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肾活检组织标本的制作

第三章

第10节

肾活检组织标本的制作

前言

肾活检病理是诊断肾脏疾病的重要手段，许多疾病的命名主要源于肾活检组织学改变，如局灶节段性肾小球硬化和膜性肾病。

肾活检病理诊断的正确性与肾组织标本制作质量关系密切，质量不过关（如切片不够薄，染色不清晰）将直接造成诊断错误，因此，应重视肾活检标本处理（取材、固定、包埋、切片到染色）的各个环节，以保证病理诊断的正确性。

肾脏病理包括尸检和活检标本，对于肾脏疾病而言，主要是活检标本，本章主要介绍肾活检标本的处理。

目前常规肾活检标本来源有两类：

一类为切割式活检，一类为穿刺抽吸式活检，前者所取组织较多，但对肾脏损伤较大，不便在临床推广，临床常采用穿刺抽吸式活检。

一、肾组织取材

肾活检穿刺时病理技术员必须到场，以便对肾组织标本进行正确的处理，在技术员不能到场的情况下，必须按以下要求对标本处理者进行培训：

①处理穿刺所获组织应轻柔，避免牵拉或用力钳夹组织；②分取组织时应在蜡板上进行，用锋利的刀片快速切割，避免用力挤压组织；③尽量用含固定液（光镜或电镜）和生理盐水的专用镊子把分割好的组织块移入固定瓶内；用镊子时避免钳夹组织过度而造成组织受挤压；④要求穿刺者尽量取两条组织。

穿刺所获第一条含皮质组织送光镜检查，第二条组织在肉眼观察下进行分割，尽量切取皮质区1mm组织送电镜检查，余下组织送免疫荧光检查。

如果穿刺仅获一条组织，所取组织有三种情况（图3-10-1）：

整条均为皮质，皮髓组织和皮-髓-皮质组织，髓质区血供丰富，颜色略红，皮质区组织略白，分布的红色小点是肾小球，根据穿刺获取不同组织的情况，如图3-10-1所示进行分取。

也有人建议纵切后，一半送光镜检查，一半分割后分送免疫荧光和电镜检查，但存在组织太细，不易观察的缺点，临床较少使用。

⑤分送免疫荧光检查的组织用无菌的TRIS或PBS溶液浸湿的沙布轻轻包裹，置于培养皿中，避免直接置于冰块上，以免局部组织因冷冻收缩，造成结构破坏[1,2]。

肾活检穿刺组织的分取

图3-10-1肾活检穿刺组织的分取

LM：

光镜；IF：

免疫荧光；EM：

电镜

二、光镜标本的处理

（一）固定

光镜标本的固定液有多种。

目前最常用的固定液为10%的中性福尔马林。

中性福尔马林固定液的配方：

甲醛（40%）100ml、蒸馏水900ml、磷酸二氢钠4g、磷酸氢二钠6.5g，固定时间至少6~12h。

（二）前期处理

1.脱水脱水的目的是去除固定和水洗后组织中的水分，便于后续的透明和浸蜡，常用的脱水剂是乙醇或丙酮，后者脱水能力比乙醇强，但对组织收缩较大，致使组织变脆，多用于快速脱水。

为了彻底脱水，一般常规采用不同浓度梯度的乙醇进行脱水：

①70%乙醇10~20min，´2次；②80%乙醇10~20min，´2次；③90%乙醇10~20min，´2次；④95%乙醇10~20min，´2次；⑤无水乙醇10~20min，´2次。

2.透明透明的目的是便于石蜡包埋，因为组织脱水后，所用的脱水剂大多数不能和石蜡相混合，必须通过透明剂的作用才能浸蜡，所用的透明剂必须既能和脱水剂相混合，又能和石蜡相混合，起到桥梁作用，不但能提出脱水剂，又能代替脱水剂利于石蜡的浸入。

当组织全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，故称为透明。

透明剂都是石蜡溶剂，绝大多数都不能与水混合，最常用的透明剂包括二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油等。

