胡萝卜愈伤组织的诱导培养实验报告管理资料.docx
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胡萝卜愈伤组织的诱导培养实验报告管理资料
本科学生综合性实验报告
学号114120***姓名@￥&
学院生命科学学院专业、班级11应用生物教育%班
实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2013至2014学年下学期
填报时间2014年5月20日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
实验序号
一
实验名称
胡萝卜愈伤组织的诱导培养
实验时间
——
实验室
睿智楼3幢325
实验内容：
1-1MS培养基母液和常用试剂的配制
1-2胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制
1-3胡萝卜愈伤组织的诱导
1-4胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制
1-5胡萝卜愈伤组织的继代培养
1．实验目的：
1）、通过本次实验，使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识；
2）、通过本次实验，使学生进一步熟悉配制培养基的流程及操作中应注意的事项，学会设计和筛选胡萝卜愈伤组织诱导培养基配方；
3）、通过本次实验，使同学能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术；
4）、通过本次实验，使学生进一步熟悉配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基；掌握愈伤组织状态的调控手段，设计适合的使愈伤组织增殖快、结构疏松的增殖培养基，以便能培养出下次细胞培养的材料；
5）、通过本次实验，使同学熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
2．实验原理、实验流程或装置示意图
实验原理
1）、培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质[1]。
配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。
母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。
2）、将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
3）、将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织[2]。
4）、将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
5）、将由胡萝卜肉质直根诱导产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖。
实验流程
1）、MS培养基母液和常用试剂的配制；
2）、配置胡萝卜愈伤组织诱导培养基；
3）、接种胡萝卜肉质根诱导愈伤组织产生；
4）、配置胡萝卜愈伤组织增殖培养基；
5）、接种胡萝卜愈伤组织进行增殖；
6）、实验结果观察记录。
3．实验设备及材料
1）实验用具和仪器
冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、三角瓶、果酱瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（~）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋/棉线、电炉、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉等。
酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管，超净工作台、恒温培养箱、电炉/电磁炉、高压蒸汽灭菌锅电热恒温干燥箱等。
2）药品和试剂：
MS培养基母液（大量元素、微量元素、铁盐、有机物）、常用试剂母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质（2,4-D、6-BA、KT）、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、95%酒精、75％酒精、%HgCl2，、愈伤组织继代培养基、蒸馏水等。
3）材料：
胡萝卜肉质直根、处于脱分化进程中的胡萝卜愈伤组织
4．实验方法步骤及注意事项
实验步骤：
（1）、MS培养基母液和常用试剂的配制流程
MS培养基母液的配制
1）大量元素母液的配制：
MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2•2H20、MgSO4•7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应[3]，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。
配制的步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存，注意：
CaCl2•2H2O最后加入。
各种化合物用量如下表：
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
浓缩
倍数
称取量/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取取量/ml
大量元素
KNO3
1900
20
38000
1000
50
NH4NO3
1650
33000
CaCl2•2H20
440
8800
MgSO4•7H2O
370
7400
KH2PO4
170
3400
2）微量元素母液的配制
MS培养基中的微量元素可由MnSO4•4H2O、ZnSO4•7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4•2H2O、CuSO4•5H2O、CoCl2•6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中[4]（具体配制见下表）。
配制步骤同大量元素（混合时不要求先后顺序）。
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
浓缩倍数
称取
量/mg
母液定容体积/ml
配1L培养基吸取量/ml
微量元素
MnSO4•H2O
200
3380
1000
5
ZnSO4•7H2O
1720
H3BO3
1240
KI
166
Na2MoO4•2H2O
50
CuSO4•5H2O
5
CoCl2•6H2O
5
3）有机成分母液的配制
MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制[1]（具体配制见下表）。
配制的步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
各种化合物用量如下表：
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
浓缩
倍
数
称
取
量
/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取量/ml
有
机
成
分
甘氨酸
200
100
250
5
盐酸硫胺素
5
盐酸吡哆素
25
烟酸
25
肌醇
100
5000
4）铁盐母液的配制
铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→→定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。
用时每配lL培养基取该溶液5ml。
各种化合物用量如下表：
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
浓缩
倍
数
称
取
量
/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取量/ml
铁盐
Na2EDTA•2H2O
200
3730
500
5
FeSO4•7H2O
