DNA的复制机制.docx

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DNA的复制机制

DNA 的复制机制

所有的生物体在每个细胞分裂之前必须以非同寻常的准确度复制其 DNA。

在这一部分，我们将

探索生物体内一个精巧的“复制机器”在以 1000 个核苷酸每秒的速度复制 DNA 的同时，是如

何达到这一准确度的。

碱基配对是 DNA 复制和 DNA 修复的基础

第一章已经简单讨论过，DNA 模板化是一条 DNA 链（或选定的部分）的核苷酸序列通过碱基

互补配对（A 与 T，G 与 C）被拷贝出一条互补的 DNA 序列（Figure 5-2）。

该过程需要 DNA 模

板链中每个核苷酸被一个自由的（未聚合的）互补核苷酸识别，而且要求 DNA 螺旋的两条链被

分开。

这一分开，使得每个 DNA 碱基上的氢键的供体或受体基团暴露出来，以便和进来的合适

的自由核苷酸配对，为其酶催化聚合为一条新 DNA 链校准。

Figure 5-2DNA 双螺旋作为自身复制的模板。

 因为核苷酸 A 只能和 T 成功配对，G 之和 C，

所以 DNA 的每条链都作为一个模板通过碱基配对来指定其互补链的核苷酸序列。

这样，一个双

螺旋 DNA 分子可被精确复制。

第一个聚合核苷酸的酶，DNA 聚合酶发现与 1957 年。

作为该酶底物的自由核苷酸是三磷酸脱

氧核糖核苷，它们聚合为 DNA 要求一个单链模板。

这一反应的逐步机制在 Figures5-3 和 5-4

中说明。

Figure 5-3DNA 的合成化学

一个脱氧核糖核苷酸被加到一条多聚核苷

酸链（引物链）的 3‘端是 DNA 合成的基

础反应。

如图所示，一个新来的三磷酸脱氧

核糖核苷和一条存在的 DNA 链（模板链）

进行碱基配对，引导新 DNA 链的形成，并

且使之有一条互补核苷酸序列。

Figure 5-4 由 DNA 聚合酶催化的 DNA 合成

（A）如图所示，DNA 聚合酶催化一个脱氧核糖核苷酸向一条多聚核苷酸链（引物链，已和另

一模板链配对）的 3‘-OH 端的逐步添加。

新合成的 DNA 链因此是以 5‘-3’的方向聚合的，

正如前一幅图所示。

因为每个新来的三磷酸脱氧核糖核苷必须和模板链配对以被 DNA 聚合酶识

别，模板链决定了哪种脱氧核糖核苷酸（A,T,C,或者 G）将被添加。

焦磷酸盐的释放及其后续水

解为两个无机磷酸盐分子导致巨大的有利的自由能改变，驱动了脱氧核苷酸的添加反应。

（ B）

一个由 X-线晶体学确定的大肠杆菌 DNA 聚合酶分子结构。

通俗的讲，它就像一只右手，手掌

手指和大拇指握住 DNA。

该图示例的是一个在 DNA 修复时起作用的 DNA 聚合酶，但是复制

DNA 的酶有相似的特征。

DNA 复制叉非对称

在细胞内 DNA 复制期间，每条旧 DNA 链都作为形成一条完整新链的模板。

因为一个分裂细胞

的两个子细胞都遗传了包含旧链和新链的新 DNA 双螺旋（Figure 5-5 ），该 DNA 双螺旋据说

是被 DNA 聚合酶半保留复制。

这一任务是如何完成的呢？

Figure 5-5 DNA 复制的半保留性质

在一轮复制中，DNA 的每条链都用左形成互补链的模板。

原始

链因此经历很多代而完好无损。

1960 年代早期对完全复制的染色体进行的分析发现，一个局部的复制区域沿母 DNA 双螺旋向

前移动。

因其 Y 形结构该活跃区域被称为复制叉（Figure5-6）在复制叉处，两条新的子链被一

个包含 DNA 聚合酶在内的多酶复合物合成。

Figure 5-6 在一个环形染色体上两个复制叉朝

相反方向移动。

一个活跃的 DNA 复制区域沿正在复制的 DNA 分

子向前移动，形成一个 Y 形 DNA 结构即复制叉：

Y 的两条臂是两个子 DNA 分子，Y 的茎是母 DNA

螺旋。

图中，母链为橙色；新合成的链为红色。

DNA 合成中不存在 3‘-5’的 DNA 聚合，只有 5‘-3’。

Figure5-7 一种不正确的 DNA 复制模

型。

虽然看起来像是最简单的 DNA 复制

模型，这里所示例的机制并非细胞使用

的。

在这个方案中，两条子 DNA 链都连

续增长，利用两个末端磷酸（图中发红光

黄圈所示）水解的能量在每条链上添加下

