干旱胁迫对小麦高压诱变体的影响.docx
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干旱胁迫对小麦高压诱变体的影响
2011级硕士研究生学位论文开题报告
小麦高压诱变体对干旱胁迫的生物学响应
Theeffectofhigh-Pressureinducedwheatonthedroughtresistance
学院：
农学院
学科、专业：
作物遗传育种
研究方向：
作物育种理论与方法
研究生：
熊建云
指导教师：
张正茂研究员
研究生通过开题论证日期：
年月日
开题论证委员会主席签名：
开题论证委员会委员签名：
1.选题的目的和意义
小麦新品种选育是促进小麦持续增产最直接最有效的措施之一。
在小麦新品种的培育过程中，各种优良种质和材料的引入对提高育种效率和保持遗传多样性至关重要，目前小麦育种中可供利用的优异种质资源范围已经非常狭窄，迫切需要不断发现和创新种质材料，在现代育种中，转基因新技术、各种诱变处理育种等技术常被用来创造新材料。
利用生物技术育种无疑是现有方法中最直接、最快捷的获得目标性状的有效手段，但该方法被警告有可能危害自然资源基础和生物安全，以保证未来农业体系对环境形成尽可能小的危害。
诱变育种是指利用各种理化因素诱发变异，再通过选择而培育新品种的方法，与常规育种方法相比，具有方法简便、育种周期短、效果好等特点，其在改良作物品种和创造新种质方面发挥了巨大作用，已成为世界上普遍应用的先进育种方法之一，尤其是与杂交育种技术的结合，育种效果更为显著。
目前在育种上应用的诱变方法有物理诱变法、化学诱变法和空间诱变法等。
物理诱变法是指利用一些物理因素处理农作物种子、花粉、器官、植株，引起植物染色体发生畸变，诱发出新的可遗传变异，从中筛选出有利变异性状的后代，育成新的品种。
物理诱变具有扩大变异来源，获得多种变异类型，提高有益变异频率的许多优点，是作物遗传改进和创造遗传新资源的核心和关键，是传统杂交育种技术的重要补充和难以取代的育种手段，从而越来越多的被用于现代育种技术中。
随着全球气候变暖，水资源日益匮乏，干旱将成为农业发展的首要限制因子中国水资源匮乏，近年来小麦主产区干旱频繁发生，危害日益加重，因此培育节水抗旱小麦品种尤为重要。
2.选题的依据
2.1理论依据
压力是影响化学反应速度和平衡以及蛋白质构型的基本热力学变量之一。
Johnson在20世纪50年代就发现，麻醉后的蝌蚪经大约10MPa的压力处理后可以复苏。
Saltveit等用12MPa的高压氦气和氮气处理植物组织，发现冷锻炼过的黄瓜子叶、黄瓜胚轴部分和西红柿果皮冷冻伤害的程度加重，膜发生相变导致柔顺性变化，植物冷冻伤害的阈值温度提高，并认为某些细胞成分可能受到影响。
物理诱变剂主要有紫外线，X—射线，γ-射线，快中子，激光，微波，离子束等。
高压生物学是由高压物理学和生物学发展起来的一门新的交叉学科。
近年来，随着高压物理学技术的进步和分子生物学技术的发展，高压生物学已成为一个新的研究热点。
高压能对生物体产生强烈的胁迫效应，高压处理能改变生物体的染色质的结构，影响遗传物质DNA的完整性，并能引起酵母、大肠杆菌等微生物基因表达模式的改变。
高压诱变是使萌动的种子在高压环境中进行。
在高压环境下合成蛋白质和DNA的小分子如氨基酸、核糖核酸、碱基以及酶的化学行为与在常压环境下有所不同，可能导致新复制的DNA在结构上产生变化。
由于所有细胞都处于相同的高压环境，种植当代就可以产生相对集中的性状变异并迅速稳定。
近年来，高压作为一种新的诱变源被引入到高等植物玉米的诱变育种研究中。
高压处理可以诱导玉米在当代及后代中发生株高、分蘖数、生长期、叶鞘及籽粒颜色等性状的变异，并获得了一些可稳定遗传的突变体。
干旱是一个世界性问题，世界上干旱、半干旱区面积约占土地总面积的36%。
在中国干旱也呈加重趋势，每年约有4133.3万hm2的农田得不到有效灌溉。
工业用水的剧增、环境的污染和气候变暖更加剧了水资源的短缺。
水资源的贫乏已成为制约农业可持续发展的重大障碍。
面对日益增长的人口压力和水资源日益匮乏的现状，培育抗旱节水、高产、优质的小麦品种将是保障国家粮食安全、促进小麦生产持续稳定发的有效途径。
