第八章食品中有毒有害物质的测定.docx

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第八章食品中有毒有害物质的测定

第八章食品中有毒有害物质的测定

【学习目标】

1.了解食品中有毒有害物质的影响和危害。

2.熟悉食品中有毒有害物质的检测方法。

3.掌握食品中有毒有害物质的测定原理和操作方法。

第一节农药

食品中普遍存在农药残留，其种类很多，常见的有有机氯农药和有机磷农药类。

此外，在食品中氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、沙蚕毒素类农药残留也占有一定的比例。

由于农药的毒性都很大，有些甚至可以在人体内蓄积，严重危害人体健康。

因此为提高食品的卫生质量，保证食品的安全及人类的健康，应该对食品中的农药残留进行准确测定。

目前许多国家和组织对食品中农药残留的允许量都有了相关的规定，中国对有机氯农药六六六、滴滴涕（DDT）及有机磷农药等在食品中的允许残留量都作出了相关规定。

色谱法（尤其是气相色谱法）被广泛地用于测定食品中农药残留量，这大大地提高了测定的灵敏度和专一性。

而高效液相色谱法对于挥发性或热不稳定性农药残留有很好的分析效果。

一、有机磷农药残留的测定

有机磷农药残留的测定常采用气相色谱法、薄层色谱一酶抑制法等。

以下介绍气相色谱法。

1.原理

该法是将食品中含有残留有机磷农药的样品提取、净化、浓缩后，注入气相色谱仪，气化后于色谱柱内分离，其中的有机磷在火焰光度检测器中的富氢焰上燃烧，以HPO碎片的形式放射出波长526nm的特征辐射，通过滤光片选择后，由光电倍增管接收，转换成电信号，经微电流放大器放大后记录下色谱流出曲线。

通过比较样品与标准样品的峰面积或峰高，计算出样品中有机磷农药残留量。

2.试剂

（1）丙酮。

（2）二氯甲烷。

（3）氯化钠。

（4）无水硫酸钠。

（5）助滤剂10gCelite545。

（6）农药标准品敌敌畏99%、速灭磷顺式60%、反式40%、久效磷99%、甲拌磷98%、巴胺磷99%、二嗪农98%、乙嘧硫磷97%、甲基嘧啶硫磷99%、甲基对硫磷99%、稻瘟净99%、水胺硫磷99%、氧化喹硫磷99%、稻丰散99.6%、甲喹硫磷99.6%、克线磷99.9%、乙硫磷95%、乐果99.0%、喹硫磷98.2%、对连磷99.0%、杀螟硫磷98.5%。

3.仪器

组织捣碎机；粉碎机；旋转蒸发器；气相色谱仪：

附有火焰光度检测器（FPD）

4.测定方法

（1）标准溶液的配制分别准确称取标准品，用二氯甲烷为溶剂，分别配制1.0

的标准贮备液，贮于冰箱（4℃）中。

使用时用二氯甲烷分别稀释成标准使用液。

再根据各农药品种的最小检测限，吸取不同量的标准贮备液，用二氯甲烷稀释成混合标准使用液。

（2）试样制备取粮食样品先经粉碎机粉碎，过20目筛制成粮食试样；对于水果、蔬菜样品，洗净、凉干、剔除非可食部分后制成待分析试样。

（3）提取

①对于水果、蔬菜试样，称取50.00g置于300mL烧杯中，加入50mL的水和100mL丙酮，用组织捣碎机捣碎1〜2min。

匀浆液经铺有两层滤纸和约10gCelite545的布氏漏斗，减压抽滤。

从滤液中分取l00mL，移至500mL分液漏斗中。

②对于谷物样品，称取25.00g谷物试样，置于300mL烧杯中，加入水和l00mL丙酮，以下同上一步骤。

（4）净化向以上两种滤液中，加入10〜15g氯化钠，使呈饱和状态。

猛烈阵摇2〜3min，静置l0min，使丙酮从水相中盐析出来，水相用50mL二氯甲烷振摇2min，再静置分层。

将丙酮与二氯甲烷提取液合并，并经装有20〜30g无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水，滤入250mL圆底烧瓶中。

再以约40mL二氯甲烷分数次洗涤容器和无水硫酸钠，洗涤液也并入烧瓶中。

用旋转蒸发器浓缩至约2mL，浓缩液定量转移至5～25mL容量瓶中，加二氯甲烷定容至刻度。

5.测定

（1）气相色谱条件

色谱柱：

①玻璃柱2.6m×3mm（i.d.），填装涂有4.5%（质量分数）DC200+2.5%（质量分数）OV-17的ChromosorbWAWDMCS（80〜100目）的担体。

