生物分离工程考试范围.docx

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生物分离工程考试范围

13、下游加工过程概论

1、下游加工工程是生物工程的一个组成部分。

生物化工产品通过微生物发酵过程，酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，从上述发酵液。

反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程。

2、传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异，主要表现在下列三方面。

①传统生化产品都为小分子，其理化性能数据都为已知，因此放大比较有依据；相反基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验；②由于第一代基因工程产品都以大肠杆菌作为宿主，无生物传送系统、故产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来给提取增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定，故提取较困难；③大分子（如蛋白质）的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都由氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法。

3、生物技术下游加工过程的特点：

①培养液中所含欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高。

需要多步纯化。

②欲提取的生物物质通常很不稳定、预热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解，特别是蛋白质的生物活性与一些辅因子、金属离子的存在和分子的空间构型有关。

③发酵或培养都是分批操作，且微生物总有一定的变异性，故各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定的弹性。

4、整个下游加工过程应遵循下列四条原则：

①时间短；②温度低；③pH适中（选择在生物物质的稳定范围内）；④严格清洗消毒。

5、一般说来，下游加工过程可分为4个阶段：

①培养液的预处理和固液分离；②初步纯化（提取）；③高度纯化（精制）；④最后纯化。

6、初步纯化（提取）目的：

在于浓缩，也有一些纯化作用。

有8种方法：

①吸附法②离子交换法③沉淀法（盐析、加入有机溶剂、调pH至等电点、加入非离子型聚合物、加入聚电解质）④溶剂萃取法⑤两水相萃取法⑥超临界流体萃取⑦逆胶束萃取⑧膜过滤法

7、各种层析方法对比

方法

机理

分离能力

容量

凝胶色谱

分子的大小和形状

中等

小

离子交换色谱

电荷和离解度

高

很大

聚焦色谱

等电点

很高

大

疏水色谱

表面自由能

高

大

亲和色谱

特殊的生物作用力

优异

很大

8、选择纯化方法应根据目标蛋白质和杂蛋白在物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。

9、当几种方法连用时，最好以不同的分离机制为基础，而且经前一种方法处理的液体应能适合于作为后一种方法的料液，不必经过脱盐、浓缩等处理。

如经盐析后得到的液体，不适宜于离子交换层析，但对疏水层析（或超滤），则可直接应用。

10、非蛋白质类杂质的去处

①DNA的去除（了解）DNA在pH4.0以上呈阴离子，可用阴离子交换剂吸附除去，但目标蛋白质pI值应在6.0以上。

②热原质的去除（重点）注射用药必须无热原质。

热原质制药是肠杆菌科所产生的细菌内毒素。

内毒素到处存在，她们是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分——脂多糖，在细菌生长或细胞溶解时会释放内毒素，其性质相当稳定，即使经高压灭菌也不失活性。

最好的办法是防止产生热原质，整个生产过程在无菌条件下进行。

所有层析介质在使用前先除去热原质，操作在2-8℃下进行，洗脱液需先经无菌处理，流出的蛋白质溶液也应无菌处理，即通过0.2nm微滤膜，并在2-8℃在保存。

（预防为主）

③病毒的去除经过色层分离一般能将病毒去除，必要时也可用UV照射或过滤使病毒失活或除去。

10、目标蛋白质的表征和分析方法（见课本P10）

仅用一种分析方法是不够的

14、发酵液的预处理和固液分离方法

1、凝聚和絮凝的差异：

凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。

絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使细胞聚集形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。

2、不同来源的培养液和发酵液其固液分离速度有很大的差异，取决于该介质的理化性质，主要影响因素是细胞或菌体的大小和介质的黏度。

3、胶体的特征参数ζ电位：

胶体双电层中唯一一个能够测量的电位，唯一的标准，ζ电位越大，点排斥作用就越强，胶粒的分散程度越大。

4、阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：

Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+

5、絮凝的原理：

架桥作用，臂要足够长。

（见课本P15）

6、搅拌速度和时间上在絮凝过程中也是十分重要的，加入絮凝剂的初期应高转速，使絮凝剂快速均匀分散到料液中，不形成局部过浓，但接着应低转速搅拌，有利于絮凝体长大成团；如仍高速搅拌易将絮凝团打碎，影响絮凝效果，所以应采用变速搅拌。

