一种分离自体肿瘤细胞与TIL 细胞新方法的建立.docx

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一种分离自体肿瘤细胞与TIL细胞新方法的建立

一种分离自体肿瘤细胞与TIL细胞新方法的建立

邹征云刘宝瑞杜娟钱晓萍禹立霞王立峰殷海涛

南京大学医学院附属南京市鼓楼医院肿瘤科，江苏南京210008

[摘要]目的：

寻求有效地从恶性胸腔积液和腹水中分离出较多的TIL细胞并保持其高度的增殖能力与抗瘤活性的方法。

方法：

应用非连续密度梯度离心法与贴壁法对恶性胸腹水中的TIL进行分离，而后进行诱导培养，比较两种方法下TIL细胞的得率、增殖速度、杀瘤活性及培养前后的表型变化。

结果：

贴壁法能够获得更多的TIL细胞，经统计学处理差异显著，P<0.05；培养后两种方法所得TIL细胞的增殖速率、杀瘤活性及表型是一致的，经统计学处理差异无显著意义，P>0.05。

结论：

贴壁法具有操作简便、细胞得率高的优点，值得临床推广应用。

[关键词]淋巴细胞，肿瘤浸润；离心法，梯密度；胸膜积液，恶性；腹水

[中图分类号]R730.51

ANewApproachforIsolatingTumorCellsandTumorInfiltratingLymphocytesZouZheng-yun,LiuBao-rui,DuJuan,etal.DepartmentofOncology,NanjingDrumTowerHospital,FacultyofMedicine,NanjingUniversity,Nanjing210008,China.

Abstract:

ObjectiveTosetupanefficientwaytoseparatemuchmorefunctionaltumorinfiltratinglymphocyte（TIL）frommalignantpleurafluidandascites.MethodsIsolatedbytwoways,onebeingthediscontinuousdensitygradientcentrifugation,theotherbeingthenewattachmentmethodweestablished,TILswerecultivatedinthesameconditions,andtheirsproliferationaswellasthekillingactivityandthephenotypechangesweredetected.ResultsItwasobviouslyhigherinquantitybythenewattachmentmethodcomparedwiththewayofdiscontinuousdensitygradientcentrifugation;therewasnodifferenceintheproliferationorthekillingactivityinvitroaswellasthephenotypechangesbetweentwoways.ConclusionThewayofattachmentissimpleandhighefficientforcellsseparation;itisdeservedtobebroadlyapplicated.

KeyWords:

tumorinfiltratinglymphocyte;isolation;pleuraeffusion;ascites

如何从恶性胸腔积液和腹水中分离出较多肿瘤细胞与TIL前体细胞？

常规方法是采用淋巴细胞分离液进行非连续密度梯度离心法[1]。

但是，这种方法烦琐，细胞丢失多，于是在实践中我们摸索并建立了一种比较简便、快捷而又有效的方法—贴壁法，该方法能从恶性胸腔积液和腹水中分离出较多的恶性肿瘤细胞及TIL前体细胞，有着极其便利的应用价值。

一、材料与方法

（一）材料收集

1.标本采集

收集本科2002年10月-2003年3月间6例晚期肿瘤患者（2例肺癌、1例肝癌、1例胃癌、1例十二指肠腺癌）的胸腔积液或腹水各200ml（肝素抗凝5U/ml），立即进行分离制备试验。

2.主要试剂

淋巴细胞分离液由上海试剂二厂生产；RPMI1640培养基为美国GIBCOBRL公司产品；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；注射用人重组IL-2由北京四环药品厂生产；OKT3为古巴分子中心产品；DMSO及MTT均为Sigma公司分装；红细胞裂解液和缓冲液均用分析纯产品按常规方法配制；0.25%的胰蛋白酶由AMRESCO公司分装；靶细胞K562为本室传代培养。

（二）实验方法

1.贴壁法

无菌收集经肝素抗凝的恶性胸腔积液或腹水100ml，经2000r/min离心10min，沉淀细胞用无菌缓冲液洗涤2次后悬于20ml的缓冲液中；而后将100%的淋巴细胞分离液5ml加入15ml的无菌离心管中，再小心加入10ml上述细胞悬液，经2000r/min离心20min，在100%的淋巴细胞分离液界面上收集云雾状的细胞层细胞即为肿瘤细胞与TIL细胞的混合体，1500r/min，离心5min，按1：

10的体积比加入红细胞裂解液，吹打混匀后置4℃冰箱静置8min，1500r/min，离心5min，沉淀细胞用无菌缓冲液洗一次，再用RPMI1640培养液洗一次，按1×106/ml的浓度将细胞悬于含有10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，而后置于饱和湿度、37℃、5%CO2的培养箱中静置培养，24小时后取出，将悬浮细胞（即为TIL细胞）移至另一培养瓶中培养，贴壁的细胞即为肿瘤细胞。

