戊糖片球菌发酵低值海产鱼工艺研究.docx

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戊糖片球菌发酵低值海产鱼工艺研究

戊糖片球菌发酵低值海产鱼工艺研究

ResearchonProcessingTechnologyofLow-valueMarineFishFermentedwithPediococcuspentosaceus

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中文摘要

戊糖片球菌发酵低值海产鱼工艺研究

摘要：

以低值海产鱼为原料，在分析戊糖片球菌生长特性的基础上，以其为发酵剂对低值海产鱼进行发酵，系统研究戊糖片球菌对鱼肉品质的影响，明确其中关键指标的变化特征与情况，单因素试验设计考察接种量、食盐添加量、培养温度和培养时间等因素对发酵鱼品质的影响，再通过正交实验L9（34）确定了最佳的工艺条件。

结果表明，接种量对发酵低值海产鱼品质影响最大，最佳工艺条件为：

菌种接种量108CFU/g,食盐添加量5%,发酵温度10℃，发酵时间4d.按最佳工艺生产的发酵鱼与淡水鱼发酵产品相比，产品质地紧密，酸味适中，香味浓郁。

本研究可改进低值海产鱼的加工工艺，缩短生产周期，提高产品质量，具有巨大的经济意义和显著的实用价值。

关键词：

戊糖片球菌；发酵；低值海产鱼；单因素试验；正交试验；感官评价

外文摘要

ResearchonProcessingTechnologyofLow-valueMarineFishFermentedwithPediococcuspentosaceus

Abstract:

Onthebasicofstudiesongrowthcharacteristicsofpediococcuspentosaceus,wecanmakeitasstaterculturetofermentlow-valuemarinefish.Inordertodeterminethechangeregulationandtendencyofthekeydex,ithastostudyoneffectsofthefishsystematically.Researchesoneffectsofthequalitymadebytheinoculation,saltconcentration,incubationtemperature,incubationtimeandotherfactorsbysinglefactorexperiment,thentodeterminetheoptimumprocessconditionsbydesigningorthogonalexperimentL9（34）.Theresultsshowedthatthemostimportinfluencefactorisbacteriainoculum.Theoptimumconditionsareasfallow:

bacteriainoculationis108CFU/g,saltconcentrationis5%,fermentationtemperatureis10℃,fermentationtimeis4d.Fermentedfishproductionbytheoptimumfermentationcomparedtofreshwaterfishproductsareclosetexture,moderateacidity,richflavor.Thisresearchmakesitpossibleforustoimprovetheprocessingtechnologyoflow-valuemarinefish,shortenthefermentationcycle,improveproductquality.Italsohasgreatsignificanceforeconomyandproduction.

Keywords:

Pediococcuspentosaceus;fermentation;low-valuemarinefish;singlefactortest;orthogonaltest;sensoryevaluation

1绪论………………………………………………………………………………1

1.1戊糖片球菌介绍………………………………………………………………1

1.2低值海产鱼加工现状…………………………………………………………1

1.3发酵鱼制品国内外研究现状…………………………………………………1

1.4本研究的内容…………………………………………………………………2

1.5本研究的目的与意义…………………………………………………………2

2材料与方法………………………………………………………………………3

2.1实验材料与设备………………………………………………………………3

2.2实验方法………………………………………………………………………5

3结果与分析………………………………………………………………………7

3.1原料鱼成分分析………………………………………………………………7

3.2戊糖片球菌耐盐性研究………………………………………………………8

3.3菌种接种量对低值海产鱼品质的影响………………………………………8

3.4食盐含量和发酵时间对低值海产发酵鱼品质的影响………………………9

3.5发酵温度和发酵时间对低值海产发酵鱼品质的影响………………………11

3.6正交试验……………………………………………………………………12

3.7戊糖片球菌发酵低值淡水鱼结果分析………………………………………15

结论…………………………………………………………………………………16

致谢…………………………………………………………………………………17

参考文献……………………………………………………………………………18

1绪论

1.1戊糖片球菌介绍

戊糖片球菌为革兰氏阳性球菌，其边缘整齐，呈乳白色。

半径一般为0.4～0.5μm，一般存活温度条件为30℃～42℃。

戊糖片球菌是有着前途功能和工艺性能的同型发酵乳酸菌，参与到发酵食品的制造中。

戊糖片球菌发酵肉制品时一方面有利于酸肉制品中pH急速降低，促进蛋白质分解，抑制挥发性盐基氮值以及TBA值的上升，并且对发酵初期的好氧性微生物和大肠菌群的生长繁殖起到较好的抑制作用。