7、杂蛋白的其他去除方法（简答）

①等电点沉淀法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关。

和氨基酸等两性物质一样，蛋白质在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷，而在某一pH下净电荷为0、溶解度最小，可使其产生沉淀而除去。

②活性降低（加热法、有机溶剂法等）蛋白质从有规则的排列变成不规则的过程称为变性，变性蛋白质溶解度较小，最常用的使蛋白质变性的方法是加热，加热还能使液体粘度降低、加快过滤速度。

③吸附作用利用吸附作用也可除去蛋白质。

把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。

④蛋白质沉淀剂加蛋白质沉淀剂，使形成复合物沉淀，也是除去杂蛋白的方法。

在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子，使其形成沉淀，在碱性溶液中，加入一些阳离子。

8、高价无机离子的去除方法：

①为了去除钙离子，宜加入草酸，但草酸较贵，用过注意回收。

②要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠，Na5P3O10,用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。

③要除去铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。

9、用于生化物质分离的常规过滤设备主要是板框压滤机和鼓式真空过滤机。

板框特点：

过滤面积大、过滤推动力能较大幅度调整、结构简单、价格较低、动力消耗少、但这种设备不能连续操作，设备笨重，劳动强度大、卫生条件差、非生产的辅助时间长。

鼓式特点：

实现自动化控制，但是压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过程。

10、影响离心分离的因素：

①提高离心转速②与颗粒直径有关，大颗粒容易沉降；③与颗粒密度和机制密度之差（ρp-ρm）成正比，当ρp》ρm时，颗粒沿离心力方向沉降。

两者差距越大沉降速度越快。

④随介质粘度增大而减小。

（颗粒沉降或漂浮速度Up的公式见课本P20）

15、细胞破碎

1、细胞破碎技术：

㈠机械法：

①高压匀浆器适用范围比较广，在微生物细胞核植物细胞的大规模处理中常用，但是，在处理过程中发热，因此，对热不稳定的生物物质不适用。

②X-挤压器适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，但是该法对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。

③高速珠磨机珠体的直径应依据细胞的大小和浓度以及在操作时不使珠体带出为限度进行选择，发热也是必须考虑的问题。

④超声波振荡器原理：

超声波对细胞的破碎作用与液体中空穴的形成有关。

当超声波在液体中传播是，液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。

由于拉力的作用，产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性漩涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流动，而使细胞破碎。

