苦杏仁苷在超临界二氧化碳中增溶性的研究.docx

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苦杏仁苷在超临界二氧化碳中增溶性的研究

本科学位论文

论文题目苦杏仁苷在超临界二氧化碳中增溶性的研究

所在学院材料与化学工程学院

专业班级制药工程05-1

姓名学号高明3052403004

指导老师苏宝根讲师

提交日期2007年06月

摘要

本文综述了苦杏仁苷的药理研究和提取方法，以及超临界萃取技术、反胶团萃取技术和超临界反胶团萃取技术的一般理论。

总结归纳了能在超临界二氧化碳中形成稳定反胶团的表面活性剂、超临界二氧化碳反胶团的研究和表征方法、超临界二氧化碳反胶团的应用等方面的研究进展。

以苦杏仁为原料，经过灭酶、脱脂、萃取、重结晶，制备高纯苦杏仁苷。

所得优化工艺条件为：

70～80℃水浴中用石油醚提取3次所得的脱脂粕于80～90℃水浴中用无水乙醇回流提取3次，所得粗品用无水乙醇重结晶3次，得到苦杏仁苷产品的纯度接近100﹪，总收率17.5％。

设计和搭建了一套含一个体积可调高压萃取釜的增溶性实验装置，萃取釜的最小体积为40.28ml。

在该套装置中，考察研究了苦杏仁苷在PFPE/Water/CO2体系中增溶性。

实验发现苦杏仁苷的增溶值与反胶团的稳定时间、W0有关。

实验中发现稳定时间越长，增溶值越大,W0=25、t=45℃时反胶团数目最多，增溶值相对较大。

关键词：

超临界二氧化碳苦杏仁苷反胶团全氟聚醚

Abstract

Areviewhasbeenaccomplishedforpharmacologyaboutamygdalinandmethodofextractingitandthetheoryonsupercriticalextractiontechniques,reversemicelletechniquesandreversemicelleinsupercriticalcarbondioxide（SC-CO2）.SurfactantssolubleinSC-CO2,researchmethodsandapplicationtechnologiesofreversemicelleinSCCO2havealsobeensummarized.

Amygdalinwasattainedbytheproceduresofenzymedestroy,degreasing,extractionandrecrystallization.Theoptimizedconditionwasgotasfollow:

afterdegreasingbypetroleumetherin70~80℃pool,Apricot-kernelwasextractedbyalcoholforthreetimesandthecrudeAmygdalinwasrecystallizedbyalcoholforthreetimes.Amygdalintobeproductsofcloseto100%purityandthetotalretrieverateis17.5%.

Avariable-volumehigh-pressureextractingcellapparatushasbeendesignedandthesmallestofhigh-pressureextractingcell’sis40.28ml.ThisapparatuswsabuiltformeasuringsolubilizationofamygdalininPFPE/Water/CO2system.Accordingtotheresults,wefoundthatthesolubilizationvaluesincreasedwiththeincreaseofequilibriumtime,w0andthetemperatureof45centigradeinsupercriticalcarbondioxide.Experimentsfoundthatthemorestablelongtime,thegreaterofthesolubilizationvalues,W0=25,t=45℃amountofreversemicelles,solubilizationrelativelylargevalues.

Keywords:

