纸层析法分离氨基酸实验报告.docx
《纸层析法分离氨基酸实验报告.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《纸层析法分离氨基酸实验报告.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
纸层析法分离氨基酸实验报告
纸层析法分离氨基酸实验报告
LT
（3）在饲料添加剂行业的应用
（4）在化妆品行业的应用
（5）在农业上的应用
（6）在其他行业的应用
氨基酸工业还有着广阔的发展前景:
（1）传统的氨基酸生产方法
（2）运用基因工程手段生产氨基酸
（3）大力发展药用中间体,具体为:
①氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体
②非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料
③生产高附加值的非天然氨基酸
二、实验目的
1.掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量）。
2.学习未知样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析的方法。
三、实验原理
1.纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。
滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。
当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。
2.溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示：
3.Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
4.在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨基酸。
四、实验试剂和器材
实验试剂：
1.氨基酸标准液（1mg/mL）
亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。
2.80%甲酸
3.0.1%茚三酮丙酮溶液
4.氨基酸混合液（每种氨基酸500mg/mL）
5.正丁醇
实验器材：
1.新华滤纸
2.培养皿
3.电热鼓风干燥箱
4.吹风机
5.毛细管
6.针、线、尺。
7.钟罩（高约430mm,直径约290mm，具磨口塞）
五、操作步骤
标准氨基酸纸上层析
单向上行层析
氨基酸Rf值的测定
1.滤纸：
选用国产新华1号滤纸，6cm×7cm。
在距滤纸2cm处划线，用铅笔在线上标上四个点作为点样位子（留出缝线空间）。
2.点样：
①点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清；
②用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出；
③点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果；
④将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。
注意缝线处纸的两边不要接触。
避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。
3.将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内（注意滤纸不要碰皿壁），当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置。
4.显色：
待展层基本结束后,置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。
5.Rf值的计算：
用尺测量显色斑点的中心与原点（点样中心）之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。
计算出3种氨基酸在酸系统中的Rf值，判断待测样组成。
酸溶剂系统：
正丁醇：
80%甲酸：
水=15:
3:
2（体积比），茚三酮2ml。
温度25℃，时间1h。
六、实验结果
亮氨酸
甘氨酸
脯氨酸
待测氨基酸
原点到层析斑点中心的距离
6.05
2.90
3.49
2.61
3.74
6.47
原点到溶剂前沿的距离
7.24
7.24
7.24
7.24
Rf
0.84
0.40
0.48
0.36
0.52
0.89
判断待测氨基酸
亮氨酸
甘氨酸
脯氨酸
甘氨酸
脯氨酸
亮氨酸
理论Rf
0.79
0.30
0.48
七、注意事项
1.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴；
2.为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果；
3.将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内时，注意滤纸不要碰皿壁；
4.使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀；
5.点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清；
6.使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。
显色时它也呈现紫色斑点。
污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。
同时也要防止空气中的氨；
7.展层展开时切勿是样品点浸入溶剂中。
八、思考题
1.为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统？
答：
这是根据Nernst在1891年提出的分配定律：
一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数，即分配系数（Kd）。
Kd=Ca/CbCa和Cb是互不相溶的两相，即A相和B相的浓度。
这里的两相可以使固相、液相和气相。
意思就是溶质在A和B两种溶剂组成的混合溶剂里分配时，分配比是恒定的。
2.酸性溶剂系统（或碱性溶剂系统）对氨基酸极性基团的解离有何影响?
答：
酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷。
3.酸性溶剂系统（或碱性溶剂系统）对碱性氨基酸（赖、精、组）和酸性氨基酸（天冬、谷）的Rf值有什么影响?
答：
酸性溶剂系统对碱性氨基酸的溶解性加强，在层析过程中易溶于流动相。
所以跑得比较快，因此Rf值增大。
反之，碱性性溶剂系统中酸性氨基酸Rf值增大。
4.什么是分配系数？
答：
分配系数是指一定温度下，处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。
九、讨论
经过本次利用纸层析法分离氨基酸实验，使我较为熟练的掌握了利用纸层析法分离氨基酸的具体流程及方法，并且了解了其工作原理，这对于以后的学习是有很大帮助的。
经查阅资料得，亮氨酸的理论Rf值为0.79（酸相），脯氨酸的理论Rf值为0.48（酸相），甘氨酸的理论Rf值为0.30（酸相）。
通过比对滤纸上单一氨基酸层析位置、计算出其实验Rf值并查阅资料得知，滤纸上待测氨基酸的种类及具体位置，较为粗略地分离了亮氨酸、脯氨酸及甘氨酸这三种氨基酸。
总体来讲，本次试验三种氨基酸实验Rf值偏小，。
经过分析后，得出几点影响实验结果的因素，如下：
1.点样过程中未在第一滴样品干后再点第二滴；
2.虽用玻璃罩将滤纸罩住，但还是会有些许空气中的氨在其中，影响实验结果；
3.将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内时，滤纸不小心触碰到皿壁，出现虹吸现象；
4.使用新鲜配制的溶剂系统时，并未完全摇匀；
5.使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。
显色时它也呈现紫色斑点。
污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套，但实验操作过程中，并未戴橡皮手套或指套，在制作滤纸筒时手不小心触碰到滤纸内侧面，导致手上的物质沾染到滤纸内侧，影响了实验结果；
综上所述，本次实验的误差主要是由于操作误差导致，，因此在以后的学习实验过程中，会更加着重注意实验前对实验器材完好程度的检查以及实验操作的规范性，严格要求自己，努力做到更好！
升级会员 