口沸腾15分钟，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。
（若仍呈绿色，须重复滴加液体溴，再沸腾15分钟，直至呈黄色。
）
●用蒸馏水定容到1000mL；过滤；用棕色试剂瓶保存。
●使用前稀释1倍，使其最终浓度相当于1N酸。
五.操作步骤
1.样品液的制备
（1）取材：
称取新鲜绿豆芽下胚轴2g左右，准确记录其质量。
（2）研磨：
将取得的材料置于研钵中，研磨成匀浆。
（3）过滤：
将匀浆转移至垫有滤纸的漏斗中过滤，收集滤液；
用约10mL蒸馏水分三次洗涤研钵，洗涤液也过滤并收集其滤液。
（4）定容：
将滤液用蒸馏水定容到100mL，作为样品待测液。
2.标准曲线制作及样品测定
取8支试管，按下表所示顺序操作。
管号
操作
空白
标准蛋白浓度梯度
样品
0
1
2
3
4
5
Ⅰ
Ⅱ
牛血清白蛋白标准液（mL）
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
样品待测液（mL）
1.0
1.0
蒸馏水（mL）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Folin-酚试剂甲
各5.0mL
反应
各管混匀，室温下放置10分钟
Folin-酚试剂乙
各0.5mL
反应
及时混匀，室温下放置30分钟
比色
以0号管为空白参比，测定λ=500nm处的吸光度
记录吸光度（A500）
六.结果处理
1.由0～5号管的数据，以蛋白质含量（μg）为横坐标，A500为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；
2.求两个样品管A500的平均值
500；
3.由
500从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量（μg）；
4.计算你所取生物材料中蛋白质的百分含量。
七.思考题
1.某蛋白质样品中酪氨酸含量高于牛血清白蛋白中的酪氨酸含量，应用本方法测得的值与实际值相比，是偏高还是偏低？
为什么？
2.加入Folin-酚试剂乙后，为什么须迅速混匀？
3.标准蛋白质浓度梯度和样品蛋白质含量的测定为什么要同步进行？
实验四
RNA的提取与核酸的颜色反应
一.目的
学习用浓盐法从酵母中提取RNA
掌握用等电点法沉淀RNA
观察核酸的颜色反应，了解核酸定性与定量测定的原理
熟练掌握普通离心机的使用方法
二.原理
酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液与菌体分离比较容易。
因此，酵母是提取RNA的好材料。
将RNA从细胞中释放出来在工业上主要有三种方法—稀碱法、浓盐法和自溶法。
本实验采用浓盐法，即利用高浓度的盐（10%NaCl）在90～100C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使RNA释放到盐溶液中。
同时，90～100C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。
注意，在30～70C时这两种酯酶的作用活跃，提取时应避免在此温度范围内停留时间过长。
由于核膜内的DNA分子量较大，穿越膜孔较困难，一般不易释放到菌体外面，所以采用离心技术，可使RNA溶液与菌体残渣以及DNA分离。
根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调pH至2.0～2.5，RNA以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。
再次离心，固液分离，便可获得RNA粗产品。
最后用乙醇洗涤沉淀，溶解和去除脂溶性杂质和色素以及盐分杂质。
由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗涤还可以使RNA沉淀物脱水，变得疏松，便于干燥，提高了RNA产品的纯度。
DNA和RNA的鉴别，较常用的方法是利用两类核酸中不同的戊糖各自具备的不同的颜色反应，而得以定性鉴别。
其中鉴定DNA的方法称为二苯胺法，鉴定RNA的方法称为地衣酚（苔黑酚，3,5-二羟甲苯）法。
具体反应式如下：
上述颜色反应不但可用于两类核酸的定性鉴别，也是定糖法定量测定核酸的依据。
关于离心机的使用原理和方法，详见附录。
三.实验材料及设备
1.材料
干酵母
2.仪器
离心机电子天平沸水浴烘箱抽滤装置冰浴
3.器材
普通试管：
20mL×4（干燥）
锥形瓶：
100mL×1
量筒：
50mL×1
移液管：
1mL×2
烧杯：
250mL×1100mL×150mL×1
离心管：
100mL×1
温度计：
50℃×1
表面皿：
