五分类血球仪检测原理.docx

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五分类血球仪检测原理

MEK7222/8222白细胞分类的测定原理

MEK-7222/8222，计数原理是wbc/rbc/plt电阻法，分类是使白细胞通过鞘流进入鞘流池内，然后通过检测对白细胞照射时发生的散射光，对白细胞进行分类。

这些散射光，依照血细胞的容积、血细胞的复杂性（有无颗粒、核的构造等）的不同，光的强度和方向有所不同，因此，通过以激光直进方向和同方向小角度的散射光（以下称为Size）、激光直进方向和同方向大角度的散射光（以下成为Complexity）、与激光直进方向相对垂直的方向的散射光（以下称为Granularity）为参数的散点图，能够对淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞进行分类。

另外，Size表示血细胞的大小、Complexity表示血细胞的复杂度、Granularity表示血细胞的颗粒的程度。

这种方式提供了三个散射图，MAIN散点图NE-EO散点图MO-BA散点图

NeutrophilCount（嗜中性白细胞）

NEC

LymphocytoCount（淋巴细胞）

LYC

MonocytoCount（单核细胞）

MOC

EosinophilCount（嗜酸性白细胞）

EOC

BasophilCount（嗜碱性白细胞）

BAC

散点图有以下三种。

纵轴是Size、横轴是Complexity的散点图（以下称为S-C散点图）；纵轴是Size、横轴是Granularity的单核细胞/嗜碱性白细胞分类用散点图（以下称为MO-BA分类用散点图）；纵轴是Size、横轴是Granularity的嗜中性白细胞/嗜酸性白细胞分类用散点图（以下称为NE-EO分类用散点图）。

淋巴细胞散布在S-C散点图的LY区域。

单核细胞及嗜碱性白细胞散布在S-C散点图的MO-BA区域。

进一步展开到MO-BA分类用散点图时，那么单核细胞散布在MO区域，嗜碱性白细胞散布在BA区域。

嗜中性白细胞及嗜酸性白细胞散布在S-C散点图的NE-EO区域，进一步展开到NE-EO分类用散点图时，嗜中性白细胞散布在NE区域，而嗜酸性白细胞散布在EO区域。

通俗的说法是，那个分类原理只有三个角度，国内的介绍材料上说是4角度，这纯属误导，是把激光直射也算上了，在mek的官方材料上全然没有那个说法。

在主散射图上确实是淋巴lym，单核和嗜碱通道mo+ba,中性和嗜酸通道ne+eo,确实是说在小角度光散射确信了体积的情形下结合大角度光散射能够测出的分群只有三个，其中淋巴是确信的。

在mo+ba散射图上，清楚的分出了单核和嗜碱，确实是说在小角度光散射确信了细胞体积的基础上，结合垂直角度光散射能够区分出两个分群，单核和嗜碱都是确信的，还有一个附属分类确实是lic,即庞大不成熟细胞或被称作为淋巴影子细胞，在那个仪器上并非单独出示lic数据。

在ne+eo散射图上，清楚的分出了中性和嗜酸，确实是说在小角度光散射确信了细胞体积的基础上，结合垂直角度光散射能够区分出两个分群，中性和嗜酸都是确信的。

可是要说明是，我个人以为这五项分类当中有一项为哪一项计算出来的，而且，那个仪器在激光部份失灵或五分类无法工作的情形下，应该能够充当三分类利用，因为wbc有着单独的计数通道，而且也显现wbc直方图，因此，有了直方图通过软件就能够够进行分类的，可是官方没有具体的说法。

ABXPENTRA计数分类测定方式及原理：

一、RBC/PLT:

电阻法WBC/BAS计数：

电阻法，由于采纳不同溶解技术，WBC和BAS被一同计数出来，利用界标线进行判别，提供BAS直方图和WBC,BAS#%数值。

上图确实是不同溶解以后取得的直方图，WBC总数确实是图中WBC和BAS部份的总和，在BAS区域中由于数值很少，因此常常是空白，这时由于针式打印机无法细腻的打印出来的结果，如以下图：

