Protein Expression Protocol 3th.docx

Protein Expression Protocol 3th.docx

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ProteinExpressionProtocol3th

目的基因克隆

目的基因克隆包括保存用全长基因（geneforsaving,GS）和表达用全长基因（geneforexpression,GE）两部分。

这两部分所克隆的基因都是全长片段，但克隆的策略及目的不同。

直接用精确克隆（及引物从基因CDS两端开始）很难找到高效价的引物，且cDNA中目的基因很少，成功克隆出基因很困难。

因此我们选择在CDS两端设计高效价引物，先将基因从cDNA文库中克隆，将克隆插入T载体中。

之后再设计一对用于精确克隆的引物，以插入目的基因的重组T载体为模板，克隆出用于表达的基因，插入T载体。

GS目的基因的拷贝数很高，及时引物效价不高，仍然能获得GE。

全长基因难以获得时（如GC含量较高），可克隆目的基因中800～1000bp的片段用于表达。

1．细胞复苏及培养

a．确定细胞复苏用得培养液。

培养液使用前37C水浴温育。

b．预先准备10ml的相应培养液，用于洗涤复苏细胞

c．从液氮中取出cell后，37C温育至融化。

开盖前用酒精消毒

d．用移液管将复苏细胞转入stepb中的培养液中洗涤，除去冻存cell中的DMSO

e．1000rpm，5min，去上清，轻轻振荡重悬cell，加入1ml左右新培养液，混匀

f．转移cell至含20ml左右培养液的培养瓶中，盖口不能拧紧，37C培养至培养瓶壁贴满cell

g．培养约2－3天至细胞贴满培养瓶壁时将细胞传代，分装两个培养瓶，一个保种，一个抽RNA。

2．RNA抽提

悬浮细胞组织器官单层贴壁细胞

（5-10X106）（50-100mg）107

1000rpm，5min离心匀浆胰酶消化至细胞悬浮，1000rpm，5min离心

PBS洗涤两次（PBS无须DEPC处理），

1mlTRIREAGENT裂解，用枪吹打混匀，室温5min

可-20度保存留用，or

200ul氯仿（剧烈摇匀vortex，室温5min,ice5min）

12000g15min4℃

取水相（500ul以上）加入等体积异丙醇（室温5min,ice5min）

加完异丙醇立即上下颠倒5－10次混匀，若同时抽多管，则每次加完一管后都应立即混匀

12000g15min4℃

倾倒除去上清，并用枪吸干

1ml75%乙醇wash一次，用枪吹打均匀

7500g，5min4℃

去上清，尽量用枪吸尽

airdrytheRNApellet,2～3min

donotletRNAturntranslucent

50ulddH2O（DEPCtreated）dissolvebyapipet

检测O.D值/1%agsrose电泳

RNA分装成10ul后冻存，防止反复冻融使RNA降解。

取RNA时一定带上手套，避免手上的RNA酶污染。

抽提RNA后应跑核酸电泳检测RNA纯度及降解程度。

一般RNA抽提后应在700bp～1.5kb范围内有两条清晰的带。

3．ReverseTranscription

System（40ul）

5Xbuffer8ul

0.1MDTT4ul

dNTPs（10mM）8ul

RNAseinhibitor0.5ul

Superscriptase1ul

Oligo（dT）12-16（0.5ug/ul）1ul

SampleRNA（4ug）4ug

DEPCH2Oaddto40ul

将OligodT与RNA，DEPC水混匀后，70C水浴10min（封口），冰浴2-3min，加入其余上述混合液，37C水浴1.5h，95C水浴5min（封口），冰浴，-20Cstore。

RT-PCR水浴时封口膜封EP管，防止水蒸发影响反应体系。

RT-PCR后用持家基因HPRT引物PCR，检测RNA抽提质量。

HPRT退火温度60C左右。

HPRT长度较小，为与引物二聚体区别，PCR时需做一不加模板的空白对照

取DEPC水时切记带上手套

Genequant使用方法：

开机－set-up－enter（只更改DNA/RNA，看光波是否为320nm）－set-ref（此时插入空白对照）－样品

1．使用前将比色皿中水吸出，用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽（先用1ml枪吸，后用100ul枪吸）。