φ9cm
滴管：
2
洗耳球：
2
加样器
pH试纸：
pH0.5～5.0
滤纸：
φ7cm
洗瓶、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：
各1
四.试剂的配制
1.NaCl溶液（C.P.）（10%）
2.HCl溶液（6N）
取500mL浓盐酸，用水稀释至1000mL。
3.乙醇（C.P.）（95%）
4.苔黑酚试剂（又称地衣酚试剂）
将200mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O。
（低温贮藏一周）
5.二苯胺试剂
将1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL浓硫酸（比重1.84）。
（临用时配制，用前可加几滴乙醛。
）
五.操作步骤
1.取材
在天平上准确称取干酵母3.00g，转移至100mL锥形瓶中。
2.浓盐浸提
取27mL10%NaCl溶液，加入到含干酵母的锥形瓶中，搅拌均匀；置于90～100C水浴中，浸提30～60分钟；冷却。
3.离心
将锥形瓶中提取液和沉淀全部转移至100mL离心管中，取10mLH2O洗涤锥形瓶，并入离心管中；平衡后以4000转/分钟离心15分钟；将上清液（即RNA提取液）倾入50mL烧杯中，弃去沉淀（菌体残渣）。
4.沉淀RNA
（1）冷却：
将50mL烧杯置于放有冰块的250mL烧杯中冷却；将温度计插入50mL烧杯中，待溶液冷至10C以下时，取出温度计。
（2）调pI：
缓慢滴加6NHCl于50mL烧杯中，用玻棒一边轻轻搅拌溶液，一边测量pH值，调节溶液pH至2.0～2.5范围，溶液中白色沉淀逐渐增多，到等电点时沉淀量最多；继续在冰浴中静止15分钟，使沉淀充分。
（注意：
①严格控制pH；②若搅拌过快核酸难以凝聚沉淀。
）
5.离心
将小烧杯中溶液和沉淀移至离心管中，再次平衡、离心（4000转/分钟，15分钟）；弃去上清液，保留RNA沉淀。
6.洗涤与抽滤
（1）洗涤：
取10mL95%乙醇加到含RNA沉淀的离心管中，悬浮沉淀，浸泡５分钟。
（2）抽滤：
取大小合适的滤纸，先在数字显示天平上称重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。
7.干燥
用小镊子取出布氏漏斗中的沉淀物和滤纸，转移至表面皿上，置于80C烘箱内干燥。
8.称重
取出样品，在室温下冷却数分钟后，将沉淀物及滤纸置于数字显示天平上称重。
9.颜色反应
（1）溶解：
取50mL水溶解RNA沉淀，同时加2滴NaOH助溶。
（2）颜色反应：
取４支洁净、干燥的试管，按下表所示顺序操作。
管号
操作
1
2
3
4
RNA稀释液（mL）
0.5
0.5
蒸馏水（mL）
1
0.5
1
0.5
苔黑酚试剂（mL）
2
2
二苯胺试剂（mL）
2
2
反应
在通风橱内，沸水浴10分钟
颜色
六.结果处理
1.写出核酸产品的颜色和外形。
2.计算RNA的粗产品的得率。
3.由颜色反应的结果，说明产品中含有核酸的情况。
七.思考题
1.在实验中用了哪些试剂？
它们各起什么作用？
2.实验中两次离心，每次离心后应保留上清液，还是沉淀？
为什么？
实验五
影响唾液淀粉酶活性的一些因素
一.目的
了解温度对酶活性的影响
了解pH对酶活性的影响
了解激活剂和抑制剂对酶活性的影响
二.原理
酶的催化活性受温度的影响很大。
酶反应在低温时进行较慢，随着温度升高而加快，当达到其最适温度时，酶反应速度最快，以后又随着温度升高而减慢，以至完全停止反应。
人的唾液淀粉酶活性随着温度的升高而升高，直到37℃左右，温度更高时酶的活性则下降。
通常，测定酶的活力时，在酶反应的最适温度下进行。
应当指出，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，一般作用时间长，最适温度低，而作用时间短，则最适温度高。
动物酶的最适温度一般为35～40℃，而植物酶的最适温度较高，在40～50℃之间。
酶的活性受环境pH的影响极为显著。
通常，各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。
一种酶表现其活性最高时的pH值，称为该酶的最适pH。
低于或高于最适pH时，酶的活性逐渐降低。
人的唾液淀粉酶在pH3.8～9.4之间表现其活性，最适pH约为6.8。
不同酶的最适pH值不同。
然而，酶的最适pH受底物性质和缓冲液性质的影响。
例如，唾液淀粉酶在醋酸缓冲液中的最适pH不是6.8，而为5.6。
酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。
Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。