（1）二甲苯：

是应用最广的一种透明剂，价格便宜，沸点为144°C，折光率为1.497，易挥发，无色透明液体，易溶于乙醇又能溶解于石蜡，不能和水混合，透明力强，作用较快。

最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能停留过久。

通常在组织进入二甲苯以前先经过1/2纯乙醇和1/2的二甲苯的混合液。

（2）甲苯：

性质同二甲苯，沸点110.8°C，价格亦较便宜，透明较慢，但优点是组织在其内停留12~24h也不变脆，故优于二甲苯。

（3）氯仿：

组织在其中浸存较久时收缩不明显，也不变脆。

因为它的易挥发性，渗入组织的氯仿，高温时比二甲苯易挥发，是其优点。

缺点是渗透力稍弱，比二甲苯和甲苯慢，故透明时间较二甲苯时间延长2-3倍。

3.浸透和包埋组织经过脱水和透明后，要让石蜡等支持剂透入内部使组织变硬，并将组织包埋以利于切片，这个过程称为“浸透”和“包埋”。

浸透的目的在于去除组织中的透明剂而代之以石蜡，使石蜡渗入组织内部后把软组织变为有硬度的蜡块，便于切片。

石蜡是最常用的包埋剂。

使用优质石蜡能保证切片厚度，无刀痕。

根据石蜡熔点不同，石蜡分为软蜡和硬蜡，软蜡熔点低，硬蜡熔点高。

一般在室温高时用熔点高的蜡，室温较低时用熔点低的蜡。

4.切片将蜡块修理成小梯形状，进行连续切片，常规切片厚度为2mm，有条件可进行1.5mm的连续切片。

对于特殊染色，如刚果红则需厚度为5mm的切片[3~5]。

（三）染色

肾组织标本既要观察细胞结构，又要观察基底膜病变，许多肾脏疾病与免疫复合物相关，因此肾活检标本除常规苏木素-伊红（Hematoxyln-Eosin，HE）染色，需要多种特殊染色如PAS（periodic-acidschiff，PAS）、PASM（periodicacid-silvermethenamine，PASM）和Masson三色染色等[6~8]。

1.苏木素-伊红染色法HE染色法即常规染色法，主要显示各种组织正常成分和病变的一般形态结构，进行全面观察。

目前关于病理组织学的基本知识，绝大部分都是基于对HE染色切片的观察。

在HE染色上基本可以观察到各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复。

（1）苏木素染液配制方法：

将苏木素溶于乙醇，倾入明矾液中，混合后煮沸，加入氧化汞1g，以玻棒搅匀，溶液呈深紫色，立即移入冷水中，使之冷却。

静置过夜，过滤封闭保存，用前若加5％醋酸则染色较佳。

配方为：

苏木素0.9g、醋酸12ml、氧化汞0.5~1.0g、蒸馏水200ml、纯乙醇10ml、甘油20ml、钾明矾20g。

（2）伊红乙醇配制方法：

将伊红乙醇溶解后，用滴管滴加醋酸使其呈糊状，加数毫升蒸馏水即可，过滤，将滤出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95％乙醇200ml中即可。

配方为：

伊红1g、蒸馏水10ml、醋酸数滴。

（3）染色过程：

①切片常规脱蜡入水；②苏木素染色3~10min；③自来水充分冲洗3~5min；④0.5%~1%的盐酸乙醇分化数秒钟；⑤自来水冲洗1~5min；⑥弱碱性水溶液返蓝；⑦自来水至蒸馏水冲洗5~10min或更长；⑧0.5%~1%的伊红3min；⑨乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

（4）染色结果：

细胞核被苏木素染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，黏液呈灰蓝色。

细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞质内嗜酸性细胞颗粒被染成反光强的鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色。

高质量的HE染色细胞核与细胞质蓝红相映，且胞核鲜明，核膜、核仁及核染色质颗粒均清晰可见（图3-10-2）。

图3-10-2HE染色：

细胞质呈红色，细胞核呈蓝色（400）

2.PAS染色法PAS染色法属于特殊染色，不仅能显示糖原，而且还能显示中性和某些酸性黏液性物质、软骨、脑垂体、霉菌、脂质、色素、淀粉样物质及基底膜。

PAS的染色原理为：

过碘酸是一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1,2-乙二醇基，使之变为二醛；醛与Schiff氏试剂结合生成一种品红化合物，显现为红色。