②玻璃柱2.6m×3mm（i.d.），填装涂有1.5%（质量分数）DCOE-1的ChromosorbWAWDMCS（80〜100目）。

气体速度：

氮气（N2）50mL/min、氢气（H2）l00mL/min、空气50mL/min。

温度：

柱温240℃、汽化室260℃、检测器270℃。

（2）吸取2〜5

混合标准液及样品净化液，注入色谱仪中，以保留时间定性。

以试样的峰高或峰面积与标准比较定量。

6.结果计算

式中

——

组分有机磷农药的含量，mg/kg

——试样中

组分的峰面积，积分单位

——混合标准液中

组分的峰面积，积分单位

——试样提取液的总体积，mL

——净化用提取液的总体积，mL

——浓缩后的定容体积，mL

——进样体积，mL

——进入色谱仪中的

标准组分的质量，ng

——样品的质量，g

二、有机氯农药残留的测定

样品中有机氯农药经提取、净化与浓缩后，进样气化并由氮气载入色谱柱中进行分离，再进入对负电性强的组分具有较髙检测灵敏度的电子捕获检测器中检测，与标准有机氯农药比较定量。

此法灵敏度、分离效率高、分析速度快，可同时分离鉴定BHC和DDT的各种异构体，适用于土壤、粮食、果蔬、肉、蛋、乳等及其制品中的有机氯农药的测定，为国家标准方法。

1.原理

六六六、滴滴涕属含氯化合物，电负性较强。

电子捕获检测器对于电负性强的化合物具有较高的灵敏度，利用这一特点，可将样品经提取净化后用气相色谱法滴定，与标准比较定量。

在适合的色谱条件下，不同异构体和代谢物可同时分别测定。

2.试剂

（1）丙酮。

（2）乙醚。

（3）95%乙醇。

（4）石油醚（沸程30〜60℃）。

（5）苯。

（6）无水硫酸钠。

（7）草酸钾。

（8）硫酸。

（9）硫酸钠溶液20g/L。

（10）过氯酸+冰乙酸（1+1）。

（11）六六六标准溶液、滴滴涕标准溶液精密称取甲、乙、丙、丁四种六六六异构体，

，

-滴滴涕、滴滴滴、滴滴伊、

，

-滴滴涕（

-666、

-666、

-666%、

—666、

，

-DDT、

，

-DDD、

，

-DDE、

，

-DDT）各l0.0mg，溶于苯，分别移入l00mL容量瓶中，加苯至刻度，混匀，每lmL含农药l00.0

，作为贮备液存于冰箱中。

（12）六六六标准使用液、滴滴涕标准使用液临用时各吸取2.0mL，分别移入10mL容量瓶中，各加苯至刻度，混匀。

每lmL相当于农药20

，此浓度适用于薄层色谱法，用气相色谱时，根据仪器灵敏度还需以己烷稀释至适宜浓度，一般为0.01

/mL。

（13）载体硅藻土，80〜100目，气相色谱用。

（14）固定液OV-17及QF-1。

3.仪器

小型粉碎机；小型绞肉机；分样筛；组织捣碎机；电动振荡器；恒温水浴锅；气相色谱仪；电子捕获检测器。

4.操作

（1）提取

①粮食：

称取20g粉碎后并通过20目筛的样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加l00mL石油醚，于电动振荡器上振荡30min，滤入150mL分液漏斗中，以20〜30mL石油醚分数次洗涤残留。

洗液并入分液漏斗中，以石油醚稀释至l00mL。

②蔬菜、水果：

称取200g样品，置于捣碎机中捣碎1〜2min（若样品含水分少可加一定量的水）。

称取相当于原样50g的匀浆，加l00mL丙酮，振荡lmin，浸泡lh，过滤。

残渣用丙酮洗涤3次，每次10mL，洗涤并入滤液，置于500mL分液漏斗中，加80mL石油醚振摇lmin，加200mL20g/L硫酸钠溶液振摇lmin，静置分层，弃去下层。