㈡非机械法①酶解法②渗透压冲击法③冻结-融化法④干燥法⑤化学法

2、选择破碎方法的依据（大题）

⑴细胞的处理量：

若具大规模应用前景的，则采用机械法。

若仅需实验室规模，则选非机械法。

⑵细胞壁的强度和结构：

细胞壁的强度除取决于网状高聚物结构的交联程度外，还取决于构成壁的聚合物种类和壁的厚度。

某些植物细胞纤维化程度大、强度较高、纤维层厚、强度很高，破碎也较困难。

在机械法破碎中，破碎的难易程度还与细胞的形状和大小有关。

⑶目标产物对破碎条件的敏感性：

生化物质通常稳定性较差，在决定破碎条件时，既要有高的释放率，又必须确保其稳定。

破碎过程中溶液的pH、温度、作用时间等都是重要的影响因素。

⑷破碎程度：

细胞破碎后的固液分离往往是一个突出要解决的问题，机械法破碎常会使细胞碎片变得很细小，固液分离就困难，因此操作条件的控制很重要。

16、沉淀法

1、沉淀法可以分为：

①盐析法②等电点沉淀法③有机溶剂沉淀法④非离子型聚合物沉淀法⑤聚电解质沉淀法⑥高价金属离子沉淀法（见课本P37）

2、阴离子的盐析效果有下列次序：

柠檬酸盐>PO43_>SO42_>CH3COO_>Cl_>NO3_>SCN_

3、最常用的盐析剂是硫酸铵

硫酸铵的优点：

价廉、溶解度大、且能使蛋白质稳定。

硫酸铵的缺点：

水解后变酸，在高pH下会释放出氨；腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。

4、盐析的机理盐溶：

当向蛋白质溶液中逐渐加入电解质时，开始，蛋白质的溶解度增大，这是由于蛋白质的活度系数降低的缘故，这种现象称为盐溶；对盐溶过程，通常阳离子影响较大，高价阳离子的盐类效果显著，但当继续加入电解质时，另一种因素起作用，使蛋白质溶解度减小，称为盐析。

（见课本P41）

5、等电点沉淀：

在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为0，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀，本法应用与憎水性较强的蛋白质。

17、膜过滤法

1、膜过滤法的优点：

①操作在常温下进行；②是物理过程，不需要加入化学试剂；③不发生相变化（因而能耗较低）④在很多情况下选择性较高；⑤浓缩和纯化可在一个步骤内完成；⑥设备易放大，可以分批或连续操作。

2、截断分子量：

相当于一定截留率（通常为90%或95%）的分子量，随厂商而异。

18、溶液萃取法

1、分配系数应用时，需注意的条件是：

①必须是稀溶液②溶质对溶剂之互溶度没有影响③必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。

2、根据“相似相溶”的原则来选择溶剂，重要的“相似”就溶解关系而论是在分子的极性上。

3、介电常数是一个化合物摩尔极化程度的量度，已知这个值，就可预知化合物的极性强弱。

4、对于溶剂除了选择萃取能力高，分离程度高以外，在其操作使用方面还要求：

①溶剂与被萃取的液相互溶度要低，粘度低，界面张力适中，使相的分散和两相分离有利②溶剂的回收和再生容易，化学稳定性好③溶剂廉价易得，④溶剂的安全性好，如闪点高，低毒等。

常用的有乙酸乙酯、乙酸丁酯和丁醇等。

5、影响萃取操作的因素很多，主要的因素有：

pH、温度、盐析、带溶剂

6、以油滴分散在水中，称为水包油或O/W型乳浊液，另一种是水滴分散在油中，称为油包水或W/O。

7、乳化剂稳定性和下列几个因素有关：

①界面上保护膜是否形成（最重要）②液滴是否带电③介质的黏度

8、表面活性剂的亲水与亲油程度的相对强弱在工业上常用HLB数表示。

HLB数越大，亲水性越强，形成O/W型乳浊液。

HLB数越小，亲油性越强，形成W/O型乳浊液。

9、乳浊液的破坏

①过滤和离心分离②加热③稀释法④加电介质⑤吸附法⑥顶替法⑦转型法

20、离子交换法

1、离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的网状结构的功能高分子化合物，它的化学结构良好，且具有离子交换能力。

活性离子是阳离子的称为阳离子交换树脂，其功能集团是酸性基团；活性离子是阴离子的称为阴离子交换树脂，其功能集团是碱性基团。

2、离子交换树脂的分类：

强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂四大类。

（见课本P99-P100）

3、树脂几种主要性能的测定方法：

①颗粒度②含水量③膨胀度④湿真密度⑤交换容量⑥滴定曲线⑦pK值（测定方法见P107-P110）

4、离子交换过程应包括下列五个步骤：

①A+离子自溶液中扩散到树脂表面；②A+离子从树脂表面再扩散到树脂内部的活性中心③A+离子与RB在活性中心上发生复分解反应；④解吸离子B+自树脂内部的活性中心扩散到树脂表面⑤B+离子再从树脂表面扩散到溶液中。