其它的阴离子，如Br-、NO3-和I-对该酶也有激活作用，但较微弱。
而Cu2+对唾液淀粉酶具有抑制作用。
激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且常具有特异性。
在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。
唾液内的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。
它们遇碘呈不同的颜色。
直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色：
淀粉紫色糊精红色糊精麦芽糖及少量葡萄糖
与I2呈蓝色与I2呈紫色与I2呈红色与I2不显色
由于在不同温度，不同pH，或者在有激活剂或抑制剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。
但需注意在碱性条件下碘会发生歧化反应，部分碘形成无色的碘酸盐、次碘酸盐，此时应增加碘液加入量。
三.实验材料及设备
1.材料
唾液
2.仪器
恒温水浴沸水浴冰浴
3.器材
普通试管：
20mL×8
容量瓶：
100mL×1
移液管：
1mL×42mL×35mL×1
烧杯：
250mL×150mL×1
温度计：
1
滴管：
2
洗耳球：
2
漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：
各1
四.试剂的配制
1.淀粉溶液（0.5%）
称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。
（临用前配制）
2.NaCl溶液（0.3%）
3.CuSO4溶液（0.3%）
4.碘液
称取2g碘和3g碘化钾溶于100mL水中。
临用前稀释10倍。
5.磷酸缓冲溶液系列（0.2mol/L）：
①pH4.8、②pH6.8、③pH9.8
五.操作步骤
1.唾液淀粉酶的制备
（1）提取：
实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。
（2）稀释：
将酶提取液用水定容至100mL。
作为唾液淀粉酶的样品液。
（由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50～300倍，甚至超过此范围。
）
2.温度对唾液淀粉酶活性的影响
取8支试管，编号，按表一操作，并记录观察到的颜色。
表一
管号
操作
A
a
B
b
C
c
D
d
pH6.8缓冲液（mL）
1
1
1
1
NaCl溶液（mL）
1
1
1
1
淀粉溶液（mL）
5
5
5
5
淀粉酶液（mL）
1
1
1
1
预保温（10分钟）
冰浴
室温（℃）
37℃
沸水浴
混合
A倒入a中
B倒入b中
C倒入c中
D倒入d中
酶促反应（10分钟）
冰浴
室温
37℃
沸水浴
碘液
各1滴（d管应先冷却至室温）
颜色
3.pH对唾液淀粉酶活性的影响
取3支试管，编号，按表二操作，并记录观察到的颜色。
表二
管号
操作
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
缓冲液（mL）
2（pH4.8）
2（pH6.8）
2（pH9.8）
NaCl溶液（mL）
各1
淀粉溶液（mL）
各5
淀粉酶液（mL）
各1
酶促反应
摇匀，37℃水浴10分钟
碘液
1滴
1滴
3滴
颜色
4.激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响
取3支试管，编号，按表三操作，并记录观察到的颜色。
表三
管号
操作
①
②
③
pH6.8缓冲液（mL）
各2
NaCl溶液（mL）
1
CuSO4溶液（mL）
1
H2O
1
淀粉溶液（mL）
各5
淀粉酶液（mL）
各1
酶促反应
摇匀，37℃水浴10分钟
碘液
各1滴
颜色
六.结果处理
1.分析表一的结果，并作出温度对唾液淀粉酶活性影响的示意图。
2.分析表二的结果，并作出pH对唾液淀粉酶活性影响的示意图。
3.分析表三的实验结果。
七.思考题
1.什么是酶的最适温度？
有何实践意义？
2.什么是酶的最适pH？
它是否是一个常数？
它与哪些因素有关？
这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么意义？
3.酶反应的抑制作用有哪些类型？
各根据什么划分的？
它们各有什么特点？
实验六
淀粉酶的活力测定及专一性实验
一.目的
了解淀粉酶对不同底物的专一性
掌握测定淀粉酶活力的原理和
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