2．加80ul水测对照

3．2ulRNA稀释40倍测浓度

4．测完后看RNA浓度（conc键），ratio值（ratio键）

4．引物设计

利用VectorSuiteNTI设计目的基因引物（克隆产物用于保存时，引物不用加酶切位点；用于表达蛋白时，引物两端须加上相应的酶切位点）

引物设计注意事项：

a．所设计引物的rating值最好为171，两个引物的Tm值不能相差太大，最好在1C之内。

Tm值应在50－70C之间，不能太小。

b．设计好后，用NTI选择引物二聚体较少的primer，dimer最多不能超过8对。

c．将NTI软件中的所有酶切位点全部加入。

系统默认的酶切位点很少。

d．目的基因片断中不能包含引物两端的酶切位点。

e．酶切位点两端应加对应的保护碱基。

f．对照相应的载体核对阅读框是否正确。

注意载体a,b,c亚型ORF的区别。

g．选择普遍表达、实验室有相关cDNA的基因或基因亚型。

http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?

db=PubMed

h．当表达载体的tag在C端时要注意插入片段后对tag读码框的影响。

如histag，要防止它因为读码框改变而变成Pro或Thr。

i．核对读码框，保证质粒插入片断后不影响其MCS后面的终止子ORF，使融合蛋白能够有效的终止。

j．目的片断的GC含量不能超过70%，最好65%以下。

高GC值片断PCR不易成功

k．3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

3’最好以G或C结尾，防止AT的松散结合引起错配

每条引物合成2OD（1OD约为33µg）

引物稀释

每个引物稀释成10µmol/ml

所加水量＝3.3*10e6/MWµl

5．PCR

PCR退火用不带酶切位点和保护碱基那一段引物的退火温度。

该温度可以用VecterNTI查询。

用梯度PCR仪进行不同退火温度条件摸索。

一般变动范围为8C即可。

TaqPCR摸复性温度

System（30µl）:

10*reactionbuffer（forTaqenzyme）3µl

MgCl21.8µl

dNTP1.5µl

primersAs1µl

Sp1µl

cDNA0.5µl

ddH2O21µl

Taq0.2µl

体系中cDNA和primers的量可以根据实际情况进行调整。

如：

PCR不能拉出产物时可以增加cDNA量至1µl。

若有非特异性条带，可进行TouchdownPCR，提高引物的特异性。

PCR反应条件：

194C5min

294C45s

365C45s退火温度视不同引物而定，此处65C仅作例证

472C1mingotostep2;30cycle

572C7min

64Cxmin该步视情况而定，若PCR过夜则x=12h

step4的1min视基因长度而定，TaqDNApolymerase合成效率为2kb/min。

TaqPCR摸索好退火温度和延伸时间等后进行PfuPCR。

PfuDNA合成效率比Taq酶（2000bp/min）低，因此PfuPCR的延伸时间比TaqPCR适当延长20s。

电泳验证后进行PfuPCR

System（30µl）:

10*reactionbuffer（forPfuenzyme）3µl

dNTP1.2µl

primersAs0.6µl

Sp0.6µl

cDNA0.5µl

ddH2O23.3µl

Pfu0.3

做四个30µl体系，以便进行胶回收。

关于PCR更多的问题可以参照附件中有关PCR的综述。

6．胶回收（使用前检查kit里的Washingbuffer是否已加无水乙醇，预开55－65度水浴）

采用上海申能博彩生物技术有限公司的DNA凝胶回收试剂盒，操作步骤如下：

A紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,计算凝胶重量。

B每100mg胶加400ul的SNsolution,于55-65C加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化（约6-8min）。