另一方面，戊糖片球菌在发酵过程中产生的有机酸在赋予食品酸味的同时可与其中产生的酸、醇、酮等物质相互作用，形成新的呈味物质，减轻原料中原有的异味，使发酵终产品具有独特的风味。

水产品含水量高，营养丰富，携带菌种较多，这就需要在发酵过程中发酵剂能适应高盐和高渗透压的环境，并且能够与原料中原有微生物菌株竞争从而成为优势菌。

戊糖片球菌在发酵低值海产鱼工艺研究中，随着酸的产生，由于细菌素的合成，可防止不良菌群（李斯特菌，假单胞菌，肠杆菌等）的出现，同时可降低亚硝酸盐残留量水平。

戊糖片球菌是一种最常见的从传统发酵面包发酵的，以及从其他传统发酵食品中孤立的物种。

它在人类食品中的安全食用和对人类和动物所示的戊糖片球菌菌株益生菌特性有着悠久的历史。

研究戊糖片球菌发酵鱼制品对传统发酵鱼生产工艺的改进有一定的研究意义[18]。

1.2低值海产鱼加工现状

现今，由于各类新型捕捞技术的发展使得海洋渔业中大中型鱼类被大量捕捞，从而促使了小鱼、小虾的迅速繁殖。

与低值海产鱼产量的的迅速增加相比，由于缺乏加工利用技术的深入研究，我国对于低值海产鱼的加工水平远远落后于其他国家。

低值海产鱼通常具有下列四个特点：

（1）形体较小，体长一般为2～3cm。

（2）肉质细嫩,营养丰富,但保存性能低,机械强度较低。

（3）种类繁多,产量巨大,具有很大的开发价值。

（4）价格低廉,销售利润低，捕捞量少。

海产低值鱼的这些特点决定了其加工现状。

在我国，海产低值鱼一般被加工为动物蛋白饲料、浓缩鱼蛋白、鱼糜制品、鱼油制品、食用鱼粉、休闲小食品。

除以上应用,低值小海鱼还用于调味品的生产、生产鱼体分解蛋白以及其它的一些产品,但都未形成规模生产,产量也不大[2]。

对此，应充分开发利用低值海产鱼，不断更新相关理念研究，开发加工技术，研究出附加值高的副产品，通过政府等机构的支持，各类行业的推动，使日益繁殖的中小型海产鱼类资源得到充分利用。

1.3发酵鱼制品国内外研究现状

传统自然发酵产品是依靠自然界和原料自身携带或偶染的微生物在适宜的温湿度条件下发酵而成，尽管传统方法制得的产品风味独特，自然醇厚，但因工艺过程不规范、工艺参数较模糊、生产周期较长、质量不稳定、生产的创新程度和标准化程度低等原因，使得此类产品难以实现工业化和规模化生产。

而采用接种微生物发酵剂的生物发酵技术不仅可以提升发酵鱼制品产品品质和安全性，还能有效缩短发酵周期，增加生产效率，有利于实现传统发酵鱼制品的工业化、标准化、规模化的生产，因而此技术在海水鱼行业的应用已经成为国内外近些年来研究的焦点之一。

近年来，很多研究者应用生物发酵技术对传统鱼糜制品、鱼块制品、全鱼制品等进行了深入的研究。

国外研究内容主要有：

分析对采用自然发酵和接种发酵的产品各自的化学成分和微生物变化情况；十一种传统发酵咸鱼的生物胺动态变化分析；埃及发酵咸鱼在成熟和贮藏期内的游离氨基酸和生物胺变化分析；泰国低盐发酵鱼制品的乳酸菌特性及蒜在鱼制品发酵过程中的作用分析；在不同食盐浓度情况下泰国传统发酵鱼制品的微生物的动态变化分析，并且研究了产品的发酵特性；有的研究了作为调味品的加纳发酵鱼制品的理化性质和微生态变化情况[3]。

在国内，胡永金等利用现代食品与发酵技术，在明确微生物的发酵性能和鱼糜的基本制作工艺的基础上，研究了单一发酵剂、复合发酵剂对鲢鱼肉糜进行发酵，研制出了风味佳、高营养、高安全性、保存期长且满足大众口味的优质发酵鱼糜[4]；刘忠义等利用乳酸菌及混合菌种发酵红曲鱼，确保了产品的高安全性，同时解决了含盐量高的问题[1]；薛长湖、徐伟等研究了采用三种不同工艺加工墨鱼下脚料制成的低盐鱼酱在快速发酵过程中的生化变化[19]；熊善柏教授等从优化发酵工艺制得的鱼鲊中分离筛选出适用于鱼鲊制品生产的优势乳酸菌等[7]。