2780
5）植物生长调节物质母液的配制
对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml-1或ppm较为方便，·ml-1的母液[5]，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。
2,4-D/NAA用少量95％酒精溶解，再加水定容；6-BA/KT应先溶于少量1mol·L-1的HCl中，再加水定容。
具体配制见下表：
母液
种类
成分
称取量
（mg）
母液定容体积（ml）
母液浓度（mg/ml）
生长素
2,4-D
50
100
NAA
50
100
细胞分裂素
6-BA
10
100
KT
10
100
其它常用试剂的配制
盐酸（lmol·L-1）：
%、
氢氧化钠（lmol·L-1）：
用固体氢氧化钠配制
75%酒精（v/v）：
用95%的酒精来配制
稀铬酸洗涤液：
重铬酸钾50g溶于1000ml蒸馏水中，冷却后缓慢加入工业用硫酸90ml[6]。
配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。
母液最好在2～4℃的冰箱中保存。
尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。
贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。
（2）胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制
培养基配方设计：
1）根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。
2）确定培养基中各种激素的浓度及相对比例。
配方：
MS基本培养基＋1mg/L2,4-D＋＋＋％琼脂＋3％蔗糖。
配制体积：
，每人用50ml三角瓶分装5瓶，每瓶约装25ml培养基。
配制步骤：
（1）药品及用具的准备
（2）培养基的配制步骤：
①各种成分的计量：
根据配制培养基的体积、配方和母液浓度计算各种成分的用量。
②称量琼脂，加入适量的蒸馏水占总体积的（60%-70%），加热溶解。
③吸取规定用量的母液于干净烧杯中。
④称量规定用量的蔗糖。
⑤混合各种成分。
⑥加蒸馏水定容至所需体积。
⑦。
⑧培养基的分装。
⑨培养基的灭菌。
⑩无菌蒸馏水和接种工具准备。
（3）胡萝卜愈伤组织的诱导
1）准备工作
①外植体表面灭菌前的准备工作：
a接种室的清洁和消毒；b超净工作台的开机和消毒；消毒溶液、无菌水、装材料的容器、解剖刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。
②实验材料的准备：
a准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料；b实验材料的修整、刷洗、冲洗；c用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净。
2）植物材料的表面灭菌和接种[5]
①操作人员洗手消毒；②装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒；③将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒，取出用无菌水冲洗干净；④倒入消毒剂（%HgCl2）并计时；⑤到预定时间（20分钟）后倒出消毒液并用无菌水清洗干净；⑥将材料切块后接种到诱导培养基上。
（4）胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制
培养基配方设计：
1）根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。
2）确定培养基中各种激素的浓度及相对比例
配方：
MS基本培养基＋,4-D＋＋200mg/L水解酪蛋白＋％琼脂＋3％蔗糖
配制体积：
，用50ml三角瓶分装成20瓶，每人5瓶。
配制流程：
（胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制）
a）药品及用具的准备
b）培养基配制
（），放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。
：
（配置前先检查各母液情况，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用）。
大量元素母液：
50ml；微量元素母液：
；铁盐母液：
；有机物母液：
。
，1mg/LNAA取1ml。
混匀。
，加入规定用量的蔗糖（15g），继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，再加入100mg水解酪蛋白和所需用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），最后加蒸馏水至所需体积，即500ml。
c）
d）培养基的分装
配制好的培养基要趁热分装，培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用棉线扎紧。
本次实验中500ml分装到20个三角瓶，每人5瓶。
e）培养基的灭菌
培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。
消毒灭菌时，·MPa（～，MPa），温度121℃时保持15～30min左右即可。
f）接种工具准备
接种工具用纸包好灭菌。
（5）胡萝卜愈伤组织的继代培养
1）准备工作
①接种室的清洁和消毒；②超净工作台的开机和消毒；③解剖刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；④实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于净工作台上）
2）愈伤组织继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的生长状态良好、色泽新鲜未褐化的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代培养基上，放置在25℃全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
3）培养结果
文字描述配合图片记录培养结果
注意事项
（1）培养基配制过程注意事项：
1）玻璃器皿的洗涤；2）天平的使用；3）配制大量元素母液时溶液的混合顺序；4）铁盐的配制；5）洗液的配制；6）生长调节物质的配制。
（2）胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制过程的注意事项：
1）母液使用前的检查；2）计量、称量、量取准确；3）量取各母液的移液管单独使用，不混用；4）加热溶解过程中液体不能外溢；5）pH值的调节问题；6）分装问题；7）封口；8）灭菌问题：
高压蒸汽灭菌锅的使用、灭菌时间、灭菌温度。
（3）培养基灭菌注意事项
1）灭菌前检查锅内是否有足够的水。
2）装锅不可过满。
3）为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。
4）培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。
5）当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。
切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。
（4）无菌操作过程注意事项
1）操作前要洗手消毒；
2）操作器械要灭菌，使用时可用酒精消毒和灼烧灭菌；
3）接种时和封口时在酒精灯前操作；
4）封口膜一定要绑好。
（5）培养基的保存[4]应注意以下几点：
1）灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。
检验是否无菌的方法：
将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。
2）保存在低温条件下。
常温下保存时要进行防尘和避光处理。
3）保存时间不可过长。
5．实验数据处理方法：
采用记录原数据以及课本资料提供数据进行配制及使用。
6．参考文献：
[1].李浚明，（第3版）.,2.