将上层石油醚液经盛有约15g无水硫酸钠的漏斗滤入另一分液漏斗中，再以石油醚少量数次洗涤漏斗及其内容物，洗液并入滤液中，并以石油醚稀释至l00mL。

③动物油：

称取5g炼过的样品，溶于250mL石油醚，移入500mL分液漏斗中。

④植物油：

称取10g样品，以250mL石油醚溶解，移入500mL分液漏斗中。

⑤乳与乳制品：

称取100g鲜乳（乳制品取样量按鲜乳折算），移入500mL分液漏斗中，加l00mL乙醇、lg草酸钾，猛烈摇动lmin，加l00mL乙醚，摇匀，加l00mL石油醚，猛摇2min。

静置10min，弃去下层。

将有机溶剂经盛20g无水硫酸钠的漏斗小心缓慢滤入250mL锥形瓶中，再用石油醚少量数次洗涤漏斗及其内容物，洗液并入滤液中，以脂肪提取器或浓缩器蒸除有机溶剂，残渣为黄色透明油状物。

再以石油醚溶解，移入150mL分液漏斗中，以石油醚稀释至l00mL。

⑥蛋与蛋制品：

称取鲜蛋10个，去壳全部混匀。

称取10g（蛋制品取样量按鲜蛋折算），置于250mL具塞锥形瓶中，加l00mL丙酮，在电动振荡器上振荡30min，过滤。

用丙酮洗残渣数次，洗液并入滤液中，用脂肪提取器或浓缩器将丙酮蒸除，在浓缩过程中，溶液变黏稠，常出现泡沫，应小心注意不使其溢出。

将残渣用50mL石油醚移入分液漏斗中，振摇，静置分层。

将下层残渣放于另一分液漏斗中，加20mL石油醚，振摇，静置分层，弃去残渣，合并石油醚，经盛约15g无水硫酸钠的漏斗滤入分液漏斗中，再用石油醚少量数次洗涤漏斗及其内容物，洗液并入滤液中，以石油醚稀释至l00mL。

⑦各种肉类及其他动物组织：

采用如下方法进行提取：

方法一：

称取绞碎混匀的20g样品，置于研钵中，加约80g无水硫酸钠研磨,无水硫酸钠用量以样品研磨后呈粉状为度。

将研磨后的样品和硫酸钠一并移入250mL具塞锥形瓶中，加l00mL石油醚，于电动振荡器上振摇30min。

抽滤，残渣用约l00mL石油醚分数次洗涤，洗液并入滤液中。

将全部滤液用脂肪提取器或浓缩器蒸除石油醚，残渣为油状物。

以石油醚溶解残渣，移入150mL分液漏斗中，以石油醚稀释到l00mL。

方法二：

称取绞碎混匀的20g样品，置于烧杯中，加40mL（1+1）过氯酸-冰醋酸混合液，上面盖表面皿，于80℃的水浴上消化4〜5h。

将上述消化液移入500mL分液漏斗中，以40mL水洗烧杯，洗液并入分液漏斗。

以30mL，20mL，20mL，20mL石油醚（或环己烷）分四次从消化液中提取农药。

合并石油醚（或环己烷）并使之通过一高约4〜5cm的无水硫酸钠小柱，滤入l00mL容量瓶，以少量石油醚（或环己烷）洗小柱，洗液并入容量瓶中，然后稀释至刻度，混匀。

（2）净化

①100mL样品石油醚提取液（动植物油样品除外）中加入10mL硫酸（提取液与硫酸体积比为10：

1）。

振摇数下后，将分液漏斗倒置，打开活塞放气，然后振摇30s，静置分层。

弃去下层溶液，上层溶液由分液漏斗上口倒至另一250mL分液漏斗中，用少许石油醚洗原分液漏斗后，并入250mL分液漏斗中，加100mL20g/L硫酸钠溶液，振摇后静置分层，弃去下层水溶液，用滤纸吸除分液漏斗颈内外的水。