（1）Schiff氏液配制方法：

将蒸馏水煮沸，冷至60℃，溶入碱性品红，冷却后过滤，至50℃时加盐酸，25℃时加偏重亚硫酸钠，黑暗中贮放过夜，加入活性碳，摇1min后过滤，4℃暗色瓶中备用。

配方为：

碱性品红1g、偏重亚硫酸钠2g、1N盐酸20ml、活性碳2g、蒸馏水200ml。

（2）染色过程：

①切片常规脱蜡入水；②1%高碘酸氧化10min，水洗；③Schiff氏液10min，水洗；④苏木素染核，盐酸分化，水洗；⑤脱水，透明，封片。

（3）染色结果：

糖原、基底膜及其他PAS阳性物质均呈红色，细胞核呈蓝色（表3-10-1）。

肾小球基底膜、系膜基质、包曼囊壁、肾小管基底膜阳性，淀粉样物质弱阳性（图3-10-3）。

3.PASM染色组织中的粘多糖和蛋白质与银化合物结合后，再经过甲醛还原成为金属银，沉淀于组织内及表面，呈黑色，因此，这些物质又称为嗜银性物质（表3-10-2）。

同时再套用Masson红复染，以显示免疫复合物的沉积。

（1）六胺银液配制（用时现配，硝酸银在切片放入染缸前加入并摇匀）。

配方为：

预温蒸馏水23ml、15％六次甲基四胺6ml、5％硼砂4.5ml、冰醋酸1.0ml、磷钨酸0.8g。

PAS反应阳性物质

物质种类

举例物质

染色结果

多糖

糖原

强阳性

糖蛋白

胶原纤维、网状纤维、血清白蛋白、球蛋白

强阳性

基底膜

肾小球基底膜、肾小管基底膜、包曼囊壁

中等强度

淀粉样物质

淀粉样物质

弱阳性

各种色素

脂褐素

中等强度

软骨

软骨

强阳性

霉菌

曲菌

强阳性

表3-10-1PAS反应阳性物质

图3-10-3PAS染色：

肾小球系膜区基质，肾小球毛细血管袢，包曼囊壁及肾小管基底膜呈粉红色，细胞核呈蓝色（400）

（2）染色过程：

①切片常规脱蜡入水；②3%的碘溶于100ml　30%的乙醇，配制成碘乙醇，5min脱汞，水洗；③5%硫代硫酸钠5min脱碘，水洗；④1%高碘酸氧化20min，水洗；⑤六胺银液45min（根据光镜下染色结果确定染色时间），水洗；⑥3%硫代硫酸钠5min，水洗；⑦Masson红复染；⑧快速脱水，透明，封片。

（3）染色结果：

肾小球基底膜、包曼囊壁、肾小管基底膜呈黑色，免疫复合物为红色（图3-10-4），本染色对观察肾小球基底膜病变，免疫复合物的沉积非常重要，是肾活检必不可少的染色。

图3-10-4PASM染色：

肾小球基底膜及包囊壁呈黑色，免疫复合物呈红色，可见内皮下（↑所示）、上皮侧（↑所示）和系膜区（*所示）嗜复红物沉积（1000）

4.Masson三色染色用多种（3种以上）颜色显示多种组织（结缔组织）成分，用于判定各种组织、器官的病变与修复情况，以不同色调显示与区分某些非结缔组织及物质成分。