4、双鞘流（DHSS）分类计数，整个进程如下，血液标本进入LMNE混合池试剂混合形成混合溶液，孵育时刻为12秒，这时RBC/PLT/BAS细胞已经被试剂破坏掉，在鞘流泵作用下进鞘流池进行双鞘流计数，第一通过红宝石孔进行电阻法计数，判定细胞体积，然后在200ms之内通过鞘流直径为42um的鞘流通道进行光吸收测定判定细胞内容物，整个计数时刻为12秒。

如此形成份类散射图，并提供lym,gra,mon,eo,lic,aly的绝对值和百分比。

双鞘流计数是abx的专利技术，详细原理如下：

依照上图能够看到，在进行双鞘流计数的时候，第一进行的是鞘流电阻计数，对细胞进行体积测定，然后再进行光吸收比率测定，对细胞内容物进行测定，最终将那个细胞在散射涂上标注出来，在双鞘流的上下两头别离加上恒流电源，以保证电阻法测量，孵育后的溶液在右边鞘流泵的作用下通过6号口进入鞘流池从1号口流出，为了保证这些检测细胞能够正确的通过计数孔和鞘流通道，需要利用外来鞘流来进行矫正，如此，在5，7号口通过左侧鞘流泵注入稀释液来形成第一股鞘流，爱惜所测混合溶液能够直接通过计数孔而且保证其不发生偏移和扭曲，保证结果准确，混合溶液通过计数孔后，2，4口通过中间鞘流泵注入稀释液形成第二股鞘流，来保证吸光度测量的正常。

五、图形及其界标范围的设定：

分类图形及界标设定

上图是一个标准的分类散射图的样本，清楚的标明了各个细胞形态所处的范围和位置。

因此，PENTRA的双鞘流能够明白得为电阻法加光吸收度测定，电阻法类似上面所讲的小角度激光测定体积，光吸收度测定确实是测定形态，依照细胞染色原理，不同的白细胞染色后，细胞质和细胞核所形成的颜色不同，那么测定其通过去的光的波长能够明白其本身的颜色，因此这种方式一经问世，当即引发全世界范围的关注，专门是库尔特，库尔特以为这种方式如此简单本钱和实现起来均好于库尔特本身的VCS技术，因此洽谈购买，可是ABX宁可自己实现起来结构不尽合理也不肯意出卖，因此就有了两边妥协的产物BACKMAN-COULTERACT5DIFF那个OEMABX的五分类产品。

在这一个电阻体积，一个吸光度测定的实现中，成功的分出了4项分群，LMNE既淋巴、单核、中性和嗜酸，而且还有两个附属分群，LIC和ALY既庞大不成熟细胞和异样淋巴细胞，在仪器状态良好和试剂过关的情形下，这6项分群及提示靠得住性极高；由于细胞染色后单核和嗜碱很难被区分，因此，就有了前面的不同溶解技术的WBC总数和BASO的电阻法分群，因此以前的PENTRA宣传材料上有7分类之说，后来有些不严谨和炒作之嫌，改回此刻的5+2分群宣传。

顺便提一下，仅WBC分类图形是由一个散射图和一个直方图来实现的，若是加上RET的话，会增加三个散射图并增加一个水平90度的光散同意，这是单独给RET的。

SYSMEX的计数分类原理以XT1800/2000为例

RBC/PLT计数采纳电阻法。

LMNE和WBC/BASO均采纳激光鞘流测定方式，下面说明这种方式，

上图是测试原理图示，官方的说明如下：

在小角度散射光测定中，能够取得细胞的体积（外径），作为散射光，并非从一点开始，而是细胞的全部，必然角度的散射光会重合，而另一部份没有重合的相对信号较弱，因此重合的散射光能够取得很强的信噪比，从而取得细胞体积的信息，通过反复实验，入射角度在1-6度为最正确，因为小细胞碰到的光散射小，大细胞散射光多，因此来区分的。

在大角度散射光测定中，光线照射在细胞核上发生散射，在必然角度下能够测的细胞核的信息，因此选定8-20度最正确角度能够取得细胞核信号的最正确信噪比，淋巴单核的细胞核较小，因此取得较少的散射光，中性粒细胞的细胞核比较大也比较多，因此取得的光散射也较多，因此来区分。