supercriticalcarbondioxide,Amygdalin,reversemicelle,PFPE

目录

摘要I

AbstractII

前言1

第一章文献综述2

1.1苦杏仁和苦杏仁苷性质2

1.1.1药理研究2

1.1.2苦杏仁苷提取方法4

1.1.2.1灭酶4

1.1.2.2提油、脱脂4

1.1.2.3提取5

1.1.2.4重结晶5

1.1.3苦杏仁苷的分析方法5

1.2超临界二氧化碳萃取技术6

1.2.1超临界流体概述7

1.2.2超临界流体性质7

1.2.3超临界流体的溶解度9

1.3超临界二氧化碳的性质9

1.3.1二氧化碳的密度9

1.3.2超临界二氧化碳的极性9

1.3.3表面张力10

1.3.4超临界CO2的优缺点与改进措施11

1.3.4.1超临界二氧化碳萃取的基本流程11

1.3.5超临界CO2微乳液概述12

1.3.5.1超临界CO2微乳液的概念与特点12

1.3.5.2超临界CO2微乳液的相态13

1.4超临界CO2微乳液中的表面活性剂14

1.4.1表面活性剂的设计和选择理论14

1.4.2含氟表面活性剂15

1.4.2.1PFPE-NH4/水/超临界CO2体系16

1.4.3硅氧烷表面活性剂17

1.4.4碳氢表面活性剂17

第二章苦杏仁苷的提取及纯化18

2.0引言18

2.1实验仪器和试剂18

2.2苦杏仁苷制备工艺18

2.3实验结果19

2.3.1脱脂实验19

2.3.2提苷实验19

2.3.3结晶实验20

2.3.4苦杏仁苷纯度的定量分析20

2.3.4.1分析条件20

2.3.4.2分析结果及处理22

2.3.5小节23

第三章极性物质在超临界反胶团中的增溶性研究25

3.0引言25

3.1PFPE－NH4＋/CO2/Water三相体系相图25

3.2全氟聚醚碳酸铵的合成26

3.2.2实验方法26

3.3实验装置及介绍27

3.4苦杏仁苷超临界反胶团中增溶性空白实验28

3.4.1实验步骤29

3.4.2实验数据记录29

3.5增溶平衡时间的考察30

3.6苦杏仁苷超临界反胶团中增溶性实验32

3.7结果与讨论34

参考文献35

致谢39

前言

植物有效成分的提取分离理论和应用技术在药物研究、新药开发中占有重要位置，是中药现代化的关键研究课题。

因此，研究发展植物有效成分提取分离的新方法和技术，既具有重要的学术意义，又具有重大的应用价值。

从植物中提取天然活性成分的方法有很多，如溶剂法、水蒸气蒸馏法及升华法等。

后两种方法的应用范围十分有限，大多数情况下是采用溶剂提取法。

溶剂提取法系选择适当溶剂将化学成分从植物中提取出来。

一般而言，植物成分中萜类、甾类等脂环类及芳香类化合物因为极性小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；而糖苷、氨基酸等类成分的极性较大，易溶于水及含水醇中。

但是由于有机溶剂对环境污染较大，而且还需处理提取液中残留溶剂，比较麻烦。

所以发展了用液态或超临界状态的二氧化碳来代替一些有机溶剂，于是形成了超临界流体萃取植物中有效成分的技术。

超临界流体萃取技术的发展虽已有二、三十年的历史，但仍是目前研究的热点。

超临界流体具有一些独特的性质，其密度接近于液体，而粘度又与气体相仿，因而表现出良好的溶解能力和传质特性，而且温度和压力的微小变化可引起溶质溶解度的急剧变化，通过对温度、压力的调节可以很方便地控制溶质在超临界流体中的溶解与析出，操作简单，超临界流体的回收也比较方便。

正是有了上述特点，超临界流体萃取虽只有二三十年历史，但发展迅速，目前已初步实现工业化，在石油、化工、食品、医药等领域的应用越来越广。

目前，最常用的超临界萃取溶剂是二氧化碳，因其临界温度低，临界压力适中，无毒无害，来源丰富，是一种清洁型的环境友好介质。

然而植物中各种有效成分的极性差别很大，大体可分为非极性、中等极性和强极性三类。

对于非极性成分，可以用纯二氧化碳临界流体直接提取；对于中等极性成分，也只需略加夹带剂即可。

对于强极性物质，由于它在超临界二氧化碳中的溶解度很小，几乎不能被萃取，限制了该方法的应用范围。

然而，最近20年来，超临界二氧化碳反胶团技术得到了长足的发展，为超临界反胶团技术应用于天然药物提出上创造了有利条件。

本课题拟利用反胶束萃取技术萃取强极性物质的能力，与超临界流体二氧化碳萃取技术相结合，取长补短，发挥两种技术的优势，突破纯超临界二氧化碳萃取技术的局限。

反胶束的亲水核具有增溶亲水性物质的能力，将表面活性剂分散在超临界CO2中形成反胶束，可望大大提高超临界CO2对极性物质的溶解度，突破超临界CO2不能萃取强极性物质的局限，为植物极性有效成分的提取提供一种新的方法。