然后将石油醚经盛有无水硫酸钠的漏斗过滤，并以石油醚洗涤盛有无水硫酸钠的漏斗数次。

洗液并入滤液中，以石油醚稀释至一定体积供气相色谱法用，或将全部溶液浓缩至lmL，进行薄层色谱测定。

以上述净化步骤处理过的样液，如在测定时出现干扰，可再以硫酸处理。

②于250mL动、植物油样品石油醚提取液中另加入25mL硫酸。

振摇数下后，将分液漏斗倒置，打开活塞放气，然后振摇30S，静置分层，弃去下层溶液。

再加25mL硫酸，振摇30s，静置分层，弃去下层溶液。

上层溶液由分液漏斗上口倒于另一500mL分液漏斗中，用少许石油醚洗原分液漏斗，洗液并入分液漏斗中，加250mL20g/L硫酸钠溶液，摇匀，静置分层。

弃去下层水溶液，用滤纸吸干分液漏斗颈内外的水，然后将石油醚经盛有约15g无水硫酸钠的漏斗过滤，并以石油醚洗涤盛有无水硫酸钠的漏斗数次。

洗液并入滤液中，以石油醚稀释至一定体积供气相色谱法用，或将全部溶液浓缩至lmL，进行薄层色谱测定。

经上述净化步骤处理过的样液，如在测定时出现干扰，可再以硫酸处理。

（3）色谱条件

氚源电子捕获检测器：

气化室温度190℃，色谱柱温度160℃，检测器温度165℃，载气（氮气）流速60mL/mim，极化电压30V。

Ni63-电子捕获检测器；气化室温度215℃，色谱柱温度195℃，检测器温度225℃，载气（氮气）流速90mL/mim。

色谱柱：

内径3〜4mm，长1.2〜2m的玻璃柱，内装涂以1.5%OV-17R2%QF-1混合固定液的80〜100目硅藻土。

（4）测定电子捕获检测器的线性范围狭窄，为便于定量，选择样品进样时使之适合各组分的线性范围。

根据样品中六六六、滴滴涕存在形式，相应地制备各组分不同浓度的标准溶液，绘制标准曲线，从而计算样品中的含量。

5.结果计算

六六六、滴滴涕及其异构体或代谢物含量按下式计算：

式中

——样品中六六六、滴滴涕及其异构体或代谢物的单一含量，mg/kg

——被测定用样液中六六六、滴滴涕及其异构体或代谢物的单一质量，

——样品的质量，g

——样品净化液体积，mL

——样液进样体积，

三、氨基甲酸酯类农药残留的测定

目前，气相色谱法是检测氨基甲酸酯类农药的主要手段，但由于此类化合物中大多数在高温条件下不稳定，因而这种方法并不理想。

下面介绍粮食样品和蔬菜样品中氨基甲酸酯类农药残留的测定方法。

1.原理

试样中氨基甲酸酯农药用有机溶剂提取，再经液-液分配，微型柱净化等步骤除去干扰物质，用氮磷检测器（FTD）检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

2.试剂

（1）丙酮（重蒸）。

（2）二氯甲烷（重蒸）。

（3）乙酸乙酯（重蒸）。

（4）甲醇（重蒸）。

（5）正己烷（重蒸）。

（6）磷酸。

（7）氯化钠。

（8）无水硫酸钠。

（9）氯化铵。

（10）硅胶60〜80目130℃烘2h，以5%水失活。

（11）助滤剂celite545。

（12）凝结液5g氯化铵+10mL水，用前稀释5倍。

（13）农药标准品速灭威≥99%，异丙威≥99%，仲丁威≥99%，甲萘威≥99%。

（14）农药标准品的配制分别准确称取各农药标准品，用丙酮为溶剂，配制成lmg/mL标准储备液，贮于冰箱中，使用时用丙酮稀释配成单品种的标准使用液。

再根据各农药品种在仪器上的响应情况，吸取不同量的标准储备液，用丙酮稀释成混合标准使用液。

3.仪器

组织捣碎机；离心机；超声波清洗器；旋转蒸发仪；气相色谱仪；附氮磷检测器。

4.试样的制备

取粮食试样以粉碎机粉碎，过20目筛制成粮食试样。

蔬菜擦去表层泥水，取可食部分匀浆制成分析试样。

5.分析步骤

（1）提取

①蔬菜

方法一：

称取10g试样于三角瓶中，加入与试样含水量之和为10g的水和20mL丙酮，振荡30min，抽滤，取20mL滤液于分液漏斗中。

方法二：

称取5g试样（视试样中农药残留量而定），置于50mL离心管中，加入与试样含水量之和为5g的水和l0mL丙酮。

置于超声波清洗器中，超声提取l0min。

在5000r/min转速下离心使蔬菜沉降，用移液管吸出上清液10mL至分液漏斗中。

②粮食：

称取20g试样于三角瓶中，加入5g无水硫酸钠和l00mL丙酮。

振荡提取30min，过滤后取50mL滤液于分液漏斗中。

（2）净化向方法一中加入40mL凝结液和lg助滤剂celite545，或向方法二的分液漏斗中分别加入20mL凝结液和lg助滤剂celite545，轻摇后放置5min，经两层滤纸的布氏漏斗抽滤，并用少量凝结液洗涤分液漏斗和布氏漏斗。