以上是小角度散射光的图示

以上是大角度光散射的图示

在xt1800/2000的机械中，不算RET能够取得2个散射图，并同时取得5项分群的全数参数。

在DIFF散射图当中能够取得LMNE四个分群，在WBC/BASO的散射图当中能够取得BASO的分群。

上图确实是SYSMEX的WBC分群散射图

COULTER五分类测试原理和分类实现

COULTER的RBC/PLT/WBC总数仍然采纳电阻法

WBC分类方面采纳VCS技术

Coulter公司设计在单一通道上同时用这三种方式对同一白细胞进行测量，幸免了有些血液分析仪要设计好几个通道或加染色试剂的麻烦。

很显然，有些细胞，如嗜中性与嗜酸性细胞，假设单用一两种方式（如体积加散射）结果十分相似，其二维散点图上有相当大的重叠。

用了VCS技术后，一样在三个方面完全一致的情形是很少见的。

加上仪器配备了先进软件，能够像流式细胞仪一样调校、设置门限，可在三维图像上将各细胞较好的分开，达到较准确的分类。

减少flag的假阳性和假阴性，减少复检率，并可提示幼稚白细胞、异型淋巴细胞等。

VCS技术在Coulter公司的STKS、MAXM和上均已成功的应用。

。

另外这种仪器还可直接计数CD4和CD8淋巴细胞，并算出其比率。

其原理是：

将包被了抗CD4和CD8单克隆抗体的聚苯乙烯微球，加到血中。

含有相应表面标志（抗原）的淋巴细胞会结合相应的微球，从而改变了该细胞的VCS性质，即可在STKS等型号后的分析仪上加以测定。

官方资料如下：

库尔特运用VCS技术对白细胞进行五项分类，运用V、C、S三种探针，在流式通道的检测点，对通过的单列白细胞进行逐个的、同时的、三重的检测，用三维分析技术直接分类白细胞各亚群。

库尔特白细胞分类用试剂先溶解红细胞，再使白细胞恢复到原态，进入流式通道同意检测。

在流式通道内运用鞘流技术，令其在流式通道内作最适的单细胞排列，逐个、同时地同意VCS三重检测。

上图是体积测定

VCS技术运用V、C、S三种探针，从体积、细胞核特性、颗粒特性等方面综合分析

白细胞，检测细胞的视角与手工镜检相似。

1．用低频电流准确分析细胞体积，是库尔特专利技术。

体积是区分白细胞亚群一个很重要的参数，它能有效区分淋巴细胞和单核细胞。

上图是高频传导

2．Conductivity-Opacity（传导性-阻光性）运用高频电磁探针检测细胞核及核质比的特性，是库尔特专利技术。

细胞膜对高频电流具传导性，当电流通过细胞时，细胞核的化学组份令电流的传导产

生转变，其转变量（RF）能够用来反映细胞内含物的信息。

该参数可用来进一步区别体积差不多的细胞，如：

淋巴细胞和嗜碱细胞，由于它们的

细胞核特性不同而在传导性参数上有所区别。

上图是光散射

Scatter-RLS（激光散射）

运用一个氦氖激光源发出的单色激光扫描细胞，搜集细胞在10O～70O的散射光

（MALS），提供关于细胞颗粒性的信息。

能够专门好地域分颗粒特性不同的细胞。

上图是VCS整体技术示用意

4.三维分析

仪器将检测8,192个白细胞，依照每一个细胞的V、C、S检测量，将它们散布到一个VCS三维坐标（分辨率为256×256×256=16,777,216）上，取得白细胞各亚群的散布区，其分辨率是至今为止最高的。

高分辨率不仅令五项分类清楚，还能够提示许多异样细胞区域的报警。

DIFF分类图1DIFF分类图2DIFF分类图3，立体3D图形分析

在三个散射图当中能够清楚的分出5个分群，在STKS和HMX等机型上除有RET散射图之外，由于增加的T淋巴亚群的标志物，因此能够对某些T淋巴亚群进行分群，从而多出2个或以上的流式离散图。

上图是VCS检测部份示用意

ABBOTTWBC分类技术的实现

ABBOTT的五分类型号众多，从3000开始，3500，3700，3200，到此刻的4000，除3200外，其余都采纳RBC/PLT电阻法，WBC总数是两种计数方式比对，即电阻法和激光法（多角度偏振激光散射测定，MAPSS）用两种方式别离进行WBC总数测定，从而准确性极高，3200只用MAPSS一种方式进行WBC/PLT/RBC的总数及WBC分类测定，下面讲述分类的实现：