2.非连续密度梯度离心法[1]

无菌收集经肝素抗凝的恶性胸腔积液或腹水100ml，经2000r/min离心10min，沉淀细胞用无菌缓冲液洗2次后悬于20ml的缓冲液中；而后采用淋巴细胞分离液进行非连续密度梯度离心法分离，具体为：

最下层为100%的淋巴细胞分离液15ml，中间为75%的淋巴细胞分离液15ml，小心沿管壁加入上述20ml细胞悬液，三层之间不要混淆，经2000r/min离心20min，于100%液界面收集TIL，75%液界面收集肿瘤细胞，而后分别离心，1500r/min，离心5min，按1：

10的体积比加入红细胞裂解液，吹打混匀后置4℃冰箱静置8分钟，1500r/min，离心5min，沉淀细胞用无菌缓冲液洗一次，再用RPMI1640培养液洗一次，获得TIL及肿瘤细胞。

3.TIL细胞的培养

TIL细胞悬于含10%新生牛血清的RPMI1640完全培养基中，培养的第1天加入终浓度为1000U/ml的IFN-γ；第2天加入终浓度为100ng/ml的OKT3,1000U/ml的IL-2；而后隔1~2d加入含有IL-21000U/ml的完全培养基进行培养。

培养的过程中观察细胞增殖速度，培养前后TIL表型变化，培养2周后测定其对自体肿瘤细胞及K562的杀瘤效应。

4.自体肿瘤细胞的培养

自体肿瘤细胞置于含有10%的新生牛血清的RPMI1640完全培养基中进行培养，每隔1~2d天弃上清全量换液。

培养的过程中见到肿瘤细胞增殖的同时成纤维细胞亦生长旺盛，于培养的第5天采用0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，当见到成纤维细胞开始皱缩变圆部分脱落时终止消化，弃成纤维细胞，如此重复多次，可获得相对较多的自体肿瘤细胞[2]。

5.自体肿瘤细胞的鉴定

自体肿瘤细胞同时采用HE染色、培养液上清中肿瘤标记物的测定、免疫组化检测肿瘤细胞胞膜及胞浆中CK18、AE1/AE3、EMA、ESA等上皮源性抗原的表达等方法而加以鉴定。

6.TIL细胞对自体肿瘤细胞及K562的杀瘤效应的检测

按效靶比为20：

1的比例，取培养的效应细胞即TIL1×105约100ul与K562细胞或自体肿瘤细胞5×103约100ul混合加入96孔板中，每组样品设3个复孔；将培养板置饱和湿度、37C、5%CO2孵箱内培养20h，每孔加入MTT（5mg/ml）20l，继续培养4h，而后离心，弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150l，振荡5min，待沉淀物完全溶解后用酶联免疫检测仪（波长490nm）测吸光度A值，计算杀伤率。

公式如下：

杀伤率（%）＝[A（靶）+A（效）A（效+靶）]A（靶）100%。

二、结果

（一）贴壁法TIL与肿瘤细胞分离前后：

图1示TIL与肿瘤细胞分离前，可见：

肿瘤细胞体积较大，形态为长梭型或不规则，但都贴壁；其上悬浮的小圆型透亮的细胞即为TIL。

将悬浮细胞及其上清倒入另一个培养瓶中就可将肿瘤细胞和TIL分离。

分离效果见图2及图3。

图2为分离后的TIL，通过流式细胞仪检测悬浮细胞表面分子如CD45、CD3、CD4、CD8及CD56等表达情况而鉴定；图3为分离后的肿瘤细胞，可通过细胞的HE染色、免疫组化染色及培养液上清肿瘤标记物测定而鉴定。

图1.TIL与肿瘤细胞分离前图2.分离后TIL

Figure1.TILsandself-tumorFigure2.TILsafterseparation

cellsbeforeseparation

图3.分离后的肿瘤细胞图4.培养中的TIL细胞

Figure3.autologous-tumorcellsafterFigure4.TILsculturedinvitro

separation

（二）两种分离方法获得TIL细胞数的比较

表1为两种分离方法获得TIL细胞数的比较。

采用贴壁法获得的TIL细胞数4.5×107±1.2×106,明显多于非连续密度梯度离心法分离获得的TIL细胞数（2.0×107±0.5×106），两种方法比较，差异有极显著意义，P＜0.01。