C每400ul的SNsolution加入100ul的solutionB，混匀。

D把混合液加入3S柱（DNA收集柱），室温放置2分钟后，10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的液体。

E向3S柱中加入600ulWashsolution,10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的液体。

F重复estep

G10000rpm离心2分钟，尽量取出液体，倒掉收集管中的液体。

H将3S柱置于干净的1.5ml的EP管中，在3S柱的膜中央加入30ul预热的TEsolution,55-65。

C水浴放置2分钟（可在水浴锅中加盖放置，提高洗脱效率），15000rpm离心1分钟。

－20。

C保存。

为了提高洗脱的效率，可先用20ul洗脱，然后再重复用10－20ulTE洗脱。

洗脱步骤相同。

胶回收时尽量用较少的TE洗脱（15ul），提高胶回收产物的浓度。

或DNA电泳时上样量增加也可获得相同效果。

PS：

胶回收产物与载体连接时，决定连接效率的主要是胶回收产物的浓度。

载体的含量可相对降低

7.PCR产物与TA载体连接

pGEM-TvectorisT-tailedattheinsertsite.Toimprovetheligationefficiency,itisrecommendedPCRproductbeA-tailed.

+Asystem

PurifiedPCRproduct6.1ul

dATP（1mM）2ul

10×Taqbuffer1ul

MgCl20.6ul

Taq0.3ul

vortex,thenincubateat70Cfor15~30min

LigationwithpGEM-Tvector

1.BrieflycentrifugethepGEM-TandControlInsertDNAtubestocollectcontentsatthebottomofthetubes.

2.Setupligationreactionsasdescribedbelow.Note:

Use0.5mltubesknowntohavelowDNA-bindingcapacity（e.g.,VWRCat.#20170-310）.

3.Vortexthe2XRapidLigationBuffervigorouslybeforeeachuse.

LigationSystem

2×rapidreactionbuffer5ul

pGEM-Tvector0.5ul

+Aproduct3.5ul

T4DNAligase1ul

Vortex,thenincubateat25Cfor1h.Ligationproductcanbeusedirectlyfortransformationorstoreat-20C

连接温度及时间：

TA载体可快速连接，2h即可，25C，也可4C过夜。

表达载体连接16C3h后即可转化，或4C/16C连接过夜。

Transformationandselectionofthetargetclone

a.取出感受态菌室温放置至半融状态。

b.加入5μl质粒（若为连接产物，取5ul转化；若为纯质粒，取1ul转化），轻搅至混匀。

冰浴30分钟。

c.42℃热休克45－50s，注意热休克时不能搅拌或振动。

d.冰上放置2－3min。

e.加入500μl无抗生素LB液体培养基，37℃摇床培养30min。

f.取菌液300μl涂平板，37℃倒置培养12－16h。

（如是纯质粒转化，取50ul涂板即可；如是连接产物转化，可10000rpm离心后，留100ul上清取50-100ul涂板）

TransformationefficiencyofTAvectorisrelativelyhigherthanthatofdouble-enzyme-digestionligation.So100ulLBafterincubationshouldbeenoughtospreadontheplate.

100µlof100mMIPTGand20µlof50mg/mlX-GalmaybespreadoverthesurfaceofanLBampicillinplateandallowedtoabsorbfor30minutesat37°Cpriortouse.SpreadIPTGfirstontheplate,thenX-Gal.Therewillbeprecipitates,Ifmixthetwoinatube.

ForTAclone,afterincubateat37Covernight,placetheplatein4Cfor2~5htoidentifythetargetclone.

SuccessfulcloningofaninsertinthepGEM-TVectorinterruptsthecodingsequenceofβ-galactosidase;recombinantclonescanusuallybeidentifiedbycolorscreeningonindicatorplates.Thoseinsertedclonesarewhite,theothersblue.