多角度偏振光散射白细胞分类技术（multi—Anglepolatisedscatterseparationofwhitecell,MAPSS）其原理是必然体积的全血标本用鞘流液按适当比例稀释。

其白细胞内部结构近似于自然状态，因嗜碱性粒细胞嘌粒具有吸湿的特性，因此嗜碱性粒细胞的结构有轻微改变。

红细胞内部的渗透透压高于鞘液渗透压而发生改变，红细胞内的血红蛋白从细胞内游离出来，而鞘液内的水分进入红细胞中，细胞膜的结构仍然完整，但现在的红细胞折光指数与鞘液的相同，故红细胞不干扰白细胞检测。

　　在鞘流系统的作用下，样本被集中为一个直径为30μm的小股液流，该液流将稀释细胞单个排列，因是单个通过激光束，故在各个方向都有其散射光。

能够从四个角度测定散射光的密度，看图

①00：

前角光散射（10～30）粗略地测定细胞大小；②100：

狭角光散射（70～110）测细胞结构及其复杂性的相对特点；③900：

900消偏振光散射（700`～1100），基于颗粒能够将垂直角度的偏振激光消偏振的特性，将嗜酸细胞从中性粒细胞和其它细胞中分离出来。

④900：

垂直光散射（700～1100）要紧对细胞内部颗粒和细胞成份进行测量。

能够从这四个角度同时对单个白细胞进行测量和分析，将白细胞分为嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞5种。

ABBOTT的五分类定量很成心思，不用传统的体积定量，而是采纳数量定量，每次计数时完成10000个细胞测定即停止，这一点上比库尔特多1000多个细胞测定。

分类的前后执导顺序是：

（1）0°表示大小;10°表示细胞内里的复杂性，例如:

有粒的、多核的、10°讯号就比较强;90°直角表示分叶情形和90°直角消偏振光用来显示嗜酸性细胞。

电脑从90°直角与10°分出多核细胞和少核细胞，又由多核细胞里认出嗜酸性细胞会有较强的90°直角消偏振光，因此与嗜中性细胞分开。

（2）以后又由0°和10°，利用浮动界标分出淋巴、单核及嗜碱性细胞，而白细胞的数量也由0°找出，故分类及数量的结果是在同一个步骤里完成，这是跟其也融合多种技术，但不是利用流式细胞仪原理。

（3）这最新的90°直角消偏振光的应用，跟其它用光散射法的仪器不一样。

通常来讲，其它只用高或低散射角度，而未有效消偏振光技术。

这在临床病例里，例如爱滋病，用这新的方式准确报告嗜酸性细胞。

（4）共它白细胞分类，除大体的五分类外，多角度激光法也提供了其它4种分类及数量，指示在病理一些专门的报警，提供化验人员这些资料，以便比较从人手推片得出来的结果。

这报告亦提供用户一些可能存在的病理成因。

例如:

异样淋巴%及#胚细胞%及#未成熟粒细胞%及#带形核嗜中性细胞%及#免受干扰的白血球分类咱们明白白血球分类的干扰，包括有核红细胞干扰淋巴或有一些抗溶性红细胞被误为淋巴，阻碍分类及白细胞数量。

最新的激光技术揉合了电阻法的强项，打开了一个新的局面，为技术人员提供可报告的结果，省却很多人手工作修正。

为处置抗溶性红细胞干扰，同经常使用比较强的溶解液或延长样本孵育时刻，故揉合了电阻法的激光法分析仪能给予合法结果。

因在激光法没有溶血剂，只用鞘液，维持细胞在原始状态，故单用激光法的仪器只会报警有可异发觉。

因此，用户能够用另外一个进样模式，确实是“延长孵育时刻”，进行操作。

这结果与电阻法结果配合。

电阻法误认有核红细胞为白细胞，故电阻法的报告会比激光法高，基于这一不同，找出有核红细胞的估量就用公式排除这一阻碍。

这是0度和10度角的散射图，已经很明显的区分出了五分群的散射图，可是，各个角度的组合散射图再加上RET，MAPSS技术提供的散射图多达7个，同时，还能提供6个直方图。

除3200之外的其他机型上若是激光分类部份显现问题无法利用，能够软件调整出三分类利用。