这些研究为我国发酵鱼制品的发展提供了一定的理论基础。

1.4本研究的内容

（1）分析戊糖片球菌的生长特性，以其为发酵剂对低值海产鱼进行发酵。

（2）以低值海产鱼为原料，系统研究戊糖片球菌对鱼肉品质的影响，明确其中各项指标的变化特征与规律。

（3）单因素实验设计考察接种量、培养温度和培养时间等因素对发酵鱼品质的影响，再通过正交实验L9（34）确定了最佳的工艺条件。

（4）同时利用戊糖片球菌发酵淡水鱼，与低值海产鱼发酵制品进行感官对比分析。

1.5本研究的目的与意义

传统的发酵肉制品多属于自然发酵，由于自然发酵不可控制因素较多，为了对发酵过程中各项不稳定因素进行有效控制，使产品的安全性和产品品质的稳定性大大提高，人们开始热衷于用人工培养的发酵剂来实现肉制品的发酵。

本研究在明确微生物发酵技术前提下，以海产低值鱼特别是产量较大的小黄鱼为原料，以现代食品加工和发酵技术为基础，在研究了戊糖片球菌发酵特性的基础上，以其为发酵剂对低值海产鱼进行发酵，系统研究发酵剂对鱼肉品质的影响，明确其中各项指标的变化特征与规律，提高鱼肉凝胶强度和白度，改善其风味、质地、色泽与保存性，探讨出发酵过程中风味形成的规律，旨在研究出安全、高营养以及色香味均能满足消费者的低值海产鱼发酵制品。

通过对低值海产鱼的深加工，研发出符合大众饮食习惯的真空包装食品、罐头水产品，丰富产品口味，使其成为消费者喜爱的水产品，不仅能丰富品种类型，提升产品附加值，激发渔民进行水产养殖的热情，对渔业资源也是一种有效的保护。

本研究能充分利用我国低值海产鱼资源，丰富海产制品的种类，为低值海产鱼的增值转化提供一条新途径，促进海洋渔业的发展，具有重要的经济和社会效益。

2材料与方法

2.1实验材料与设备

2.1.1实验材料

本试验选取低值海产鱼原料为小黄鱼，可从学校附近乐天玛特超市购买，清洗前处理后剁块、绞碎，再将鱼肉置于实验室冰箱中冷藏保存，以待备用。

戊糖片球菌菌种由指导老师提供，出处江南大学。

白糖、食盐、味精、黄酒、香辛料等调味料从乐天玛特超市购买。

2.1.2实验试剂

实验用水应符合GB/T6682规定的二级水规格或蒸馏水。

（1）制备氢氧化钠标准滴定溶液C（NaOH）=0.1mol/L。

（2）氢氧化钠溶液（30g/L）：

称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至1000mL。

（3）36%甲醛溶液：

应不含有聚合物。

（4）高氯酸溶液（0.6mol/L）：

取50mL高氯酸加水定容至1000mL。

（5）盐酸标准溶液0.01mol/L）：

吸取浓盐酸0.85mL，定容至1000mL，摇匀。

并按GB/T5009.1-2003附录B的方法进行标定。

（6）硼酸吸收液（30g/L）：

称取硼酸30g溶于1000mL水中。

（7）硅油消泡剂。

（8）甲基红指示剂（C15H15N3O2）。

（9）溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）。

（10）亚甲基蓝指示剂（C16H18ClN3S·3H2O）。

（11）95%乙醇（C2H5OH）。

（12）酚酞指示剂（10g/L）：

称取1g酚酞指示剂溶解于100mL的95%乙醇中。

（13）甲基红乙醇溶液（1g/L）：

称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（14）亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）：

称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL

（15）溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：

称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（16）混合指示液：

2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

也可用1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

（17）混合指示剂：

甲基红-乙醇指示剂（2g/L），次甲基蓝指示剂（1g/L），临用时将上述两种指示剂等量混合

（18）硫酸铜（CuSO4·5H2O）。

（19）硫酸钾（K2SO4）。

（20）硫酸（H2SO4密度为1.84g/L）。

（21）正己烷或石油醚（30℃～60℃沸程），溴值低于1，挥发残渣小于20mg/L。

（22）冰乙酸：

用纯净、干燥的惰性气体（二氧化碳或氮气）气流清除氧。

（23）异辛烷：

用纯净、干燥的惰性气体（二氧化碳或氮气）气流清除氧。

（24）碘化钾饱和溶液：

新配置且不得含有游离碘和碘酸盐。

（25）硫代硫酸钠溶液：

c（Na2S2O3）=0.1mol/L，临使用前标定。

将24.5g五水硫代硫酸钠溶解于蒸馏水中，稀释至1000mL。

（26）淀粉溶液：

5g/L。

将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合，在搅拌的情况下溶于200mL沸水中，添加250mg水杨酸作为防腐剂并煮沸3min，立即从热源上取下并冷却。