第一章文献综述

1.1苦杏仁和苦杏仁苷性质

苦杏仁（Apricot－kernel）是蔷薇科植物山杏（Prunusarmeniaca）的干燥成熟果子，含有脂肪酸、氨基酸、苦杏仁苷和苦杏仁酶等多种化学成分。

苦杏仁是传统的中药，用于治疗慢性气管炎、急慢性呼吸道感染和脓疱病[1]，和其他药物合用可治疗皮肤癌[2]。

而其中主要有效成分是苦杏仁苷，它也广泛存在于杏、桃、李子、苹果、山楂等蔷薇科植物果实的种子中，尤其在苦杏仁中的含量较多，大约在2％～3％。

因此，苦杏仁苷具有广阔的原料来源。

1g苦杏仁苷溶于12ml水，900ml乙醇，11ml沸乙醇，易溶于沸水，几乎不溶于乙醚中。

苦杏仁苷由一单元苯甲酸、一单元氢氰酸和两单元葡萄糖组成。

分子式为C20H27NO11，结构式如图1.1所示：

图1.1苦杏仁苷的结构式

1.1.1药理研究

降血糖：

苦杏仁苷具有防治因抗肿瘤药阿脲引起的糖尿病作用[3]。

抗炎、镇痛：

苦杏仁苷分解产生的苯甲醛可抑制胃蛋白酶的活性，而且苯甲醛经安息香缩合酶作用生成安息香。

安息香具有镇痛作用，因此用苦杏仁苷治疗晚期肝癌可解除病人的痛苦，有的甚至不用服用止痛药[3]。

镇咳、平喘：

苦杏仁所含有的苦杏仁苷在下消化道被肠道微生物酶分解或被苦杏仁本身所含有的苦杏仁酶分解，产生微量氢氰酸，可对呼吸中枢呈抑制作用，而达到镇咳、平喘效应。

抗突变作用

苦杏仁苷能减少由安乃近、灭滴灵、丝裂霉素C等引起的微核多染性红细胞的数量。

抗肿瘤：

自20世纪20年代开始苦杏仁苷在美国、墨西哥等国家广泛流传用来治疗癌症，商品名为维生素B17和Laetrie，但其抗癌疗效一直存在争议，至今美国等国未批准使用，反而指出应停止生产和使用。

50年代中期美国、加拿大的一些官方组织对苦杏仁苷的抗肿瘤作用进行了严格的重复试验，认为没有抗癌作用。

然而至今，在美国等一些国家仍在流传使用，并提出一些理论与试验依据。

如认为癌细胞无氧酵解占优势，最终产物为乳酸，偏酸性环境有利于提高β－葡萄糖苷酶的活性，促使苦杏仁苷在癌细胞中分解出较多的氢氰酸和苯甲醛，而产生对癌细胞的选择性杀伤作用。

将苦杏仁苷制剂用于晚期癌症患者的治疗，可使症状改善，存活期延长。

将苦杏仁苷用于癌性胸水的治疗，发现苦杏仁苷对癌性胸水有一定程度的控制和缓解作用。

将苦杏仁苷按300mg·kg－1，400mg·kg－1，600mg·kg－1剂量给移植性肝癌小鼠腹腔注射10～14d，其肝癌治愈率分别为72％，60.8％，61％。

移植性肝癌小鼠肝脏微粒体细胞色素P-450含量比正常小鼠显著下降。

当苦杏仁苷给药l0天，肿瘤生长被抑制的小鼠P-450含量达到正常水平。

苦杏仁苷对子宫颈癌JJC26株的抑制率为50％～70％。

苦杏仁苷及其水解所产生的氢氰酸和苯甲醛体外试验均被证明有抗癌作用，癌细胞内硫氢化酶较正常细胞少，因此对苦杏仁苷水解释放出氢氰酸的解毒能力较差，苦杏仁苷加苯甲醛或苦杏仁苷加β-葡糖苷酶可明显提高抗癌效力，已发现癌细胞无氧酵解占优势，其产物乳酸形成的偏酸性环境有利于提高β-葡糖苷酶的活性，促使苦杏仁苷在癌细胞中水解出较多的氢氰酸和苯甲醛而发挥更强的抗癌作用。

