第十一章DNA的复制.docx

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第十一章DNA的复制

第十一章DNA的复制、修复和重组

1.Meselson-Stahl实验证明大肠杆菌染色体DNA的复制是半保留的。

有一种“分散”式复制模型假定亲本链被切成随机大小的片断,然后和新合成的子代链连接产生子代双链,在Meselson-stahl实验中,每条链可能含有重链和轻链的随机片断。

解释Meselson-Stahl实验如何排除这种复制模型的可能性。

2.在含有15NH4Cl的介质中生长的大肠杆菌被转移到含14NH4CI的介质培养三代（细胞群体增加8倍）,此时杂合DNA（15N-14N）和轻DNA（14N-14N）的分子比例是多少?

3.大肠杆菌染色体含有4639221个碱基对,（a）在E.coli染色体复制期间多少个DNA螺旋必须解开?

（b）根据本章资料,在37oC时,如果有两个复制叉从原点出发需要多少时间才能完成大肠杆菌染色体DNA复制?

假定复制以每秒1000bP速度进行,而大肠杆菌细胞20min能分裂1次,怎样才能实现这一点?

（c）在复制期间有多少个冈崎片断形成?

如何保证冈崎片断按正常次序组装?

4.已知噬菌体ΦX174一条链的碱基成分是:

A、24.1%;G、24.7%;C、18.5%;T、32.7%,如果提供ΦX174（一种环形DNA分子）互补链的等摩尔混合物作为模板,预计由DNA聚合酶催化合成的全部DNA的碱基组成。

回答这个问题要有什么前提?

5.Kornberg和他的同事用dATP,dTTP,dGTP和dCTP混合物与可溶性大肠杆菌抽提物一起保温,且所有这些脱氧核苷三磷酸都是在α一磷酸基团用32P中标记的。

在保温一段时间之后,保温混合物都用三氯醋酸处理,它沉淀DNA,但不沉淀核苷酸前体。

收集沉淀,测定存在于沉淀中的放射性来确定前体掺人的水平。

（a）如果四种核苷酸前体中的任意一种被省去,沉淀中是否会有放射性?

为什么?

（b）如果只有dTTP是被32P标记的,能否在沉淀中测出放射性?

（c）如果32P被标记在β-或γ-磷酸基团,能否在沉淀中发现放射性?

6.列表比较在大肠杆菌DNA复制中各种前体、酶和其他蛋白质因子在前导链和滞后链合成中的功能。

7.一些大肠杆菌突变体含有DNA连接酶基因突变,当这些突变体用含3H一胸腺嘧啶的培养基培养,产生的DNA用碱性蔗糖梯度作沉降分析,发现出现两个区带,一个出现在高分子量部分,一个在低分子量部分,解释这种现象。

8.在前导链合成期间,什么因素提高复制的精确度?

你估计滞后链合成有相同的精确度吗?

说明原因。

9.在复制时DNA解螺旋影响的超螺旋密度。

在DNA拓扑异构酶不在的时候,复制叉前面的DNA过分超螺旋,而复制叉后面的DNA螺旋不足。

复制叉前面的DNA超螺旋密度如果超过十0.14复制叉将停止前进。

假定一个6000bP的质粒在体外以双向复制而反应体系中没有拓扑异构酶。

质粒原先的σ=-0.06,问在复制叉停止前进以前每个复制叉多少碱基对被解螺旋并复制?

假定每个复制叉运动速度相同,且体系中存在着除了拓扑异构酶以外的所有DNA延长所需的成分。

10.在缺少组氨酸的营养介质中,一薄层琼脂含有109个沙门氏杆菌细胞（组氨酸异养型）

在经过37℃两天的培养产13个自养型菌落。

这些菌落是怎样产生的?

这个实验在有0·4μg,α-氨基蒽存在的情况下被重复1次,两天的培养使自养型突变菌落超过10000,这表明α-氨基蒽有什么性质?