此溶液在4℃～10℃冰箱中可储存2周～3周，当滴定终点从蓝色到无色不明显时，需重新配制。

灵敏度验证方法：

将5mL淀粉溶液加入100mL水中，添加0.05%碘化钾溶液和一滴0.05%次氯酸钠溶液，当滴入硫代硫酸钠溶液0.05mL以上时，深蓝色消失，即表示灵敏度不过[8]。

（27）MRS液体培养基：

蛋白胨10ｇ、牛肉膏10ｇ、酵母膏5ｇ、柠檬酸氢二铵2ｇ、葡萄糖20ｇ、吐温-801mL、乙酸钠5ｇ、磷酸氢二钾2ｇ、硫酸镁0.58ｇ、硫酸锰0.25ｇ、蒸馏水1000mL,调节ｐＨ值6.5左右。

经121℃灭菌15～20ｍin,冷却至45～50℃

2.1.3实验设备

（1）电子天平（BS323S型）

（2）电热恒温水浴锅（HWSY双列四孔型）

（3）立式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-50Ⅱ型）

（4）多用途台式高速冷冻离心机（PrimoR型）

（5）DK消化系统

（6）半自动蒸馏装置（UDK132型）

（7）SX21000℃箱式电炉

（8）722S340-1000nm分光光度计

（9）S20PH计

（10）磁力搅拌器（GL-3250B型）

（11）飞利浦搅拌机HR2003

（12）高精度恒温振荡摇床（TFL-0018型）

（13）生化培养箱（SPX-250B-Z型）

（14）电热恒温培养箱（DNP-9162型）

（15）电热恒温鼓风培养箱（DHG-9140A型）

2.2实验方法

2.2.1戊糖片球菌菌种活化与计数

在无菌操作条件下，采用戊糖片球菌液培养基转接到5mLMRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养8～12h，形成该菌株的液体培养物。

取液体培养物1mL转接到10mL液体培养基中培养8～12h，使菌种活化，形成菌原液，并对菌原液进行平板菌落计数。

培养48h后取出培养平板，根据统计的菌落数，计算出同一稀释度3个平板上的菌落平均数[9]。

每毫升样品中菌落形成单位数（CFU）

=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

=122×108×5

=6.1×1010

2.2.2戊糖片球菌耐盐性研究

菌株盐度耐受性是影响发酵鱼中微生物生长代谢的重要因素，因此需研究戊糖片球菌的耐盐性。

将前面已活化的菌株以2%的接种量接种于不同食盐浓度的MRS液体培养基中，然后将其置于37℃恒温培养箱中静置培养18～24h,取出，利用分光光度计测定菌悬液的吸光值，确定菌株生长的适宜食盐质量浓度。

以未接种的MRS液体培养基为空白对照，10倍稀释后，测定菌悬液在600nm波长处的吸光值（OD）[10]。

结果如表3所示。

2.2.3各项理化指标测定方法

pH值测定方法：

pH计测定；取10g样品研碎，加入90mL中性的蒸馏水，振荡5min，过滤后用pH计测定滤液的pH；

总酸度测定方法：

NaOH滴定法，参考GB/T12456—2008；

氨基酸态氮的测定方法：

单指示剂甲醛滴定法；

挥发性盐基氮（TVB-N）测定方法：

参考SC/T3032—2007；

总蛋白含量测定方法：

凯氏定氮法,参考GB5009.5—2010；

总脂肪含量测定方法：

索式抽提法，参考GB/T9695.7—2008；

过氧化值测定方法：

GB/T5538—2005；

2.2.4感官评定方法

由感官评定小组（由经验丰富的12人组成），分别从色泽、腥味、咸味、鲜味和硬度五个指标对发酵鱼制品进行评定，5人一小组进行打分，每项指标20分，每个指标均分为4级，评价标准如表1所示[11].