将滤液转移至分液漏斗中，加入3g氯化钠，依次用50，50，30mL二氯甲烷提取，合并三次二氯甲烷提取液，经无水硫酸钠漏斗过滤至浓缩瓶中，在35℃水浴的旋转蒸发仪上浓缩至少量，用氮气吹干。

取下浓缩瓶，加入少量正己烷。

以少许棉花塞住5mL医用注射器出口，lg硅胶以正己烷湿法装柱，敲实，将浓缩瓶中液体倒入，再以少量正己烷+二氯甲烷（9+1）洗涤浓缩瓶，倒入柱中。

依次以4mL正己烷+丙酮（7+3），4mL乙酸乙酯，8mL丙酮+乙酸乙酯（1+1），4mL丙酮+甲醇（1+1）洗柱，汇集全部滤液经旋转蒸发仪45°C水浴浓缩近干，定容至lmL。

向粮食提取液的分液漏斗中加入50mL5%氯化钠溶液，再以50，50，30mL二氯甲烷提取三次，合并二氯甲烷层经无水硫酸钠过滤后，在旋转蒸发仪40℃水浴上浓缩近干，定容至lmL。

（3）测定

①气相色谱参考条件

色谱柱：

BP5或OV-10125m×0.32mm（内径）石英弹性毛细管柱。

气体流速：

氮气：

50mL/min，尾吹气：

（氮气）30mL/min，氢气：

0.5kg/cm2，空气：

0.3kg/cm3。

②色谱分析：

量取l

混合标准溶液及试样净化液注入色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰高或峰面积与标准比较定量。

③温度：

柱温采用程序升温方式

140℃————185℃——————————195°C————235°C————235°C

进样口温度240℃。

6.结果计算

式中

——

组分氨基甲酸酯类农药的含量，mg/kg

——试样中

组分的峰高或峰面积，积分单位

——标准液中

组分的峰面积，积分单位

——标准中

组分的质量，ng

——样品的质量，g

——换算系数，粮食为1/2，蔬菜为2/3

四、拟除虫菊酯类农药残留的测定

食品中拟除虫菊酯农药主要包括溴氰菊酯、氰戊菊酯、二氯苯醚菊酯三类。

我国和世界食品卫生组织对拟除虫菊酯农药残留的允许量都作出了相关规定。

目前用于检测此类农药的方法有薄层色谱法和气相色谱法。

以下介绍气相色谱法。

1.原理

试样中拟除虫菊酯农药用有机溶剂提取，经液-液分配及层析净化除去干扰物质，用电子捕获检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

2.试剂

（1）石油醚沸程60〜90℃，重蒸。

（2）苯（重蒸）。

（3）丙酮（重蒸）。

（4）乙酸乙酯（重蒸）。

（5）无水硫酸钠。

（6）弗罗里硅土层析用，于620℃灼烧4h后备用。

用前140℃烘2h，趁热加5%水灭活。

（7）农药标准品甲氰菊酯≥99%、氯氟氰菊酯≥99%、氯菊酯≥99%、氯氰菊酯≥99%、氰戊菊酯≥99%、溴氰菊酯≥99%。

（8）农药标准品的配制分别准确称取各农药标准品，用苯溶解并配成lmg/mL的储备液，使用时用石油醚稀释配成单品种的标准使用液。

再根据各农药品种在仪器上的响应情况，吸取不同量的标准储备液，用石油醚稀释成混合标准使用液。

3.仪器

气相色谱仪（附电子捕获检测器）；电动振荡器；组织捣碎机；旋转蒸发仪、过滤器具、具塞三角瓶（l00mL）；分液漏斗、层析柱。

4.试样制备

取粮食试样经粮食粉碎机粉碎，过20目筛制成粮食试样。

取蔬菜试样洗净，去掉非可食部分后备用。

5.操作

（1）提取

①粮食试样：

称取10g粮食试样，置于l00mL具塞三角瓶中，加入20mL石油醚，于振荡器上振摇0.5h。

②蔬菜类样品：

称取20g精蔬菜试样。

置于组织捣碎杯中，加入丙酮和石油醚各30mL，于捣碎机上捣碎2min，捣碎液经抽滤，滤液移入250mL分液漏斗中，加入100mL20g/L硫酸钠水溶液，充分摇匀，静置分层，将下层溶液转移到另一250mL分液漏斗中，用20mL石油醚萃取一次，再用20mL石油醚萃取一次，合并三次萃取的石油醚层，过无水硫酸钠层，于旋转蒸发仪上浓缩至10mL。