你如何评价它的致癌性?

11.脊椎动物和植物细胞经常甲基化胞嘧啶以形成5一甲基胞嘧啶。

在这些细胞中有专门的修复系统以修复G-T错配恢复G三C配对,这种修复系统对细胞有什么好处?

12.已知由突变造成着色性干皮病（XP）起码有七个不同的人基因突变。

这些突变总是包括参与DNA核苷酸切割修复的基因。

不同类型的XP标记为A-G（XP-A,XP-B,等等）,另几个其他变种记为XP-V。

以正常个体的细胞和来自一些带XP-G病人的细胞培养物用紫外光照射。

然后抽提细胞DNA并变性,产生的单链DNA使用分析超离心进行鉴定。

（a）从正常成纤维细胞在经照射后制备的DNA其平均分子量显著降低,而来自XP-G成纤维细胞没有这种降低,为什么?

（b）如果你认为是核苷酸切割修复起作用,从XP-G病人来的细胞可能在哪一步骤有缺陷?

13.同源遗传重组与位点特异重组在Holliday中间体的形成上有何不同?

14.为什么说DNA的复制为半保留复制而不是全保留复制?

15.紫外线如何损伤DNA分子?

生物体内的修复机制是什么?

16.为什么说DNA的复制方式是半不连续复制?

17.举例说明细菌的基因是如何命名的?

18.DNA酶促合成的基本规律是什么?

19.G4噬菌体基因组是一个小的环型DNA分子。

当E.coli的dnaG基因编码的RNA聚合酶合成后,G4基因组DNA才能复制。

当dnaG基因由于突变合成的RNA聚合酶无活性时,G4噬菌体DNA不能复制,也不能感染E.coli,为什么?

20.假定DNA复制时,可加接的核苷酸是3'-核苷酸而不是5'-核苷酸,DNA聚合酶应具有什么性质才能催化上述反应?

21.DNA聚合酶I缺乏的突变株中DNA的合成正常,但对紫外线照射十分敏感,为什么?

22.一单链环状DNA分子中含有30%的A,20%的T,15%的C和35%的G,若以它为模板合成一互补链,问

1）互补链的碱基组成如何?

2）产生的双链DNA的碱基组成如何?

23.一细菌突变株中DNA复制的速度很低,研究证明,其DNA聚合酶I、聚合酶Ⅲ,DNA

旋转酶,dnaA、dnaB、dnaC和SSB蛋白也正常,复制原点也是正常的,为什么复制速度很低?

24.为什么5-F-U可作为抗癌药物?

它对正常细胞的生长有无影响?

25.DNA聚合酶I、DNA连接酶和拓扑异构酶I（TopI）都能催化磷酸二酯键的形成。

在它们各自催化的连接反应中的底物及除去的基团各是什么?

参考答案

1.如果发生随机的分散式复制,第一子代细胞DNA在CsCl密度梯度离心中将产生位于重DNA和轻DNA区带中间的一条区带;到第二子代也只产生一条位于第一子代DNA带和轻DNA区带之间的区带。

在原Meselson-Stahl实验中,第二子代会产生两条区带（完全轻链带和轻重杂合双链）。

事实证明,“分散式”DNA复制模式是不存在的。

2.经过三代复制,一个细胞变成8个细胞。

但重DNA链只有两条。

因此,半保留复制使杂合链和轻链的比例为2:

6。

3.每10.5bP一螺旋,则4639221÷10.5=442X105（螺旋）

（a）DNA复制时必须解开442×105个螺旋。

（b）在DNA复制中复制叉的移动速度为:

1000nt/s,则DNA在双向复制的情况下,整个染色体所需的复制时间为:

46392215÷（2×1000）=2320s（约40min）。

如果细胞20min分裂1次,DNA复制必须在第一次复制完成之前就开始。

（c）若冈崎片段长1000~2000nt,则整个大肠杆菌染色体DNA复制时有约2320~4640个冈崎片段形成。

由于冈崎片段合成后与模板以碱基配对之间的氢键相连,且经DNA聚合酶去除RNA引物并填补缺口;最后由DNA连接酶连接各冈崎片段,它们就按正确次序被组装成一个新的互补链。

4.如果提供等摩尔混合物的ΦX174DNA的互补链模板经DNA聚合酶合成后,其产物总的碱基组成应是:

A、28.7%;G、21.3%;C、21.3%;T、28.1%;即一链产物链的碱基组成应是:

T、24.7%;C24.1%;G、18.5%;A、32.7%;另一链产物链的碱基组成应是:

A、24.7%;G、24.1%;C18.5%;T、32.7%。

这个答案的前提应是提供的ΦX174DNA为互补的复制型双链DNA。

5.

（a）如果四种核苷酸前体中任意一种被省去,DNA新链的多聚化是不可能。

因此,没有32P中被掺入多核苷酸,故在沉淀中无法检出放射性。

（b）如果只有dTTP是被标记的,沉淀中也能检出放射性。

因为标记的dTTP会被掺入到脱氧腺嘌呤核苷酸残基的互补位置。

（c）如果32P被标记在β-和γ-磷酸基团,在DNA聚合酶催化产生的沉淀中将不会有放

射性。

因为在DNA多聚化过程中,只有α-磷酸基团参与磷酸二酯键的形成而β-和γ-磷酸基团作为焦磷酸基团被释放,因此,不会产生于多核苷酸中。

6.

前导链滞后链

前体dATPdGTPdCTPdTTPATP,GTP,CTP,TTP,dATP,dGTP,dCTP,dTTP

酶DNA旋转酶,解螺旋酶,单链DNA结合蛋白（SSB）,DNA聚合酶Ⅲ,拓扑异构酶,焦磷酸酶DNA旋转酶,解螺旋酶,SSB,DNA聚合酶Ⅲ,拓扑异构酶,焦磷酸酶,引物酶,DNA聚合酶I,DNA连接酶及NAD+

7.连接酶缺陷菌株在DNA复制后,导致滞后链的冈崎片段仍以片段存在。

在对这种DNA样品进行碱性蔗糖密度梯度离心时,变性了的游离冈崎片段出现在低分子量区,前导链是高分子量的;因此出现在高分子量区带。

8.两种因素提高复制精确度。

Watson-Crick碱基配对指导模板链与互补链之间互补的精确性。

DNA聚合酶Ⅲ的3'一5'外切酶校正作用除去错配碱基,这是前导链的情况。

滞后链可能也可以获得相同的精确度,因为这两种因素在滞后链合成期间都存在。

但是由于有更多的不同化学反应发生在滞后链,出错的机会可能比前导键要多一些。

9.此质粒松弛状态的连系数Lk0=6000（bp）/10.5（bp）=571（保留整数）质粒的超螺旋密度是-0.06故它的拓扑连系数应是:

σ（超螺旋密度）=（Lk-Lk0）/Lk0

则Lk=571+（-0.06×571）=537

在没有DNA拓扑酶活性的情况下,DNA复制解螺旋并没有改变质粒的Lk值,而是靠复制叉前面增加超螺旋密度来补偿。

因此,设复制停止前被解开的螺旋数为a,则复制叉前面部分的Lk应为537,故:

（571—a）×（1十0.14）=537,a=100（螺旋）复制停止前被解开的DNA碱基对数=100×10.5=1050（bp）（即约有1050个碱基对被解螺旋）。

10.在缺少组氨酸的营养介质中,天然突变使109个沙门氏杆菌细胞有13个重新获组氨酸合成能力。

当在培养介质中加入0.4μg一氨基蒽时,这种回复突变率增加超过10000个。

这个事实说明α一氨基蒽的补加大大增加了组?