我国对苦杏仁苷进行了临床试验，结果表明它具有较好的功效，当然也有无效的报道。

目前，苦杏仁苷制剂，配服维生素E和维生素A，用于治疗多种肿瘤，并取得了较好的疗效[4]。

[6]毒性：

苦杏仁苷的急性毒性试验LD50小鼠静脉注射为25g/kg；大鼠静脉注射为25g/kg，腹腔注射为8g/kg。

最大耐受量：

小鼠兔犬静注和肌注均为3g/kg，口服均为0．075g/kg。

人静脉注射为5g（约0.07g/kg）。

小鼠按500mg/kg静注10只，均未死亡，而以同样剂量灌胃给药，则10只死亡8只。

口服给药的毒性所以大于静脉给药，研究证明主要是由于苦杏仁苷被肠道微生物水解产生较多的氢氰酸所致，如果处理小鼠使其肠道内微生物抑制，则胃肠给药300mg/kg未出现死亡现象，如未经处理，则相同剂量死亡率为60％。

人口服B17（苦杏仁苷）每日4g，持续半个月或静脉注射一个月可见毒性反应，以消化系统较为多见，此外还表现为心电图T波改变、房性早博，停药后以上毒性反应均可消失。

如果剂量减为每日口服0.6～1g，则可避免毒性[4]。

1.1.2苦杏仁苷提取方法

目前提取苦杏仁苷的方法比较多，如乙醇回流法、乙酸乙酯萃取，以及层析柱分离法等[5]。

主要步骤为灭酶、提油、脱脂、提取、结晶纯化等。

1.1.2.1灭酶

苦杏仁中与苦杏仁苷同存于异细胞的苦杏仁酶，该酶系苦杏仁苷酶和樱叶酶的混合物。

苦杏仁在正常情况下，其苷呈稳定状态。

一旦破坏这一平衡，象粉碎时细胞壁遭破坏使苷与酶接触，在水的参与下苦杏仁苷酶使苦杏仁苷水解成野樱皮苷和一个水分子葡萄糖。

野樱皮苷继续被樱叶酶水解成杏仁腈和另一个葡萄糖。

杏仁腈极不稳定，受热分解为苯甲酸和氢氰酸[6]。

实验证明，当苦杏仁煎煮20分钟后，药液中有效成分苦杏仁苷越少，含量相当于原生药含量的24％。

粉碎和煎煮之所以引起苦杏仁苷含量的减少，主要是因为粉碎和煎煮都促进了苦杏仁酶对苦杏仁苷的酶解作用，因此对苦杏仁生药处理之前应先杀酶。

加热灭酶法[6]苦杏仁在25～85℃温度下加热8～10小时或在95～100℃温度下加热5～6小时均可使苦杏仁酶失去活性。

同时把水解的另一因素水分明显降低，为以后生产工序创造条件。

微波法[7]

微波是一种电磁波，通过水分子间的振动产生热能。

苦杏仁中含有4.5％左右的水分。

在微波的作用下，产生的热能可杀灭苦杏仁酶的活性，而不影响苦杏仁苷。

当温度控制在80℃，4～5分钟后，苦杏仁酶完全失活，苦杏仁苷不受损失。

烘箱法[8]

将苦杏仁置烘箱中，以80℃干燥1小时，酶基本被破坏。

蒸法[8]