（1）Masson红染液配制方法：

变色酸2R0.6g、蒸馏水100ml、亮绿0.3g、冰醋酸1.0ml、磷钨酸0.8g。

（2）染色过程：

①切片常规脱蜡入水；②苏木素染核5min，盐酸分化，水洗；③Masson红30秒，水洗；④0.5%亮绿30秒；⑤快速脱水，透明，封片。

（3）染色结果：

胶原纤维呈绿色，免疫复合物呈红色，纤维素呈红色（图3-10-5，表3-10-3）。

g

图3-10-5Masson三色染色：

肾小球基底膜，包囊壁呈蓝色，免疫复合物呈红色，可见内皮下（↑所示）、上皮侧（↑所示）和系膜区（*所示）（400）

5.刚果红染色刚果红是一种分子为长线状的偶氮染色剂，以胺基和淀粉样物质的羟基结合，平行的附着在淀粉样纤维上，从而使淀粉样物质被染成橙红色。

（1）刚果红染液配制方法：

1％NaOH0.3ml、80％乙醇氯化钠刚果红饱和溶液30ml。

PASM染色反应阳性物质

物质种类

染色结果

各种基底膜：

肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜

强阳性：

黑色

系膜基质

强阳性：

黑色

免疫复合物

红色

淀粉样物质

不嗜银

表3-10-2PASM染色反应阳性物质

Masson三色染色反应阳性物质

物质种类

染色结果

各种基底膜：

肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜

强阳性：

蓝绿色

系膜基质

强阳性：

蓝绿色

免疫复合物

红色

淀粉样物质

淡染的蓝绿色

胶原及纤维组织

蓝绿色

表3-10-3Masson三色染色反应阳性物质

（2）染色过程：

①切片常规脱蜡入水（切片厚度≥5mm）；②苏木素染核，分化，水洗；③碱性刚果红液20min；④快速脱水，透明，封片。

（3）染色结果：

淀粉样物质呈橙红色，细胞核呈蓝色（图3-10-6a）。

6.高锰酸钾-碱性刚果红染色步骤同刚果红染色，在染刚果红之前，用高锰酸钾处理后，AA型淀粉样物质被降解，再行刚果红染色，不着色，为阴性，以区分AA型和非AA型淀粉样变性。

（1）染色过程：

①切片常规脱蜡入水（切片厚度≥5mm）；②高锰酸钾-硫酸液3min，水洗；③5%草酸漂白3min，水洗；④苏木素染核，分化，水洗；⑤碱性刚果红液20min；⑥快速脱水，透明，封片。

（2）染色结果：

淀粉样物质呈橙红色，细胞核呈蓝色（图3-10-6b）。

（四）各种染色过程注意事项

①常规脱蜡要彻底；②每次染色前双层滤纸过滤苏木素；③Schiff氏液要4°C保存；④PASM-Masson染色标本缸要干净、无水滴，切片要求90°C烤30min，显微镜下控制染色深浅；⑤刚果红染色切片厚度要求≥5mm。

图3-10-6a：

刚果红染色，肾小球系膜区，部分肾小管基底膜呈砖红色（400）；b：

高锰酸钾刚果红染色，经高锰酸钾处理后，非AA型淀粉样变性刚果红染色仍阳性（400）

三、免疫病理标本的制作[3,4]

免疫病理所采用的标本可用石蜡和冰冻切片，冰冻切片的肾组织新鲜，抗原保存好，并能在－70°C冰箱保存使用。

石蜡切片的制备同光镜标本。

下面主要介绍冰冻切片的制备。

（一）冰冻标本的制备

肾活检取材用于制备冰冻切片的标本，应放在预先用TRIS或PBS溶液湿润的干净纱布上，连同纱布放入清洁的玻璃小瓶或培养皿中，迅速放入冰桶中送实验室进行冰冻切片，避免直接放于冰块上，以免局部组织冻坏。

也可采用速冻方法进行准备。

组织速冻方法分液氮法和干冰-丙酮法。

①液氮法：

将肾活检后切取组织放入预先准备好的小容器中，缓慢放入液氮中，待组织接触液氮开始气化后，组织迅速冷冻形成冰块，取出后在液氮中送实验室进行冰冻切片，如不及时切片，也可放入液氮中或－70°C冰箱中保存。

②干冰-丙酮法：

准备好内放有OCT（Optimalcuttingtemperature，OCT）包埋剂的标本盒，将组织块完全浸没即可。

向装有干冰的保温杯内加入丙酮，调成糊状，将标本盒放入干冰中，待包埋剂变成白色冻块时，取出保存或切片同液氮法。

进行组织速冻时须注意，组织不能直接放入液氮，以免组织膨胀破碎，速冻用的包埋剂应适量，新鲜组织不能缓慢冷却，否则形成冰晶，造成组织结构破坏，冷冻后的组织应密封保存，否则会失水，组织块复温时，应在37°C加温速融，不能自然复温，否则造成组织结构破坏[9]。

（二）冰冻切片

将肾组织置于恒温冷冻切片机的冷冻头上，加少许OCT进行包埋，在－20°C下进行连续切片，切片厚度为3~4µm，一般切取20张，用于常规免疫病理（包括免疫荧光法和免疫组织化学法）及放入－20°C冰箱备用。