[2].孙静三，：
科学出版社，1995.
[3].：
中国农业出版社，2002.
[4].潘瑞炽主编.植物组织培养（第三版）.广州：
广东高等教育出版社，2003.
[5].郭勇，崔堂兵，谢秀帧编著.：
科学出版社，2004.
[6].曹孜义，刘国民主编.：
甘肃科学技术出版社，2001.
二．实验报告
1、实验现象与结果
1）、实验现象
胡萝卜愈伤组织诱导培养时，在恒温箱全黑条件下培养1周就可看出诱导结果，1-2周可用于继代培养。
胡萝卜在培养过程中的颜色变化如下：
橙红色→浅黄色→乳白色→浅绿色（见分析）。
2）、实验结果
（1）胡萝卜愈伤组织诱导培养，共5瓶，最终结果只有2瓶诱导成功，且长势良好，其余3瓶均被污染。
具体情况如图1：
图1胡萝卜愈伤组织诱导培养结果
由图1可知：
1、2号瓶内的胡萝卜愈伤组织长势良好，3、4和5号瓶内胡萝卜均被污染。
其中，3号胡萝卜块已发黑；4号瓶呈浮云状，长有大量的霉菌，虽然胡萝卜块未被污染，但不能用了；5号明显长菌，也是和3号瓶一样被细菌污染了。
具体统计如下：
表1胡萝卜愈伤组织诱导结果统计
总接种瓶数
5瓶
总接种块数
20块
污染瓶数
3瓶
污染块数
8块
未污染瓶数
2瓶
未污染块数
12块
未污染块中愈伤组织发生块数
9块
愈伤组织发生率
75%
愈伤组织发生情况记录
愈伤组织的色泽较新鲜，但比较少
污染情况及原因分析
污染瓶中，有1瓶是真菌（霉菌）污染，2瓶细菌污染。
可能是因为接种时用力将切块压入培养基，破坏了培养基，同时滋生了一系列的好氧细菌的繁殖；另外，也可能是操作时没有完全掌握无菌操作技术以致引入细菌或真菌，造成污染。
无菌操作中，没有保持培养瓶封口膜的无菌条件，最终造成污染；具体分析如下：
①切材料时，下面垫的滤纸有破损或带菌；
②镊子、解剖刀等在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里，将还未完全消除的细菌带入酒精，引起感染，从而影响实验结果。
③操作时，手、三角瓶在盛材料的培养皿上方活动，容易把菌带到材料上。
（2）、胡萝卜愈伤组织继代培养全部被污染。
注意看会有一些小黑点，愈伤组织开始老化，部分开始分化。
具体情况如图2
图2胡萝卜愈伤组织继代培养结果
2、对实验现象、实验结果的分析及其结论
（1）.胡萝卜肉质根愈伤组织的诱导
1）其中有3瓶接种瓶受污染，可能是由于在使用解剖刀切胡萝卜时，拿镊子的部位靠下后导致污染了细菌；也可能操作时没有在超净工作台的无菌范围内；也可能由于材料本身内部已经收到了污染，或是在切离胡萝卜表面时，没有彻底将材料表面切干净，导致接种后受污染；也有可能所使用的工具消毒不够彻底，或是操作不规范，如接种掀开培养瓶封口膜时手指碰到了封口膜里面，或是封口膜没有绑紧，导致了微生物的进入。
说明在整个实验过程中，一定要注意无菌操作，否则，任何一个环节染菌都会导致外植体被污染，实验失败。
2）已接种好的材料，愈伤组织发生不好的或是没有发生的。
可能是由于：
①在配制培养基时，缺乏某种物质或没有将培养基混合均匀；②在分装培养基时，没有进行均匀倾倒；③所使用材料没有将其表面切除，因其结构被HgCl2破坏而无法使组织材料愈伤组织化。
外植体的选择很重要，由于实验中选了比较小的胡萝卜，与其他组相比愈伤组织的量或是色泽方面都较差，也许是因为不一样大小的胡萝卜，但消毒时间（30min）是一样的，可能使得胡萝卜组织受伤较重。
外植体经过消毒等处理，可在愈伤组织诱导培养基上进行培养，诱导脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再在继代培养基上可以增殖得到更多更好的愈伤组织。
（2）.愈伤组织继代培养
愈伤组织继代培养中，培养基全部被污染了，可能的原因如下：