（1000倍）的突变率。

所以这种化合物是一种诱变剂。

由于大部分诱变剂是致癌物,α一氨基蒽应是一种致癌物。

11.胞嘧啶甲基化成5-甲基胞嘧啶是高等生物常见的碱基修饰方式,而且碱基的天然脱氨事件也经常发生（一个哺乳动物基因组每天约100次）。

当5一甲基胞脱氨后产生胸腺嘧啶,即形成G-C配对;如果这种配对不加以修复再经过复制后产物产生由G-C配对变成A-T配对的突变体。

由于这种突变现象相当普遍,因此细胞有专门的G-T错配修复系统是很必要的。

12.（a）正常细胞在紫外光照射后,由于DNA一些相邻胸腺嘧啶碱基形成二聚体,激发细

胞核苷酸切割修复系统中的切割核酸酶在损伤处切去一些核苷酸,故使DNA形成分子量较低的片段。

（b）XP-G病人的细胞可能在核苷酸切割系统中的切割核酸酶基因发生突变,失去切割核酸酶（excinuclease）活力,故其DNA保持完全的长链状态。

13.同源重组期间,Holliday中间体可以形成在两配对同源染色体的任意一个位点。

一旦形成,Holliday的分叉点可以随分叉迁移移动。

在位点特异重组中,Holliday中间体只在两个特异位点之间形成,且不太可能有分叉迁移事件发生。

14.MathewMeselson和FranklinStahl在1957年设计了一个非常出色的实验证明了DNA的复制为半保留复制。

他们把大肠杆菌在含有15N的单一氮源（NH4CI）中培养很多代后转移到仅含14N的培养介质中,使所有细胞增殖一代,从这些第一代细胞制备的DNA仍然在CsCI密度梯度中形成单一的带,但它的密度表明,这些DNA分子是含有一条15N链和一条14N链的杂合双链。

如果让细胞在“轻”介质中增殖两代,所提取的DNA可被CsCI密度梯度平衡超离心分离成两条带,其中一条带是“重”“轻”杂合双链DNA,另一区带DNA则完全是由“轻”链（14N）组成。

这个实验结果证实了DNA复制是半保留的而不是“全保留”的。

所谓“全保留复制”是另一种关于DNA复制模型的假设。

这种假设认为复制产生由新合成的DNA链组成双螺旋分子,而亲本双链得以保留,Meselson-Stahl实验所提供的事实否定了这种假设,因为复制如果是全保留的,则大肠杆菌繁殖一代后,它们的DNA在平衡CsCl密度梯度超离心中一定分离成合15N“重”链带和完全含14N的“轻”链带。

而实验证明,只存在一条杂合DNA带,在DNA被复制两代后只有全“轻”链和杂合链,而没有完全由15N组成的全“重”链。

实验事实只符合半保留制复制机制,而与全保留复制的假设相抵触。

15.通常紫外线可使DNA分子中两个相邻的嘧啶形成环丁烷结构,主要是TT二聚体;使DNA的双螺旋结构破坏,复制和转录功能受到影响。

生物体内的修复机制有:

1）光复活修复可见光激活光复活酶,使TT二聚体结构解聚;

2）暗修复DNA聚合酶可在靠近二聚体处切断DNA,利用互补链为模板进行局部修复合成,同时有5'一核酸外切酶切去二聚体的核甘酸,连接酶将新合成的链与原来的链连接在一起。