将苦杏仁铺一薄层，蒸两小时，即可达到完全杀灭苦杏仁酶的目的。

1.1.2.2提油、脱脂

压扎法[6]：

苦杏仁灭酶后，直接用扎油机脱脂，苦杏仁粕不易过厚（0.8～1.2mm），油粕需在提取投料前，先用乙醇浸8小时。

浸出法[6]：

将苦杏仁粉碎，再用120号无铅汽油浸出，浸出时间一般在12～14小时。

苦杏仁粉碎应适度，粒径不宜过大，万不可细粉过多。

也有粉碎后用乙醚和石油醚除脂。

超临界萃取法：

李科友[9]、张慧敏[10]都用正交实验法从不同因素和水平考察了超临界CO2萃取苦杏仁油的研究，其中较好的萃取条件：

压力8Mpa、温度42℃、流速25ml/min、粒度18目。

而且还得出苦杏仁中的含水量在超临界萃取中起着重要的作用。

1.1.2.3提取

提取苦杏仁苷可采用80％乙醇或加水煮沸数分钟，残渣加水用石油醚或氯仿提取除去脂溶性成分，亦可用乙酸乙脂等溶剂进行液液分配萃取或用甲醇与乙酸乙酯恒沸混合溶剂提取，这样可避免大量极性化合物如糖、氨基酸、肽类成分溶出；或将所得水液先用醋酸铅、聚酰胺或混合型离子树脂等进行预处理，除去其中酸性、酚性及离子性化合物，经处理后的水液减压浓缩，再用柱层析进行分离纯化，其填料一般是硅胶、硅藻土、硅酸镁、活性炭、纤维素或彼此联合使用。

由于苦杏仁苷在冷乙醇中的溶解度很小，在热乙醇中的溶解度很大，所以亦可采用乙醇做结晶溶剂提取苦杏仁苷，原料经过预处理和压榨，用95％的乙醇浸提两次后进行脱脂处理，得到脱脂粕，脱脂粕经过粉碎后，用沸醇回流装置进行萃取，经结晶、重结晶和纯化，便可得到苦杏仁苷[11]。

苏碧茹等用正交实验法进行了苦杏仁成分提取工艺的优选研究。

他们选取溶媒浓度、溶媒量、提取时间、提取次数为试验因素，得出最佳工艺条件为95％乙醇提取两次，每次lh，6倍量乙醇为最佳工艺，由此工艺制得苦杏仁霜[12]。

1.1.2.4重结晶

苦杏仁苷结晶粗品需精制后才能供制剂使用。

其精制是利用乙醇中重结晶的方法实施。

在此应注意两点：

一是物料置溶解罐中充分溶解，利用活性炭脱色吸附杂质时溶液温度保时80-83℃；二是物料与乙醇的投料比应大于1：

12。

重结晶一般须进行2-3次。

结晶时间一般为24小时，再乙醇中加入少量的乙醚可纯化苦杏仁苷。

1.1.3苦杏仁苷的分析方法

容量法[4]：

样品（或水解后的溶液）经水蒸气蒸馏，馏出液导入水和氨水组成的吸收液中，加入碘化钾试液，用0.1M硝酸银溶液滴定。

电化学分析法[4]：

制作氰离子选择性电极作为基本电极。

以苦杏仁苷为标准品，加入pH7的磷酸盐缓冲液，配置成不同浓度的标准液，放入饱和甘汞电极及上述酶固定的氰离子选择性电极，在离子计和精密酸度计上测量电位值，绘制工作曲线。

将样品配置成pH7的水溶液（含苦杏仁苷浓度约为10－2M），同上测定电位值，计算含量。

紫外分光广度法[4]：

以水为溶剂，263nm检测，可用于苦杏仁苷粗品中苦杏仁苷的检测。

高效液相色谱法[4]：

高效液相色谱分离效率高，分析速度快，现已成为有机物定性定量分析研究的主要方法。

KimerlyWasserkrug等用硅柱反相高效液相色谱仪检测并分离了苦杏仁苷。

邢国秀[5]在优化苦杏仁苷工艺时提出了较优的色谱条件：

色谱柱ODS-Hypersil（4.6mm×200mm,5μm）；流动相甲醇-水（74∶26）；柱温25℃；流速1.2min/ml；检测波长252nm。

毛细管胶束电泳色谱[4]：

毛细管电泳色谱是近年来发展最快的分析分离方法，它是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，具有高灵敏、高分辨率、高速度、样品用量少、成本低等优点。