表1感官评价标准

Table1Criterionofsensoryevaluation

指标

0～5分

5～10分

10～15分

15～20分

色泽

无光泽，

灰白色

无光泽，

颜色很浅

有光泽，

颜色较浅

色泽鲜亮，

颜色较好

腥味

腥味明显，

腐臭味

腥味明显，

无异味

略有腥味，

无异味

无任何异味

咸味

无咸味

很咸或很淡

偏咸或偏淡

咸淡适中

鲜味

无鲜味

有鲜味，很淡

有鲜味，不明显

鲜味明显

硬度

肉质糜烂

鱼肉松散

较松散

紧实，有弹性

2.2.5发酵鱼的制作工艺

2.2.5.1工艺流程

条冻小黄鱼→解冻→前处理→沥水→调味腌制→接种戊糖片球菌→发酵→烘干→真空包装→成品

2.2.5.2操作要点[12]

原料处理：

将原料去头去内脏，并用流水洗净腹腔内的血污、黑膜等物，剁成鱼块。

调味：

将沥干水的鱼体称质量，放入容器内，按鱼体质量比例配好调味料，用适量冰水与调味料进行调拌腌制，以降低调拌温度（10℃以下），控制杂菌的繁殖，渗透3h，每20min翻拌1次，使调味料充分、均匀地渗透进鱼体中去。

接种：

无菌操作，原料中接种一定量戊糖片球菌菌种于调味腌制好的鱼体中，接种后搅拌均匀。

发酵：

将接种后的鱼体容器按要求置于所需的发酵环境中发酵一定时间。

烘干：

将发酵好的鱼体平整地摊在钢丝架上，放在烘箱内进行烘干，烘干温度为35～38℃，时间为24～36h，在烘干过程中经常翻动鱼体。

成品包装：

将烘干好的鱼制品放入干净的容器中，待其自然冷却后，根据鱼体的大小装入无毒聚乙烯塑料薄膜袋进行封口包装或真空包装即为成品。

2.2.6单因素发酵试验

2.2.6.1控制菌种接种量发酵低值海产鱼

确定食盐含量7%、发酵温度10℃、发酵时间5d,分别接种不同浓度的戊糖片球菌，然后测定发酵鱼总酸度、游离氨基酸、TVB-N、总蛋白含量、总脂肪含量的值，以研究菌种接种量对海产发酵鱼品质的影响，实验结果如表4所示。

2.2.6.2控制食盐含量和发酵时间发酵低值海产鱼

在前期试验中，已对戊糖片球菌的耐盐性进行了分析。

在此基础上，考虑到发酵终产品的口味与品质，以及较高的食盐浓度会影响戊糖片球菌的生长，因此本试验选取3%～11%的梯度食盐含量作为试验范围。

在接种量106CFU/g、温度10℃的条件下发酵。

分析不同食盐浓度条件下发酵鱼TVB-N值和过氧化值随发酵时间的变化情况，结果如表5、表6所示。

2.2.6.3控制发酵温度和发酵时间发酵低值海产鱼

研究不同温度条件下发酵鱼TVB-N值、过氧化值随发酵时间的变化情况，确定接种量为106CFU/g、食盐含量为7%，温度分别为5℃、10℃、15℃、20℃，结果如表7、表8所示。

2.2.7正交试验[13]

在单因素试验确定的大致试验范围基础上，选用菌剂接种量、发酵温度和发酵时间3因素各取3个水平进行正交试验设计，以色泽、腥味、咸味、鲜味和硬度五个指标对发酵鱼制品进行感官评价，pH对鱼肉中营养组分的分解有一定的促进或阻碍作用。

对于pH在贮藏期间变化较大的鱼种来说，该值对其品质的影响可能较大。

因此，pH在鱼肉品质研究过程中是不可忽略的参数，新鲜鱼的PH值为6.5～6.8，次鲜鱼的PH值为6.9～7.0，变质鱼的PH值在7.1以上。

接种量为107CFU／g接种25h后基本达到最低发酵酸度，接种量为108CFU／g接种20h后基本达到最低发酵酸度，发酵食品中pH值低于4.6能有效的抑制腐败菌和致病菌的生长，保障产品的安全卫生。

因此测定发酵20h后的pH值，最低者为佳。

综合感官评分与pH确定最佳工艺参数，结果如表9所示。

2.2.8戊糖片球菌发酵淡水鱼试验

选用淡水鱼原料，接种108CFU/g戊糖片球菌，发酵温度10℃，食盐添加量5%，发酵时间为4d进行发酵，对终产品进行感官评定，与发酵低值海产鱼进行对比分析。

感官评分图如图6所示。

3结果与分析

3.1原料鱼成分分析

本试验所用低值海产鱼选用市售小黄鱼，其中各项常规指标经查阅与测定见表2。

表2试验用小黄鱼常规指标

Table2Conventionalindicatorsofsmallyellowcroaker

粗蛋白（%）

粗脂肪（%）

灰分（%）

总糖（%）

水分（%