5、一般来说，液相速度越快或搅拌越激烈，浓度越浓，颗粒越大，吸附越弱。

越是趋向于内部扩散控制。

相反液体流速慢，浓度稀，颗粒细，吸附强。

越是趋向于外部扩散控制。

当树脂吸附抗生素等分子时，由于在树脂内部扩散速度慢，尝尝为内部扩散控制。

6、影响交换速度的因素（问答）

①颗粒大小颗粒减小无论对内部扩散控制或外部扩散控制的场合，都有利于交换速度的提高。

对内扩散的场合，影响更为显著。

②交联度交联度越低树脂越易膨胀，在树脂内部扩散就较容易，所以当内扩散控制时，降低树脂交联度，能提高交换速度。

③温度温度从25℃升至50℃，扩散系数Di增大1倍，因而交换速度也增加一倍。

④离子的化合价离子在树脂中扩散时，与树脂骨架间存在库伦阴历。

离子化合价越高，这种引力越大，因此扩散速度就愈小。

⑤离子的大小小离子的交换速度比较快。

大分子在树脂中的扩散特别慢，因为大分子会和树脂骨架碰撞，甚至骨架变形。

⑥搅拌速度当液膜控制时，增加搅拌速度会使交换速度增加，但增大到一定程度后再继续增加转速，影响就比较小。

⑦溶液浓度当溶液浓度为0.001mol/L时，一般为外扩散控制。

，当浓度增加时，交换速度也按比例增加，当浓度达到0.01mol/L左右时，浓度再增加，交换速度就增加得较慢。

此时，内扩散和外扩散同时起作用。

当浓度再继续增加，交换速度达到极限值后就不再增大，此时已转变为内扩散控制。

7、一般说来，对强碱性抗生素宜选用强酸性树脂，对弱碱性物质宜选用强酸性树脂，同样道理，弱酸性物质宜用强碱性树脂，强酸性物质宜用弱碱性树脂。

8、目标物质分子较大，应选择交联度较低的树脂，但交联度过小，会影响树脂的选择性，且易粉碎，造成使用过程中树脂流失，故选择交联度的原则是：

在不影响交换容量的条件下，尽量提高交联度。

9、选择合适的操作条件，最重要的操作条件是交换时的pH，合适的pH需满足三个条件：

①在目标物质稳定的范围内：

②使目标物质离子化③使树脂能离子化

10、亲水性离子交换剂：

二乙胺基乙基（DEAE）弱碱季胺乙基（QAE）强碱羧甲基（CM）弱酸磺丙基（SP）强酸（见课本P127）

21、吸附法

1、吸附法一般有下列优点：

①可不用或少用有机溶剂②操作简便、安全、设备简单③生产过程中PH变化小，使用于稳定性较差的生化物质。

但吸附法选择性差，收率不太高，特别是无机吸附剂性能不稳定、不能连续操作、劳动强度大。

2、吸附力的本质：

定向力、诱导力、色散力、氢键力

3、影响吸附过程的因素

1吸附剂的性质：

吸附剂的理化性质对吸附的影响很大。

吸附剂的性质与其原料、合成方法和再生条件有关。

一般要求吸附容量大，吸附速度快和机械强度好。

2附物的性质：

a.能使表面张力降低的物质，易为表面所吸附。

b.溶质从较易溶解的溶剂中吸附时，吸附量较少。

c.极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。

d.对于同系列物质，吸附量的变化是有规则的。

3溶液pH值的影响pH值影响某些化合物的离解度。

各种溶质吸附的最佳pH值，常常通过实验决定。

一般说来，有机酸在酸性下、胺类在碱性下较易为非极性吸附剂所吸附。

4温度的影响吸附热越大，则温度对吸附的影响越大。

对于物理吸附，一般吸附热较小，温度变化对吸附的影响也较小。

5其他组分的影响当从含有两种以上组分的溶液中吸附时，根据溶质的性质，可以互相促进、干扰、或互不干扰。

一般说来，对混合物的吸附较纯溶质的吸附为差，当溶液中存在其他其他溶质时，，会导致吸附一种溶质而使另一种溶质的吸附量降低。

4、其他类型的吸附（了解）

疏水作用吸附、盐析吸附、亲和吸附、燃料配位体吸附、免疫吸附、

固定金属亲和吸附、羟基磷灰石吸附

22、色层分离法

1、三种洗脱方法：

恒定洗脱、分布洗脱、梯度洗脱