①接种前，胡萝卜切块太小，只留下分化程度较高的木质部和髓部，严重影响了脱分化和再分化的速率；②胡萝卜愈伤组织继代培养时接种的胡萝卜愈伤组织不纯；③接种取的愈伤组织较硬，切块均较大，不是Ⅱ型愈伤组织；④在操作过程中，可能是因为接种时用力将切块压入培养基，破坏了培养基，同时滋生了一系列的好氧细菌的繁殖；⑤外植体灭菌不彻底，带入细菌；⑥消毒液消毒的时间不够导致灭菌不彻底,或时间过长影响到外植体的生长活性；⑦未严格遵守无菌操作技术导致灭菌不彻底，器械上带菌；或是操作过程中手不小心碰到了培养皿或瓶口，带入了手上的细菌。
愈伤组织继代培养中，注意看会有一些小黑点，原因是愈伤组织开始老化，部分开始分化愈伤组织生长需要大量的营养，由于培养时间过长，培养基中的营养成分及水分不能满足愈伤组织的继续生长和生活，故出现死亡。
3、实验讨论
1）.调节培养基PH时，，但因其培养基经高温高压灭菌后，蔗糖会分解，PH值会有所下降，。
2）.植物组织培养实验中，必须的前提是：
无菌操作，胡萝卜肉质根（外植体）经HgCl2和酒精消毒后，即认为是消毒干净，在此后的操作中，要注意对其用具彻底消毒，操作过程中动作要规范实施。
3）.废液进行回收处理，酒精、HgCl2浸泡完材料后，应统一倒入指定容器。
4）.切胡萝卜时，下方要垫上无菌滤纸。
5）.接种时，动作要轻，力度要适中，不要把接种的材料切块压入到培养基里面，以致破坏培养基；切块大小要适中，不宜太大，也不宜太小。
6）.MS培养基的特点：
①无机盐浓度高；②高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；③有一定数量的铵盐，营养丰富；④不需要添加更多的有机附加物。
7）.植物组织培养所需的环境条件：
与自然条件一样，组织培养中的材料的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、PH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。
实验中要注意考虑这些条件的影响，并采取适当的措施控制好培养条件。
8）.植物组织培养所需的营养成分：
植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体的内部起到了一定的生理作用：
①组成各种化合物，参与集体的建设，成为结构物质；②构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；③元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用；④发育方面：
特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。
4、实验总结
1）、植物组织培养实验过程需要严格的无菌操作，而且一般历时较长，要将实验过程中的每一部分的操作内容记录下来，若出现问题方便排查问题所在。
2）、实验中使用的培养基配方都是沿用前人所研究的最适合的配方，实验只是掌握了植物组织培养技术的一般操作步骤和方法。
3）、植物组织培养实验中无菌操作是一个精细的活，是实验成败的关键。
我们在实验中一定要慎之又慎，确保每一步操作都尽量无菌，尽量排除人为因素对实验的影响，体现严谨的科学态度。
4）、在配培养基时，也要注意加入药品的先后顺序及药品浓度和量，严格计算和称取加量，并注意调培养基的PH。
尽量不要让已知培养基成分的培养基增加许多不确定因素。
5）、亲身体会了植物组织培养的基本实验流程，加深了认识，增强了学习生物知识的兴趣，同时通过对实验结果以及实验过程中所出现的问题的分析和讨论，加深了对激素的生长调节作用知识的理解和再认识。
6）、总的说来，本次实验还是较为成功的，虽然在实验中有几瓶被污染了，这属于正常现象。
植物组培实验最重要的是培养科学的严谨性，通过这次实验，收获匪浅。
但是，也有很多需要改进的地方。
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