（2）净化与浓缩

层析柱的制备：

玻璃层析柱中先加入lcm髙无水硫酸钠，再加入5g5%弗罗里硅土，最后加入lcm高无水硫酸钠，轻轻敲实，用20mL石油醚淋洗净化柱，弃去淋洗液，柱面要留有少量的液体。

净化与浓缩：

准确吸取试样提取液2mL，加入已淋洗过的净化柱中，用l00mL石油醚+乙酸乙酯（95+5）洗脱，收集洗脱液于蒸馏瓶中，于旋转蒸发仪上浓缩近干，用少量石油醚多次溶解残渣于刻度离心管中，最终定容至l.0mL供气相色谱分析。

（3）测定用附有电子捕获检测器的气相色谱仪测定。

色谱操作条件如下：

石英弹性毛细管柱，0.25mm（内径）

15m，内涂有OV-101固定液。

气体流速：

氮气：

40mL/min，尾吹气：

60mL/min，分流比1:

50。

温度：

柱温自180℃升至230℃保持30min；检测器、进样温度250℃。

色谱分析：

吸取l

试样液注入气相色谱仪，记录色谱峰的保留时间和峰高。

再吸取l

混合标准溶液进样，记录色谱峰的保留时间和峰高。

根据组分在色谱上的出峰时间与标准组分比较定性：

用外标法与标准组分比较定量。

6.结果计箅

以外标法定量，按下式计算：

式中

——样品中拟除虫菊酯农药残留的含量，mg/kg

——标准品中

组分农药的含量，ng

——试样进样量，

——样品的定容体积，mL

——标准溶液中

组分农药峰高，mm

——试样中

组分农药峰髙，mm

——样品质量，g

——稀释倍数

第二节兽药

兽药残留指给动物使用后蓄积和贮存在细胞、组织和器官内的药物原形、代谢产物和药物杂质。

兽药残留包括兽药在生态环境中的残留和兽药在动物性食品中的残留。

残留毒理学意义较重的兽药，按其用途分类主要包括：

抗生素类、化学合成抗生素类、抗寄生虫药、生长促进剂和杀虫剂。

抗生素和化学合成抗生素统称抗微生物药物，是最主要的兽药添加剂和兽药残留，约占药物添加剂的60%。

食品中兽药残留主要分抗生素残留、硝基呋喃类药物残留、生长促进剂残留3种。

目前兽药残留最常见的分析方法有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法等。

此外，应用速测试剂盒进行兽药残留的检测近年也得到广泛应用。

一、抗生素残留量的测定

利用髙效液相色谱法分析禽肉中抗生素（土霉素、四环素、金霉素）残留，是将样品经提取、微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分离，紫外检测器检测，再与标准比较定量的一种方法。

1.原理试样经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分离，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。

标准加法定量。

2.试剂

（1）乙腈（分析纯）

（2）磷酸二氢钠溶液0.0lmol/L。

称取1.56g（精确至±0.0lg）磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）溶于蒸馏水中，定容到l00mL，经微孔滤膜（0.45

）过滤，备用。

（3）土霉素（OTC）标准溶液称取土霉素0.0l00g（精确到±0.0001g），用0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至l0.00mL，此溶液每lmml含土霉素lmg。

（4）四环素（TC）标准溶液称取四环素0.0l00g（精确到士0.000lg），用0.lmol/L盐酸溶液溶解并定容至10.00mL，此溶液每1ml含四环素lmg。

（5）金霉素（CTC）标准溶液称取金霉素0.0l00g（精确到士0.000lg），用0.lmol/L盐酸溶液溶解并定容至l0.00mL，此溶液每1ml含金霉素lmg。

以上标准品均按1000单位/mg折算。

土霉素标准溶液、四环素标准溶液和金霉素标准溶液应于4℃以下保存，可使用1周。

（6）混合标准溶液取土霉素标准溶液、四环素标准溶液各1.00mL，取金霉素标准溶液2.00mL，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。

此溶液每lml含土霉素、四环素各0.lmg，金霉素0.2mg，临用时现配。

（7）高氯酸溶液50g/L。

3.仪器

高效液相色谱仪（HPLC）:

具紫外检测器。

4.色谱条件

（1）柱ODS_C18（5

）6.2mm

15cm。