（三）免疫荧光法

1.直接法用荧光素标记的抗体与肾组织直接作用，在荧光显微镜下观察，以达到检测目的（图3-10-7）。

常用于直接法检测的荧光抗体包括：

抗IgG、IgA、IgM、C3、C4和C1q抗体[10]。

具体步骤：

①冰冻切片用10%小牛血清封闭（PBS稀释）；②去除多余液体，加稀释好的抗体，避光，湿盒内室温孵育40min；③流水冲洗，置75%乙醇1min，无水乙醇1min，吹干；④甘油封片，荧光显微镜观察。

免疫荧光直接法和间接法示意图

图3-10-7　免疫荧光直接法和间接法示意图

2.间接法用特异性抗体（一抗，未标记荧光）与肾组织结合形成抗原-抗体复合物，再用针对一抗的标记荧光素的二抗与上述抗原-抗体复合物结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，发出荧光，在荧光显微镜下观察。

间接法较直接法敏感5~10倍，而且只需一种标记的荧光抗体（图3-10-8）。

常用间接法检测的荧光抗体包括免疫球蛋白轻链，载脂蛋白A、E（ApoA,ApoE），乙肝抗原，肾组织IV型胶原等[10]。

具体步骤：

①冰冻切片如已干燥，可直接染色（如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干）；②10%小牛血清封闭（PBS稀释）；③去除多余液体，加稀释好的抗体后，避光，室温1.5h；④PBS冲洗3次；⑤加荧光标记的第二抗体，避光，置室温40min，水洗；⑥吹干，甘油封片，荧光显微镜观察结果。

图3-10-8　a：

直接法，IgG沿肾小球毛细血管袢分布；b：

间接法，肾小球毛细血管袢内ApoE阳性

（四）免疫酶标技术

免疫酶标技术（immunoenzymatictechnique）是指用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行的抗原抗体反应，其原理及操作程序与免疫荧光技术基本相似，差别在于用酶代替荧光素作为标记物，并以底物被酶分解后的显色深浅来反映组织中抗原或抗体的含量及位置，常用的酶为辣根过氧化物酶（horseradishperoxidese，HRP）和碱性磷酸酶（alkalinephosphatese，AKP），常用的显色剂有DAB（3,3-二氨基联苯胺）和AEC（3-氨基-9-乙基卡巴唑），前者为棕色（图3-10-9a），可长期保存，后者为红色（图3-10-9b），易于褪色。

免疫酶技术用于正常和病理组织中，称为酶免疫组织化学技术。

优点为：

可用普通光学显微镜观察，酶标记抗体染色后，标本还可用其他染料复染，以显示细胞形态或细胞核，标本可长期保存。

最常用的是过氧化物酶-抗过氧化物酶法，简称PAP法，此外还有生物素和亲和素（ABC）法。

免疫酶标技术分为间接法和直接法，其原理同免疫荧光直接法和间接法[12]。

下面分别介绍其步骤。

图3-10-9　免疫酶标染色

a：

胰岛Amylin染色，DAB显色为棕色；b：

肾组织Cytokeratin染色，AEC显色为红色

1.直接法①标本固定，冰冻切片已干燥，可直接染色（如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干），石蜡切片脱蜡、入水；②PBS洗涤2×3min；③3.1％H2O2（或1％H2O2甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10~20min；④正常血清（1:

10）孵育，室温20min；⑤滴加酶标记的抗体37℃1h或4℃过夜；⑥PBS洗涤3×3min；⑦DAB＋H2O2显色5~10min，镜下控制染色结果。

DAB＋H2O2应用前15min配制；⑧充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

2.间接法①标本固定，冰冻切片已干燥，可直接染色（如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干），石蜡切片脱蜡、入水；②PBS洗涤2×3min；③1％H2O2（或1％H2O2甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10~20min；④正常血清（1:

10）孵育，室温20min；⑤滴加第一抗体，37℃1h或4℃过夜；⑥PBS洗涤3×3min；⑦滴加酶标二抗，室温1h；⑧PBS洗涤3×3min；⑨0.04％DAB＋0.03％H2O2显色5~10min；⑩充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

3.单PAP法①标定固定后，PBS洗涤；②1％H2O2（或1％H2O2甲醇）阻断内源性过氧化物，室温10~20min；③PBS洗涤2×3min；④正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20min；⑤滴加一抗，室温1h或4℃过夜；⑥PBS洗涤3×3min；⑦滴加二抗，室温30min；⑧PBS洗涤3×3min；⑨加PAP复合物，室温60min；⑩PBS洗涤3×3min；