表1.两种分离方法获得TIL细胞数的比较（

±S,n=6）

Table1.ThequantityofTILsseparatedbytwoways（

±S,n=6）

theisolationmethod）TIL

theattachmentmethod4.5×107±1.2×106

thediscontinuousdensitygradient

centrifugationmethod2.0×107±0.5×106

（三）两种分离方法获得TIL诱导培养扩增倍数的比较

两种方法分离获得的TIL细胞诱导培养后均发生明显增殖，图4示TIL生长照片，可见TIL聚集成团生长，形成很大的细胞集落。

但在增殖速度上两组间差异无显著意义，P>0.05（图5）。

图5.两种分离方法获得TIL细胞诱导培养扩增倍数的比较

Figure5.ExpansionofTILsseparatedbytwoways

（四）培养获得的TIL细胞对靶细胞杀伤活性比较（MTT法）

表2显示两种方法培养获得TIL细胞对靶细胞杀伤活性的比较。

可见两种分离方法所得TIL经诱导培养后抗瘤活性一致，对自体肿瘤细胞的抗瘤活性差异无显著意义,P＞0.05；对自体肿瘤细胞的抗瘤活性明显高于对K562的抗瘤活性，二者比较差异有显著意义，P＜0.05。

表2.两种方法培养获得TIL细胞对靶细胞杀伤活性的比较（

±S,%;n=6）

Table2.CytotoxicactivityofTILsontargetcells（

±S,%;n=6）

targetcellstheattachmentmethodthedensitygradientt-test

centrifugationmethod

autologous85.7±8.384.8±7.9P>0.05

tumorcells

K562cells56.9±6.457.8±6.7P>0.05

t-testP<0.05P<0.05__

（五）两种分离方法获得TIL细胞经诱导培养前后表型测定

预试验提示培养初期两种分离方法所得TIL表型一致,故本表未列出。

图6示两种分离方法获得TIL细胞经诱导培养后表型测定结果。

可以看出培养初期CD3+CD4+细胞比例较高，培养2周后其水平有所下降；培养初期CD3+CD8+细胞及CD3+CD56+细胞比例较低，培养2周后比例均显著增高；两种分离方法获得的TIL细胞经诱导培养两周后各亚型所占比例间比较差异无显著意义，P>0.05。

图6.两种分离方法获得TIL细胞经诱导培养2周后表型测定

Figure6.ImmunophenotypeofTILsbeforeandafterculturedonday14inbothgroups

（六）自体肿瘤细胞鉴定结果

以1例晚期十二指肠腺癌患者的胸腔积液中分离获得的贴壁细胞为例。

Haematoxylin&Eosin（HE）染色结果见图7，可见细胞具有异型性，胞核增大，核深染，核浆比例增大，提示其为肿瘤细胞。

贴壁细胞培养液上清与血清中肿瘤标记物的比较见表3。

由表3可知培养液上清与血清中肿瘤标记物一致，提示所培养的贴壁细胞为肿瘤细胞。

贴壁细胞免疫组化检测如图8所示：

可见细胞的胞膜、胞浆中可见CK18、AE1/AE3、EMA、ESA等抗原表达阳性细胞，提示所培养的细胞为上皮来源细胞，即为十二指肠腺癌细胞。

表3.贴壁细胞培养液上清与血清中肿瘤标记物的比较

Table3.Theconcentrationoftumormarkersintheserumandthesupernatantoftheculturedattachmentcells

SampleCEA（ng/ml）CA199（u/ml）CA125（u/ml）CA242（u/ml）CA50（u/ml）

supernatant＜0.2＞1000115＞150＞140

serum＜0.2＞100059.1＞150140

图7.自体肿瘤细胞HE染色图8.自体肿瘤细胞免疫组化检测

Figure7.HEstainingoftheFigure8.immunohistochemical

attachmentcellsstainingoftheattachmentcells

三、讨论

TIL细胞是特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞，其杀瘤活性较LAK细胞强50~100倍；TIL细胞疗法是一种特异性免疫活性细胞疗法，尽管其用于肿瘤治疗领域已有20多年的历史，但至今一直有新技术、新成果在不断报道[3,4,5]。

美国Rosenberg实验室[3]于2002年10月在Science杂志上发表了其研究成果，他们采用TIL对13例化疗无效的晚期恶性黑色素瘤患者行免疫替换疗法治疗，结果6例获得部分缓解，4例取得混合性疗效。