一个核苷酸。

这就要求链既以 5‘-3’方向增长也以 3‘-5’方向增长。

催化 3‘-5’方向的核

苷酸聚合的酶尚未发现。

那么，3‘-5’方向的总体链增长是如何实现的呢？

答案是冈崎片段——复制叉处短暂存在的

1000-2000 个核苷酸长度的 DNA 碎片（真核生物中也有相似的复制中介，长度只有 100-200

个核苷酸）。

冈崎片段只以 5‘-3’链方向被聚合而成，合成以后被连接在一起形成连续的长

DNA 链。

复制叉因此具有一个不对成的结构（Figure 5-8）. 被连续合成的子链叫前导链，其合成稍微领

先于另一条非连续的合成子链，即后随链。

后随链的核苷酸聚合方向和 DNA 链的总体增长方向

相反。

后随链合成之所以要延迟，是因为必须等待前导链将合成冈崎片段的模板链暴露出来。

后

随链通过一种不连续的“后缝”机制合成意味着 DNA 复制只需要 5‘-3’类型的 DNA 聚合酶。

Figure 5-8 DNA 复制叉结构。

 因为两条 DNA 子链都以 5‘-3’方向聚合，后随链上的 DNA

合成开始时必须被做成一系列短的 DNA 分子，称为冈崎片段。

DNA 复制的高保真要求几种校对机制

正如本章开始所述，复制期间拷贝 DNA 的保真度为每 109 个拷贝的核苷酸中大约有 1 个错误。

基于碱基互补配对的准确度，这一保真度比预期要高得多。

标准的互补碱基配对对并非唯一的互

补配对形式，比如，在螺旋几何中一些小的变化，DNA 中 G 和 T 之间即可形成两个氢键。

另外，

四种 DNA 碱基会短暂出现稀少的互变异构体形式，比例为 1 比 104 或 105.这些互变异构形式不

改变螺旋几何即可发生错配：

例如，C 稀少的互变异构形式与 A 相配，而不是和 G。

当新来的三磷酸脱氧核糖核苷和 DNA 模板发生错配时，如果 DNA 聚合酶不做什么特殊的事，

这个错误的核苷酸就会被包含在新 DNA 链中，产生频繁的变异。

DNA 复制的高保真度不仅依

靠互补配对，还依靠几种校对机制顺序执行以修正任何可能已经出现的初始错配。

第一个校对步骤，由 DNA 聚合酶在新核苷酸被加在增长链上之前执行。

首先正确的核苷酸比不

正确的核苷酸对移动的聚合酶有更高的亲和力，因为只有正确的核苷酸睬可和模板正确配对。

此

外，核苷酸键联之后，共价地添加到增长链上之前，DNA 聚合酶必须进行一次构象改变。

一个

不正确的核苷酸比正确的核苷酸更有可能在这一步脱离。

这一步因此让聚合酶在催化添加核苷酸

之前两次检查准确的碱基配对几何。

下一步错误修正反应，核酸外切校对. DNA 聚合酶不能通过连接两个三磷酸脱氧核糖核苷来开

始一条新多聚核苷酸链，而是绝对要求一条引物链已碱基配对的 3‘-OH 端来进一步添加核苷

酸（见 Figure 5-4）。

所以如果引物链 3’-OH 端的核苷酸错配了，DNA 聚合酶就不能延伸这

样一条链。

DNA 聚合酶分子在一个分开的催化位点（根据具体的聚合酶，在该聚合酶分子的一

个分开的子单元或者分开的域里面）处理错配的引物链。

进行校对的核酸外切酶沿 3‘-5‘方向

切除掉引物链 3’端任何未配对残基，直到足够的核苷酸被移除，重新生成了一个碱基配对的 3

‘-OH 端，可引导 DNA 合成。

这样，DNA 聚合酶又作为一个“自我修正”酶，沿 DNA 移动

时移除掉自己的聚合错误（Figures 5-9 和 5-10）

Figure 5-9 DNA 聚合酶在 DNA 复制期间的核酸外切校对。

在本例中，错配是因为包含了一个稀有的短暂的 C 碱基互变异

构体形式（星号所示）。

同样的校对机制适用于在 3‘-OH 端

的任何其他错误包含的核苷酸。

Figure 5-10 DNA 聚合酶和 DNA 模板络合物在聚合模式（A

左和编辑模式（右）下的结构略图。

E 为核酸外切反应的催化

位点，P 为聚合反应的催化位点。

对完美配对的引物终端的要求对于 DNA 的自我修正性质是很

重要的。

DNA 聚合酶在没有引物的情况下开始合成，要完全正确区分配对的和未配对的 3‘-OH

端，很明显不可能.相反，基因转录中的 RNA 聚合酶不需要有效的核酸外切校对：

RNA 中的错

误把不会传给下一代，偶尔的缺陷 RNA 分子无长期影响。

因此 RNA 聚合酶可以无需引物即开

始合成.