16.所有的DNA聚合酶都是以5'一三磷酸脱氧核苷酸为底物,以单链DNA为模板从5'一末端向3'一末端合成,这是DNA聚合酶的催化特性所决定的。

DNA复制时亲本DNA双链是逐步被解开的,两条DNA模板链是反平行的;一条链的走向是5'-3',另一条链的走向是3'一5'。

在后一条模板链上的DNA合成与复制叉移动方向一致,所以可以连续的合成;在另一模板链上DNA的合成与复制叉移动方向相反,所以只能是模板链解开一段,复制进行一段。

于是复制机制是半不连续的。

17.通常细菌的基因是以三个斜体小写字母来命名的。

这些字母反映基因已知的功能。

例如,

dna、uvr和rec基因各自影响DNA复制,对紫外射线损伤的抗性以及重组作用。

如果几个基因影响同一功能,则按照基因的发现先后次序在基因名的三个字母后加A,B,C等以示区别。

18.1）DNA聚合酶催化DNA合成都需要模板,DNA的多聚化反应是按碱基配对的原则由模板DNA链指导下合成的。

2）聚合反应需要引物,引物是互补于模板链的一个寡聚核苷酸片段。

它带有一个游离的3'-OH。

即DNA聚合酶只能把一个核苷酸加接到现存的一条链的末端,而不能独立重新合成一条新链。

已有的实验事实证明,所有DNA聚合酶都需要引物,引物常常是一小段RNA。

19.DNA聚合酶催化的DNA复制必须有RNA引物存在,即DNA聚合酶不能催化从无到有的合成。

引物可以是核糖核苷酸片段,也可以是脱氧核糖核苷酸片段,但必须与DNA模板链有互补关系,且有自由的3'-OH末端。

G4在色体基因组是环形的,DNA聚合酶不可能合成一段与之互补的引物。

Ecoli的dnaG基因编码的RNA聚合酶可合成RNA引物以使G4噬菌体基因组可以复制。

当复制接近RNA引物的5'一端时,引物被水解除去,产生的缺口由DNA聚合酶合成一DNA小片段填充,最后由连接酶催化使DNA的复制完成。

当dnaG基因由于突变合成的RNA聚合酶无活性时,因不能合成RNA引物,所以G4噬菌体DNA不能复制,也不能感染E.coli。

20.DNA聚合酶阅读的模板链的方向应为5'一3'。

新的DNA链合成的方向应为3'一5'。

在这些条件下,加接的核苷酸是加在自由的5'-OH上。

此外,DNA聚合酶Ⅲ应具有5'一3'的外切酶活力而不是3'一5'的外切酶活力去校正错配的核苷酸。

DNA聚合酶I有两种外切酶活力,它的3'一5'外切酶活力在切除引物等修复过程中起作用。

21.因突变株中DNA聚合酶Ⅲ有正常的催化能力,它是DNA复制中的主要酶。

缺乏DNA聚合酶I的突变株对紫外线敏感,说明DNA聚合酶I在DNA损伤修复系统中起重要的作用。

22.

1）互补链应合有30%的T,20%的A,15%的G和35%的C。

2）双链DNA的减基组成是两条单链成基组成的平均值,即A、T、C和G各占25%。

因为A-T碱基对的总和是30%+20%=50%,G-C碱基对的总合是15%+35%=50%

23.可能是引物酶的话性异常。

因DNA的复制必须先合成RNA引物。

24.因它是胸腺嘧啶核苷酸合成酶的抑制剂,使细胞中dTTP的合成受到影响,因而影响了DNA的合成及细胞的分化。

它对正常细胞也有影响,但由于肿瘤细胞的分化比正常细胞要快得多,通过控制使用的剂量可达到只抑制肿瘤细胞而对正常细胞不影响或只有轻微的影响的目的。

25.DNA聚合酶I的底物是dNTPS,被除去的基团是PPi。

DNA连接酶催化DNA链内相邻核苷酸单链切口的3'-OH和5'一磷酸基之间形成磷酸二酯键。

该酶催化的反应中,需要

ATP或NAD+提供一个AMP,先形成DNA连接酶一AMP共价复合物使AMP被激活,激活的AMP转移到DNA链的5'一磷酸末端上形成DNA-AMP复合物。

最后,另一条DNA链的3'-OH亲核攻击5'一末端形成磷酸二酯键,在这个过程中除去的基团是AMP;拓扑异构酶I用DNA一拓扑异构酶中间物,酪氨酰是被除去的部分。