TIL因其对肿瘤细胞具有较强的特异性杀伤作用，因而一直是国内外恶性肿瘤生物治疗的热点之一。

此外临床上应用树突状细胞（dentriticcell，DC）瘤苗治疗前列腺癌、恶性黑色素瘤、肾癌、恶性淋巴瘤等已经取得了令人鼓舞的效果[6,7,8]；并有文献报道DC瘤苗与TIL细胞间具有协同作用，DC瘤苗能够增强TIL细胞的增殖数量及特异性杀伤肿瘤细胞的毒力[9]。

因而有理由相信DC瘤苗与TIL细胞同时应用于临床，用于抗肿瘤治疗领域更具研究价值及治疗前景。

然而使用DC瘤苗与TIL细胞必须解决以下两个方面的问题：

一是肿瘤抗原的获得，二是TIL前体细胞的大量获取并保持其高度增殖能力。

目前临床上恶性胸腔积液和腹水患者较多，恶性胸腔积液和腹水亦是获得TIL与肿瘤细胞的较好途径。

恶性胸腔积液和腹水途径制备TIL，常规方法是采用非连续密度梯度离心法分离[1]，我们至今尚未读到国内外有关贴壁分离法这样的文献报道。

本实验研究结果显示采用贴壁法分离癌性胸腔积液和腹水中的TIL细胞能够较常规方法获得更多的TIL细胞，所得的TIL细胞经诱导培养在增殖速度、杀瘤活性及表型变化等方面与常规非密度梯度离心法途径制备的TIL细胞间无差异。

TIL表型检测显示初始分离以CD3+T细胞为主，CD4/CD8值为1.24，说明机体免疫功能处于抑制状态，经IL-2、OKT3培养2周后CD8+T细胞的比率明显升高，CD4/CD8值为下降为0.28~0.29，可能与OKT3触发、激活几乎所有的细胞毒性T淋巴细胞，使得CD3+CD8+T及CD3+CD56+T细胞呈优势生长有关[10]。

本实验研究结果提示：

贴壁法具有操作简便，细胞丢失少的优点，临床上可以推广应用；TIL细胞对自体肿瘤细胞具有较强的杀瘤活性，可用于恶性肿瘤的免疫治疗；胸腔积液和腹水途径分离获得的肿瘤细胞可以用于恶性肿瘤的特异性免疫治疗中肿瘤抗原的制备。

参考文献：

[1]张卓然.实用细胞培养技术[M].北京:

人民卫生出版社,1999.100-101.

[2]司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:

世界图书出版社西安公司,1996.77.

[3]DudleyME,WunderlichJR,RobbinsPF,etal.Cancerregressionandautoimmunityinpatientsafterclonalrepopulationwithantitumorlymphocytes[J].Science,2002;298（5594）:

850-854.

[4]KanN.Analysisof5-yearsurvivalamongbreastcancerpatientswithmalignantpleuraleffusionreceivingintrapleuralOK-432followedbyadoptivetransferwithculturedeffusionlymphocytes[J].GanToKagakuRyoho,2003;30（11）:

1559-1561.

[5]RidolfiL,RidolfiR,RiccobonA,etal.Adjuvantimmunotherapywithtumorinfiltratinglymphocytesandinterleukin-2inpatientswithresectedstageIIIandIVmelanoma[J].JImmunother,2003;26

（2）:

156-162.

[6]LauR,WangF,JefferyG,etal.PhaseⅠtrialofintravenouspeptide-pulseddendriticcellinpatientswithmetastaticmelanoma[J].JImmunother,2001;24

（1）:

66-78.

[7]KuglerA,StuhlerG,WaldenP,etal.Regressionofhumanmetastaticrenalcellcarcinomaaftervaccinationwithtumorcell-dendriticcellhybrids[J].NatMed,2000;6（3）:

332-336.

[8]TimmermanJM,CzerwinskiDK,DavisTA,etal.Idiotype-pulseddendriticcellvaccinationforB-celllymphoma:

clinicalandimmuneresponsein35patients[J].Blood,2002;99（5）:

1517-1526.

[9]MuldersP,TsoCL,GitlitzB,etal.Presentationofrenaltumorantigensbyhumandendriticcellsactivatestumor-infiltratinglymphocytesagainstautologoustumor:

implicationsforlivekidneycancervaccines[J].ClinCancerRes,1999;5

（2）:

445-454.

[10]LaderachD,MovassaghM,JohnsonA,etal.4-1BBco-stimulationenhanceshumanCD8（+）TcellprimingbyaugmentingtheproliferationandsurvivalofeffectorCD8（+）Tcells[J].IntImmunol,2002;14（10）:

1155-1167.

[第一作者简介]邹征云（1972-），女，江苏姜堰市人，主治医师，硕士研究生，研究方向为恶性肿瘤的免疫治疗。

E-mail:

zouzhengyun_9988@