8.TA质粒转化菌落的验证

与表达载体的验证不同，转化TA质粒时不用双酶切验证。

只需用目的基因引物和TA载体引物PCR验证即可。

TA载体引物PCR片段比插入片段大约长150bp。

目的基因退火温度与之前胶回收时温度相同，TA退火温度60C即可，但可在55～70之间变动，不会影响结果。

挑取至少6个白色克隆于6个含4ml抗性的LB培养基的灭菌试管中37C过夜摇菌。

取摇约2h时的菌液1ul作为模板，TaqPCR（30ul）验证（验证时条件等应与以前一致）。

取菌液时应在超净台中进行，以便PCR验证为阳性后可以直接对相应的菌落进行小量质粒抽提。

最好不用菌落直接PCR，避免由于质粒粘附在细菌表面而引起的假阳性。

对PCR验证后阳性的细菌小抽

验证时所用的control及样品：

1．白色菌落T载体引物PCR

2．白色菌落目的基因引物PCR

3．蓝色菌落T载体引物

4．1中T载体引物PCR、胶回收后，用回收产物做模板，目的基因为引物PCR，进一步验证

9．小量质粒抽提

采用上海博采生物工程有限公司提供的小量质粒快速抽提试剂盒，操作步骤如下：

1．取菌液1.5ml，高速离心10000g1min收集菌体。

可以在初次离心后弃上清再加入相同的菌液，增加小抽的细菌数量，提高最终质粒的浓度。

2．弃上清，沉淀中加入100ulS1，振荡至彻底悬浮。

3．加200ulS2，立即上下颠倒，使细菌裂解，室温放置2min至溶液澄清。

（使用前先观察S2中是否有沉淀，室温低时S2中SDS会沉淀，此时40C水浴使之融解）

4．加400ulS3，立即上下颠倒5－10次，使充分中和，室温放置2min。

5．15000rpm，10min

6．将上清转移到2ml样品收集管和3S柱中，室温放置2min，10000rpm，1min。

转移上清时切忌吸取蛋白沉淀。

7．取下3S柱，弃废液，将3S柱置入同一支收集管中，吸取700ulWashSolution到3S柱，12000rpm，1min。

（用WashingSolution前先确认其是否加了乙醇，不加乙醇的WS会将质粒洗脱）

8．重复step7

9．取下3S柱，弃废液，10000rpm，1min。

10．将3S柱置于干净的1.5ml离心管中，在膜中央加30-50ulTE或水，加盖50C水浴2min，然后15000rpm，1min。

离心后液体-20C保存。

10.测序

突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。

测序报告中blast时若有‘－’符号，则人工对照测序图谱。

测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽，50ul，conc300ug/ml备份。

测序文件应妥善保存，蛋白表达完成后一并提交存档。

获得GS后，即可构建含GE的重组T载体，用于表达。

GET载体的构建与GST载体构建步骤相同（GS的引物需加酶切位点和保护碱基）

若序列正确，应及时保存相应的质粒及细菌（DH5α）。

保存要求：

小抽质粒50ul，细菌0.6~1.0ml于30％甘油中。

菌种保存及复苏

保存：

在0.6ml过夜培养物中加入0.2ml灭菌的60%甘油。

Vortex以确保甘油分散均匀。

置于-70C保存

复苏：

用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面，立即将黏附在接种环上的细菌划在含有适当抗生素的LB平板表面。