差异蛋白质组学是研究有意义的因素引起的蛋白质组成的变化，以发现有差异的蛋白质种类。
这种差异蛋白质组学的思想更注重把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。
将差异蛋白质组学应用于植物研究中，不需要捕获全部蛋白，只需找出不同时期、不同组织或不同条件下所表达的可能涉及特定功能机制的蛋白即可，有很强的针对性和很高的可实现性，因而十分便捷。
差异蛋白质组学作为专门的技术体系目前在植物生理、植物组织器官和亚细胞、植物突变体、植物遗传多样性等多方面研究中都有运用。
植物生存环境中的许多因子都可以引起植物体中大量的蛋白质在种类和表达数量上的变化，研究这些差异蛋白可以使我们更好地了解植物对环境的信号应答和适应机制等。
植物的不同细胞、组织或器官中均可检测到一些特异蛋白，尽管不同植物中这些特异蛋白在种类、数量和存在的时间上不尽相同，但这些蛋白质很可能是体细胞或生殖细胞形成的特定时期特异基因的表达产物，它们与该时期细胞的功能或组织的形态建成及机体的生理生化变化密切相关。
因此，差异蛋白组学也能为植物发育过程中基因调控及等分子机制提供相关的信息。
2.2技术依据
2.2.1蛋白质组研究技术
蛋白质组样品制备所遵循的原则是在制备的过程中要最低限度的质组成的任何定性或定量的变化，最大限度的保持蛋白质的原有状态，的分离出蛋白质。
通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分，分别进行蛋白质组研究。
样品预先分级的主要方法包括根据蛋白质蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线尔基体等细胞器的蛋白质成分。
样品预先分级不仅可以提高低丰度蛋白量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。
2.2.2双向电泳技术
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是根据蛋白质的等电点和分子量大小不同，对样品蛋白进行分离的方法。
2.2.3质谱技术
生物质谱技术是蛋白质组学的一项支柱技术，可对双向电泳分离的蛋白质进行鉴定。
质谱技术（MS）的基本原理是带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质量与携带电荷比（m/z）的不同而变化，从而可以据其来判断粒子的质量。
20世纪80年代后期，同时出现了基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDTOF-MS）和电喷雾质谱（EST-MS）。
基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱
（MALDITOF-MS），是依据多肽离子的质量/电荷比值与数据库中蛋白经蛋白酶消
化后的多肽片段的数据进行对比，找到分析蛋白的同源蛋白，这种方法也被称为
多肽质量指纹分析。
此方法操作简便，灵敏度高，是目前较常用的蛋白质鉴定方
法。
3.国内外研究概况
压力是影响化学反应速度和平衡以及蛋白质构型的基本热力学变量之一。
Johnson在20世纪50年代就发现，麻醉后的蝌蚪经大约10MPa的压力处理后可以复苏。
一般认为高压对生物的生长发育主要是抑制或破坏作用，Saltveit等（1993）用12MPa的高压氦气和氮气处理冷锻炼后的黄瓜子叶、胚轴和西红柿果皮等，结果发现这几种组织冷害程度均加重，且冷冻的极限温度升高。
但是压力对于生物所起的积极作用也不容忽视。
Yayanos等发现深水中存在着的嗜压微生物，只有处于高压的环境中才能正常生长和繁殖。
徐世平等利用高静水压力处理水稻种子，对当代水稻的生长发育进行了研究和突变植株的筛选，结果表明，高压能够影响水稻的生长发育和遗传特性。
李桂双等（2003）在同样的试验条件下又研究其生理特性、抗氧化酶活性及对逆境胁迫的响应。