在 RNA 合成以及单独的 mRNA 翻译过程中，都发现了大约 1/104的错误频率。

这一水平比 DNA

复制的错误率高 100，000 倍。

是一系列校对过程使得 DNA 复制过程相当的准确（table 5-1）。

table 5-1 促进 DNA 高保真合成的三部曲。

第三部，链指导错配修复，本章后续将介绍。

链指导错配修复系统移除复制错误移除从复制机器逃脱的

错误

正如前面所述，细菌如大肠杆菌能够每 30 分钟分裂一次，使得从大量菌株中筛选找出一个稀有

的在某一特定过程中发生改变的变种细胞相对容易。

一个有趣的变种类型，包含了所谓增变基因

中的改变，增变基因大大增大了自发突变率，即使在它们未激活时。

并不奇怪的是，一个这样的

变种所产生的的 3‘-5’校对核酸外切酶（DNA 聚合酶的一部分，见 Figures 5-9 和 5-10）是

有缺陷的形式。

当 3‘-‘5’的核酸外切酶校对有缺陷时，DNA 聚合酶不再有效率地校对，许

多本来可以被移除的错误在 DNA 中累积起来。

对其他非正常高变异率的大肠杆菌变种的研究发现了另一种校对系统，该校对系统移除由 DNA

聚合酶产生而被校对核酸外切酶错过的错误。

链指导错配修复系统，检测 DNA 螺旋中由于非互

补碱基对不匹配而造成的潜在的扭曲。

但是如果该校对系统仅仅识别新复制的 DNA 中的错配，

随机修正两个错配核苷酸中的一个，就可能错误地修正原始模板链来匹配错误，因而不能降低总

体错误率。

为了有效，这样一个校对系统必须能够区分和移除新合成链上的错配核苷酸，新合成

的链才是错误发生的地方。

大肠杆菌中的错配校对系统所使用的链区分机制是依靠 DNA 中 GATC 序列中 A 残基的甲基化。

唯一未被甲基化的 GATC 序列位于紧随复制叉后面的新链中。

新链和旧链的识别就是通过未被

甲基化的 GATC 的识别来实现的。

链指导错配修复的三步过程包括：

错配的识别，从新链中切

除包含错误的 DNA 片段，以旧链为模板重新合成被切除的片段——从而移除了错配。

链指导错

配修复系统减少了 DNA 复制期间的错误数量，见 table 5-1.

真核生物中，在错配位点区分新链和模板母链的机制不是依靠 DNA 甲基化。

事实上，有些真核

生物——包括酵母和果蝇——不会甲基化其任何 DNA。

新合成的链具有刻痕，生化专家揭示了

这些刻痕（也被称作单链裂口）在真核生物中为链指导错配修复系统提供了信号，指导其去修复

合适的链（新链）。

Figure 5-23 真核生物中的链指导错配修复模型

（A）The two proteins shown are present in both bacteria and eucaryotic cells:

 MutS binds

specifically to a mismatched base pair , while MutL scans the nearby DNA for a nick. Once a

nick is found, MutL triggers the degradation of the nicked strand all the way back through the

mismatch. Because nicks are largely confined to newly replicated strands in eucaryotes,

replication errors are selectively removed. In bacteria, the mechanism is the same, except that

an additional protein in the complex （MutH） nicks unmethylated （and therefore newly

replicated） GATC sequences, thereby beginning the process illustrated here. （B） The structure

of the MutS protein bound to a DNA mismatch. This protein is a dimer, which grips the DNA

double helix as shown, kinking the DNA at the mismatched base pair. It seems that the MutS

protein scans the DNA for mismatches by testing for sites that can be readily kinked, which are

those without a normal complementary base pair. （B, from G. Obmolova et al., Nature

407:

703–710, 2000. © Macmillan Magazines Ltd.）

只有 5‘-3’方向的 DNA 复制允许有效的错误修正

Figure 5-11An

explanation for the

5′-to-3′ direction of

DNA chain growth

Growth in the 5′-to-3′

direction, shown on the

right, allows the chain to

continue to be

elongated when a

mistake in

polymerization has

been removed by

exonucleolytic

proofreading （see

Figure 5-9）. In contrast,

exonucleolytic

proofreading in the

hypothetical 3′-to-5′

polymerization scheme,

shown on the left, would

block further chain

elongation. For

convenience, only the

primer strand of the DNA double helix is shown.

