氨基酸的薄层层析.docx

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氨基酸的薄层层析

生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：

生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验室规则

1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。

2．进入实验室必须穿白大衣。

严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。

不得高声说话。

严禁拿实验器具开玩笑。

实验室内禁止吸烟、用餐。

3．严格按操作规程进行实验。

实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。

4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。

5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。

6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。

7．注意水、电、试剂的使用安全。

使用易燃易爆物品时应远离火源。

用试管加热时，管口不准对人。

严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。

任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。

8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。

废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。

9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。

实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。

实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。

10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。

值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。

离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。

实验名称

（TitleofExperimetn）

氨基酸的薄层层析

实验日期

（DateofExperiment）

实验地点（LabNo.）

合作者（Partner）

指导老师（Instructor）

总分

（TotalScore）

教师签名（Signature）

批改日期

（Date）

【实验报告第一部分（预习报告内容）：

实验原理、

实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、

实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；

评分（满分30分）：

XX】

实验原理

薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。

由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域，对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。

薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。

本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的Rf值（Rf值详见第一篇第三章第五节），以分离和鉴别混合氨基酸的成分。

氨基酸的显色反应：

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。

实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）

（一）样品

1．氨基酸标准溶液：

（1）0.01mol/L丙氨酸：

称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

（2）0.01mol/L精氨酸：

称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

（3）0.01mol/L甘氨酸：

称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

2．混合氨基酸溶液：

将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。

（二）试剂

1．硅胶G（C.P.）

2．0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：

取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。

3．展开溶剂：

按80:

10:

10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。

4．0.1%茚三酮溶液：

取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。

5．展层-显色剂：

按照10:

1比例（V/V）混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。

（三）仪器及器材

1．层析板（6×15cm）；

2．小烧杯；

3．量筒（10mL）；

4．小尺子；

5．吹风机；

6．毛细玻璃管；

7．层析缸；

8．烘箱。

实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）

（一）实验流程

显色

层析

点样

制板

→→→

（二）操作步骤

1．制板

↓

（1）调浆：

称取硅胶3g，加0.5%的羧甲基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状。

（2）涂布：

取洁净的干燥玻璃板a均匀涂层b。

（3）干燥：

将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h，自然凉干。

（4）活化：

70℃c烘干60分钟。

a.玻璃板要清洁平整，无油污。

b.粘在玻璃板侧面边上的硅胶粉应去掉，否则在层析时会有较强的边缘效应。

c.应逐步加温，温度过高易导致涂层裂开。

2．点样

↓

（1）标记：

用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。

每个样品间相距1cm。

（2）点样：

用毛细管分别吸取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。

加样原点扩散直径不超过2mm。

点样后用电吹风a轻轻吹干，必要时重复加样b。

a.用冷风吹干，避免破坏氨基酸。

最好从玻板背面吹。

b.重复点样时必须等第一点样品干后再点第二点。

3．层析

↓

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线a。

盖好层析缸盖b，上行展层。

当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线。

a.样点不能浸入到溶液中。

b.将层析缸盖涂上凡士林，防止层析液挥发。

4．显色

用热风吹干或在90℃下烘干30min，即可显出各层斑点。

（三）注意事项

1．吸附剂

薄层层析用的吸附剂如氧化铝和硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜，如果颗粒太大，展开时溶剂推进速度太快，分离效果不好。

反之，颗粒太小，展开时太慢，斑点易拖尾，分离效果不好。

2．点样

点样的次数依照样品溶液的浓度而定，样品量太少时，有的成分不易显示，样品量太多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离，点样后的斑点直径一般为0.2cm。