0.04％DAB＋0.03％H2O2显色5~10min（图3-10-9）；

充分水洗；

苏木素复染，封片观察。

4.PAP四层法（图3-10-10）：

①~⑩同单PAP法；

二次加酶标二抗；

PBS冲洗；

二次加PAP；

PBS冲洗；

0.04％DAB＋0.03％H2O2显色5~10min；

苏木素复染核，封片，镜检。

5.生物素和亲和素法（ABC法）①标定固定后，PBS洗涤；②1％H2O2（或1％H2O2甲醇）阻断内源性过氧化物，室温10~20min；③PBS洗涤2×3min；④正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20min；⑤滴加一抗，室温1h或4℃过夜；⑥PBS洗涤3×3min；⑦滴加二抗，室温30min；⑧PBS洗涤3×3min；⑨加ABC液，室温60min；⑩PBS洗；

0.04％DAB＋0.03％H2O2显色5~10min（图3-10-11）；

充分水洗；

苏木素复染核，封片，镜检。

过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物四层法

图3-10-10过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物四层法

生物素和亲和素法（ABC法）

图3-10-11生物素和亲和素法（ABC法）

四、电镜标本的制备

许多肾脏疾病必须依靠电子显微镜观察肾小球基底膜、电子致密物的沉积部位，沉积物的特点以及细胞器等超微结构的变化来明确诊断。

电镜标本的制作过程与石蜡切片相似，也包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节[12~15]。

而与石蜡切片不同的是，电镜标本的制备操作过程更为细致与复杂，要求更为严格，而且所用的试剂及配方也不尽相同。

（一）取材

取材是电镜标本制备的第一个关键环节。

取材是否正确与制备出来的样品能否符合观察要求直接相关。

由于生物体内代谢非常迅速，生物组织离体后，细胞将会释放出各种水解酶引起细胞自溶，细胞内部发生微细的结构变化。

这些微细的改变在光镜下也许无法察觉，在电镜下则会呈现为明显的变化。

因此，取材应注意以下几点：

①在冷板上分离切取组织，动作应迅速，尽快使组织浸入4°C固定液中，从而最大程度地保存组织在生活状态时的结构；②组织块大小不超过1mm3；③取样时所用的器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤；④肾活检超微结构观察主要是肾小球，应取肾皮质部位的组织，含肾小球1~3个，因组织块不能太大，应取3~4块，以避免未取到肾小球，影响观察。

（二）固定、脱水和包埋

固定是制样过程中最关键的一步。

它的失败将导致整个制样过程的后续步骤完全无效。

固定是终止组织细胞的生化过程，同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内，并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏。

可供选择使用的固定剂种类和固定方法及方式很多，它们各自有其优缺点。

判断固定良好的标准见表3-10-4。

目前肾活检组织常用的固定方法是化学固定法，浸泡方式固定，采用戊二醛和四氧化锇双重固定。

1.常用的固定剂和包埋剂

（1）戊二醛（glutaraldehyde）：

戊二醛是一种五碳醛，含有两个醛基。

分子式为C5H8O2，分子量为100。

电镜固定通常采用电镜专用的25％戊二醛水溶液稀释成需要的浓度。

其pH为4.0~5.0。

氧气、高温、中性或碱性pH均能使戊二醛发生聚合失去醛基，并降低交联效力，所以平时这种原液应在低温保存。

此外，戊二醛存放时间过长时，pH值会降低，颜色变黄，固定效力也大大降低，若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其他杂质时，必须纯化后才能使用。

戊二醛对皮肤有硬化作用，但它的挥发性较甲醛弱，最好能在通风橱中操作。

戊二醛优点：

在固定剂中它与蛋白质的交联能力最好，也能固定糖原和核酸，对细胞内的微管和一些酶的活性保存较好，是保存精细结构最好的醛；反应速度快，是优良的前固定剂，渗透速度比四氧化锇快；能弥补四氧化锇的不足，对糖原、核酸，尤其是对微管、内质网和细胞基质固定效果较好；戊二醛前固定的样品不易变脆，可以长时间固定（但