一种特殊的聚合核苷酸的酶在后随链上合成短 RNA 引物分

子

对于前导链，仅在复制开始时需要一个特殊的引物：

一旦复制叉建立起了， DNA 聚合酶就将持

续地面对一个配好对的链端以添加新核苷酸。

然而，在复制叉的后随链上， DNA 聚合酶每次完

成一条新的冈崎片段（几秒钟），必须在模板链更前方

的位点开始合成一个全新的片段（见 Figure5-8）。

一

个专门的机制产生 DNA 聚合酶所需的碱基配对的引物

链。

该机制包括一种叫 DNA 引物酶的酶，用三磷酸核糖

核苷酸在后随链上合成短的 RNA 引物（Figure 5-12 ）.

在真核生物中，这些引物大约为 10 个核苷酸长度，在后

随链上间隔 100-200 个核苷酸。

Figure 5-12 RNA 引物合成

A schematic view of the reaction catalyzed by DNA primase, the enzyme that synthesizes the

short RNA primers made on the lagging strand using DNA as a template. Unlike DNA

polymerase, this enzyme can start a new polynucleotide chain by joining two nucleoside

triphosphates together. The primase synthesizes a short polynucleotide in the 5′ -to-3′ direction

and then stops, making the 3′ end of this primer a vailable for the DNA polymerase.

因为 DNA 引物包含合适的碱基配对的具有 3‘-OH 端的核苷酸，所以可被 DNA 聚合酶在该端

延长，以开始冈崎片段。

当在 DNA 聚合酶遇到上一个冈崎片段的 RNA 引物时，冈崎片段的合

成即终止。

为了将这些 DNA 片段生成连续的 DNA 链，一个专门的 DNA 修复系统迅速行动，

擦除旧的 RNA 引物，以 DNA 代替之。

最后，一种叫 DNA 连接酶的酶，将新 DNA 片段的 3’

端和上一个片段的 5‘端连接起来（Figures 5-13 和 5-14）。

Figure 5-13The synthesis of one of the many

DNA fragments on the lagging strand

In eucaryotes, RNA primers are made at intervals

spaced by about 200 nucleotides on the lagging

strand, and each RNA primer is approximately 10

nucleotides long. This primer is erased by a special

DNA repair enzyme （an RNAse H） that recognizes an

RNA strand in an RNA/DNA helix and fragments it;

this leaves gaps that are filled in by DNA polymerase

and DNA ligase.

Figure 5-14The reaction catalyzed by DNA ligase

This enzyme seals a broken phosphodiester bond. As shown, DNA ligase uses a molecule of

ATP to activate the 5′ end at the nick （step 1） before forming the new bond （step 2）. In this way,

the energetically unfavorable nick-sealing reaction is driven by being coupled to the

energetically favorable process of ATP hydrolysis.

专门的蛋白质在复制叉前面打开 DNA 双螺旋

为了 DNA 合成的推进，DNA 双螺旋必须在复制叉前面被打开，这样新来的核苷酸才能和模板

链形成碱基对。

DNA 双螺旋在正常条件下非常稳定，试管中必须要接近沸水的温度才能将两条

链分开。

只有当模板链已经从其互补链分离开来而暴露出来时， DNA 聚合酶和 DNA 引物酶才

能拷贝 DNA。

两种蛋白质——DNA 解旋酶和单链 DNA 结合蛋白，帮助打开双螺旋从而为 DNA

聚合酶提供合适的单链 DNA 模板来进行拷贝。

DNA 解旋酶首先和 DNA 单链结合，通过水解 ATP 周期性地改变其自身形状，从而进行机械运

动，即推动自己沿 DNA 单链快速前移，当碰到双螺旋区时，继续前进，以 1000 个核苷酸对每

秒的速度将双螺旋撬开（Figures 5-15 和 5-16）。

Figure 5-15 An assay used to test for DNA

helicase enzymes

A short DNA fragment is annealed to a long DNA single

strand to form a region of DNA double helix. The double

helix is melted as the helicase runs along the DNA

single strand, releasing the short DNA fragment in a

reaction that requires the presence of both the helicase

protein and ATP. The rapid step-wise movement of the

helicase is powered by its ATP hydrolysis

Figure 5-16The structure of a DNA helicase

（A） A schematic diagram of the protein as a hexameric

ring. （B） Schematic diagram showing a DNA replication

fork and helicase to scale. （C） Detailed structure of the

bacteriophage T7 replicative helicase, as determined

by x-ray diffraction. Six identical subunits bind and

hydrolyze ATP in an ordered fashion to propel this

molecule along a DNA single strand that passes through the central hole. Red indicates bound

ATP molecules in the structure.

单链 DNA 结合（SSB）蛋白，非常合作地紧紧结合在暴露出来的 DNA 单链上，而不覆盖其要做模板的碱

基。

这些 SSB 蛋白不能直接打开一个长 DNA 螺旋，但是它们通过稳定