将冻结的培养物放回-70C冻存，平板于37C培养过夜

表达质粒构建

表达质粒构建概括而言即是将GE上的目的基因插入pET28、30等表达载体上。

一般插入至少2个表达载体上，提高蛋白表达的概率。

11．T载体和表达载体双酶切

System（20ul）

表达载体12ul

双酶切buffer2ul

限制性酶a/b1/1ul

ddH2O4ul

T载体双酶切10ul体系即可；表达载体切20ul体系。

37。

C水浴30min～1h

有些限制性酶buffer需要加BSA，视情况而定。

双酶切后跑电泳，胶回收相应条带，进行连接反应。

12.酶切产物的连接

System（10ul）

10×连接缓冲液1μl

PCR目的片断双酶切产物5μl

空质粒双酶切产物2μl

T4DNA连接酶0.5μl

ddH2O1.5μl

16C连接3h以上，一般3h后即可用于转化。

也可置于4C连接过夜。

如T载体双酶切的目的基因条带比较淡，可以增加体积至6.5ul连接。

连接时表达载体的量应该少于T载体双酶切产物的量，使之充分连接。

13．连接产物转化DH5α（预开42C水浴）

与T载体转化相同，先转化DH5α，筛选及扩增目的重组质粒

转化DH5α后挑6～8个菌落验证，验证项目：

1．目的基因引物PCR验证

2．表达载体引物PCR验证

3．Step2中PCR产物胶回收后，以胶回收为模板、基因引物进行nestPCR

4．小抽双酶切验证

验证后再小量抽提质粒，保存50ul质粒及相应的DH5α细菌

小抽重组质粒转化表达菌BL21。

转化BL21后只需基因引物PCR验证

目的基因表达

14．快速诱导表达

快速诱导目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白，并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。

5．挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。

6．37C，1mMIPTG终浓度诱导蛋白。

取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:

100接种，37C培养时，细菌生长至OD600＝0.4-0.6约需2h）时加入终浓度为1mM的IPTG。

7．诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例（如1mlOD600为0.4的菌加40ulbuffer）加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样。

8．根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶。

（50KD蛋白10％或12％）

9．诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入相应体积的2×上样缓冲液，vortex。

10．将收集的菌液在水中煮5min，上样10μl，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。

11．取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是新配的，染20min就够了），脱色液脱色。

若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。

注意：

a.记录诱导后菌液的OD600

b.SDS-PAGE结果确定蛋白诱导后，再进行低温小量蛋白表达

c.制备的两个重组表达载体可同时进行快速诱导

SDS-PAGE胶样品排列：

Marker

UI

I37C

UI’

I’

Marker：

低分子量蛋白marker，上样10ul

UI：

未诱导菌液，上样10ul。

任取37C和20C中一个

I：

诱导后对照，上样10ul

UI’,I’代表GST等空载体转化的BL21未诱导和诱导后的对照

若表达载体是GST等大分子蛋白tag，则应做一个诱导空载体的对照。

SDS-PAGE时取未诱导的空载体和诱导后的空载体一起上样（诱导温度37C，IPTG1mM），以检测诱导体系是否成功。

15.小量蛋白诱导表达

该步骤的目的是检测蛋白是否在上清存在表达。

低温时蛋白易于表达于上清，因此小量蛋白诱导表达以20或30C为培养温度。

1.挑一单克隆的菌落于5ml含有相应的抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜（8-16h）。

2.过夜培养液加入三瓶50ml含有相应的抗生素LB锥形瓶中（用250ml以上锥形瓶摇菌，保证培养液体积不超过菌液体积的25％，给细菌良好的生长环境），20/30℃振荡培养至OD600达到0.4-0.6。

一般转种诱导的比例为1：

100，或者1：

50（实际条件数可根据情况调整，如IPTG梯度、延迟诱导，加无水乙醇等）

3.取1ml培养液测其OD600值，收集细菌，按1ml菌液×OD600加入100μl的比例加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样。

4.诱导时加入相应的IPTG浓度（0.1,0.5,1mM），20/30℃振荡培养。

每隔1h取1ml样品，以观察目的蛋白表达是否会在一定时间降解，诱导4h左右。

若IPTG浓度较低，如0.01,0.001mM，可诱导过夜。

（低IPTG浓度可降低目的蛋白合成的速度，使细菌有相对充分的时间对目的蛋白进行折叠，形成可溶蛋白）

5.根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶。

（50KD蛋白10％或12％）

6.诱导大约4h后收集菌液，取40ml菌液于50ml离心管中，7000rpm，15min，4C。

去上清，离心管置于冰上15min。

7.以每100mlOD600为1.5菌液加入4ml1