3．避免污染

整个层析过程中，避免用手接触层析板，必要时戴上手套。

【实验报告第二部分（实验记录）：

主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；

实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；

原始实验数据。

评分（满分20分）：

XX】

主要实验条件

见第二部分

实验中观察到的现象

1.点样后，液体成圆圈状扩散

2.层析后，层析液在薄板上缓慢扩散上升

3.烘干后，薄板被层析液浸润部分呈浅黄色，混合氨基酸溶液出现两个斑点，分别对应丙氨酸和精氨酸;丙氨酸、精氨酸、甘氨酸溶液各有一个斑点

混合氨基酸

精

氨

酸

甘

氨

酸

丙氨酸

原始实验数据。

各斑点

色斑中心至样品原点中心距离（a）cm

溶剂前缘至样品原点中心距离（b）cm

丙氨酸

4.25

7.15

甘氨酸

3.60

7.30

精氨酸

2.30

7.20

混合点1

2.30

7.31

混合点2

4.20

7.31

混合点3

平均a值

3.33

溶剂前缘至样品原点中心距离（b）

7.25

3．结果计算与记录

各斑点

Rf值

氨基酸名称

丙氨酸

0.59441

—

甘氨酸

0.49315

—

精氨酸

0.31944

—

混合点1

0.31464

精氨酸

混合点2

0.57455

丙氨酸

混合点3

【实验报告第三部分（结果与讨论）：

结果（定量实验包括计算）：

应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；

讨论：

不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。

结论：

简单扼要，说明本次实验所获得的结果。

（包括思考题）。

评分（满分45分）：

XX】

结果（定量实验包括计算）：

1.丙氨酸、甘氨酸、精氨酸的Rf值分别为0.59441，0.49315，0.31944（距离数据参见上表）。

2.混合氨基酸溶液呈现两种斑点，分别与精氨酸和丙氨酸两种氨基酸相对应。

讨论：

3.本次实验测得的丙氨酸、甘氨酸、精氨酸Rf值分别为0.59441，0.49315，0.31944，与标准值相比有一定误差，误差原因可能是

4.点样力度不均，有些力度较大划出了槽导致扩散不均

5.斑点中心判断不够准确导致误差

6.氨基酸溶液没有达到薄层层析的最适Ph值及最适温度

7.本次实验出现的斑点颜色与预期不同，可能是与茚三酮试剂存放时间长、Ph值不适及有其他颜色副反应等因素有关。

8.不同的氨基酸在层析液中溶解度不同以及吸附剂对其吸附力不同，导致其在薄板上的爬行速度不同，利用氨基酸的这点可以判定混合氨基酸溶液中含有的氨基酸是精氨酸和丙氨酸。

结论：

简单扼要，说明本次实验所获得的结果。

9.本实验通过氨基酸的薄层层析技术分离了混合样品中的两种氨基酸，并测得了三种氨基酸相应的Rf值（丙氨酸、甘氨酸、精氨酸Rf值分别为0.59441，0.49315，0.31944）。

10.本实验确定了混合氨基酸溶液中含有精氨酸和丙氨酸两种氨基酸。

11.吸附剂对三种氨基酸的吸附力大小排序为：

精氨酸>甘氨酸>丙氨酸

课后思考题

1、硅胶的吸附力与含水量的问题

硅胶是亲水性吸附剂，表面有许多多孔性微粒，水分子能与硅胶表面的孔穴结合而使硅胶失去活性，因此，硅胶含水量越高则其吸附力越弱。

2、吸附实验中吸附剂的选择根据

吸附剂的选择主要是针对不同结构的物质能够产生明显差异的吸附作用，使得在吸附过程中不同物质在吸附剂上的距离不同而得以鉴别。

而且在整个过程中，吸附剂不能和样品发生反应，这就要求吸附剂化学性质和物理性质都比较稳定。

3、氨基酸纸层析与薄层层析，两者有何区别

纸层析法是一种以滤纸作为支持物的分配层析法，与薄层层析的操作方法基本一致，只是少了一个铺板的过程。

纸层析法所用的滤纸和水有较强的亲和力，与有机溶剂的亲和力较差，故在纸层析过程中水是固定相，而有机溶剂是流动相。