由于苦杏仁苷是水溶性物质，用毛细管胶束电泳色谱分离苦杏仁苷效果极佳。

SeongHoKang等采用毛细管胶束电泳色谱成功地分析了苦杏仁苷和它的异构体，并用高效液相色谱、紫外分光光度计和质谱进行验证，结果一致。

C.Campa等用毛细管胶束电泳色谱研究了不同pH值、不同时间苦杏仁苷的水解情况。

Isozaki，Takafumi等用环糊精修饰的毛细管胶束电泳色谱分离测定了苦杏仁苷及其异构体。

目前被采用苦杏仁苷的分析法好还包括化学发光法、毛细管胶束电泳技术、薄层扫描法以及色谱和质谱连用技术。

1.2超临界二氧化碳萃取技术

20世纪70年代由于世界性的能源危机，促进了超临界C02萃取技术产业化的兴起。

自从1879年英国的Hannay和Horgarth发现超临界萃取以来，超临界技术取得迅速发展。

进入20世纪80年代超临界C02萃取啤酒花浸膏[13]、萃取咖啡豆[14]中的咖啡因已形成太规模的工业化生产。

至90年代超临界C02用于处理材料，如精密零组件的清洗、固体细粉末的制造、微胶囊药物的制造等。

超临界C02为目前最常用的萃取剂，超临界C02系指C02处于其临界点（31.1℃、7.14MPa）之上，而临界点是指可存在气液平衡的最高温度与压力。

超临界C02具有类似液体的密度以及类似气体的扩散性。

C02作为工业上最常用的萃取剂，其特点是：

C02的超临界状态容易实现，如图1.2[15]所示，萃取可以在室温附近的温和条件下进行，极少破坏生物质的生理活性，适合于天然活性成分的提取。

价格低廉，经济性好。

安全无毒，尤其适合制药、食品工业，且萃取分离一次完成，无溶剂残留。

是惰性气体、不易燃烧、化学性质稳定[16]。

1.2.1超临界流体概述

超临界流体（SupercriticalFluid）是温度和压力同时高于临界值的流体，亦即压缩到具有接近液体密度的气体。

因此，超临界流体具有许多独特的性质，如粘度、密度、扩散系数、溶剂化能力等性质随温度和压力变化十分敏感：

粘度和扩散系数接近气体，而密度和溶剂化能力接近液体。

早在1822年，Cagniard首次报道了物质的临界现象；1869年，Andrew测定了二氧化碳的临界参数；1879年，Hannay和Hogarth测量了固体在超临界流体中的溶解度；最近二三十年来，由于环保法规的颁布，超临界流体技术得到迅速发展，成为国际上公认的绿色技术。

目前研究较多的超临界流体有超临界二氧化碳、超临界水、超临界丙烷[17]等。

当前，超临界流体技术已在萃取分离、化学反应工程、微细颗粒制备等诸多领域得到广泛应用，并成为这些领域发展的主导之一。

1.2.2超临界流体性质

当流体的温度和压力在它的临界温度和临界压力之上时，称该流体处于超临界状态。

图1.2是纯流体的典型压力-温度图。

图中曲线AT表示气-固平衡的升华线，曲线BT表示液-固平衡的熔融曲线，曲线CT表示气-液平衡的饱和蒸气压曲线，点T是气-液-固三相共存的三相点。

将纯物质沿气-液饱和线升温，当达到图中点C时，气-液的分界面消失，体系的性质变得均一，不再分为气体和液体，称C点为临界点。

与该点对应的温度和压力分别称为临界温度Tc和临界压力Pc。

图中高于临界温度和临界压力的阴影区域内的流体即超临界流体（SupercriticalFluid，SCF）。

图1.2纯物质的温度-压力相图

由于超临界流体独特的物理化学性质，使其具有类似液体的密度，类似气体的粘度和较大的扩散系数，因而有较好的流动、渗透和传递性能；其它还有不同寻常的压缩性，通过简单的减压、升温即会引起流体密度的很大变化，因而有强的物理作用力，是一种优良的分离溶剂。

理论上，可用作超临界流体的溶剂很多，如二氧化碳、乙烯、氨、氧化亚氮等。

SCF具有许多独特的物理化学性质既不同于气体也不同于液体。

表1.1比较了SCF，气体和液体的密度，粘度及扩散系数的差别。

表1.2是不同超临界流体的临界性质。

表1.1超临界流体和气体及液体性质的比较

物理特性

气体

超临界流体

液体

（常温、常压）

Tc、Pc

Tc、4Pc

（常温、常压）

密度（g·cm-3）

（0.6-2.0）×10-3

0.2-0.5

0.4-0.9

0.6-1.6

扩散系数（cm2·s-1）

0.1-0.4

0.7×10-3

0.2×10-3

（0.2-2.0）×10-5

粘度（Pa.·s）

（1-3）×10-5

（1-3）×10-5

（3-