申斯乐等（2004）对高压处理水稻诱导稳定遗传变异系进行了DNA分析。
吴学华等（2003）首次用高压氮气处理茄科类植物）微型番茄种子，发现高压对番茄生长特性有明显的影响，高压处理组中出现异常高大植株的概率为3%～6%；并且此性状在以后连续两代中能够稳定遗传。
陈丽英等（2006）还对长春花进行了类似的试验,取得了提高药用成分的显著效果。
2007年,龙国徽等人研究了高静水压对大麦种子萌发和DNA分子指纹的影响,进一步证明了高压是诱导种子植物变异的一种行之有效的新方法。
2003年,西南交通大学高压物理研究所开始以氮气为传压介质,先后研究了高氮气压对长春花微型番茄、大豆生长发育的影响。
研究表明,高压逆境锻炼有望成为植物诱变育种的一种新手段。
陈凡国等采用高效毛细管电泳技术对普通小麦不同类型的愈伤组织进行差异蛋白质组学分析，发现不同类型的愈伤组织中含有多数相同的蛋白质和少数差异蛋白质。
结合形态与结构分析，表明差异蛋白质可能与体细胞胚的发生和发育相关。
并指出高效毛细管电泳技术具有快速可靠的特点，可望发展成为鉴定愈
伤组织类型及体细胞胚发育时期特异蛋白质的有效方法。
突变体研究是植物遗传学的重要研究手段之一，应用差异蛋白质组学技术对基因敲除突变体或转基因重组体与野生型个体间差异蛋白进行对比分析就可以对目的基因的功能进行分析研究，为突变背后的生理生化过程提供信息。
霍晨敏等首次分析1%NaC1胁迫72h的1对小麦耐盐（RH8706-49）及敏盐突变体（H870-634）的差异蛋白质组，经过MALDI-TOF分析和数据库检索发现5种可能在盐胁迫下对维持叶绿体及整个细胞的功能起到重要作用的叶绿体蛋白。
差异蛋白质是基因多样性和表型多样性的纽带，通过差异蛋白质来检测遗传多样性也有许多成功的尝试。
如David等比较了起源于同一种群但在不同环境
下生长的小麦种群遗传多样性，认为这是其适应各自的气候条件而形成的。
蛋白
质的差异和变化是植物活动的重要方式，发现并鉴定正常状态下和有意义因素影响下出现的差异蛋白质是认识植物生命活动的关键，而且，差异蛋白质组的研究结果可以丰富和促进植物全蛋白质组学的发展。
随着各种技术的完善，差异蛋白质组学应用于植物中的研究将会越来越有其相对独立的价值和实际意义。
4.研究内容
4.1高压诱变小麦突变株系干旱胁迫的酶学响应
4.1.1在灌浆期测定高压诱变小麦的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、丙二醛（MDA）、可溶性糖测定和脯氨酸含量测定
4.1.2在灌浆期用叶绿素测定仪测定小麦叶片中的的叶绿素含量及用光合仪测定净光合速率、叶片气孔导度和蒸腾速率
4.1.3测定小麦籽粒中的小麦蛋白含量和谷蛋白聚合体（GMP）含量
4.2高压诱变小麦的DNA分子指纹分析
以高压处理的两个小麦品种西农979、普冰476为材料，盆栽种植，对其DNA指纹分析，找出与未处理之间的差异。
4.3差异蛋白的提取，克隆，测序
将小麦的突变株系用盆栽种植，控制盆栽条件，时期处于干旱状态，并设置对照组。
在灌浆期提取叶片中的总蛋白，进行双向电泳，并通过质谱技术分析差异蛋白。
5.研究方法及技术路线
试验于西北农林科技大学北校区试验地进行，实验材料为高压诱变小麦材料G4110的稳定遗传后代，26个诱变系和未诱变的对照，种植成27个小区，以便进行测定各种性状，每个小区行长1.5M，行距0.25M，共10行。
5.1生理指标测定时期与方法
开花灌浆时期是小麦对外界环境反应最为敏感的时期，因此，生理指标测定时期选择在开花后5-7天进行。
5.1.1SOD活性测定参照氮蓝四唑（NBT）光化还原法。
酶活性单位采用抑制光化还原氮蓝四唑50％为一个酶活性单位，SOD总活性以每g鲜重酶单位表示测定其它管OD560，酶活性单位umol•min-1•g-1FW。
5.1.2过氧化物酶（POD）活性的测定
POD的活性测定参照愈创木酚法（高俊凤2006）。
定义每分钟OD470变化0.01为U一个单位，POD活性单位U•g-1FW表示酶活性大小。
5.1.3过氧化氢（CAT）活性的测定
CAT的提取和活性测定参照紫外吸收法（高俊凤2006）。
定义每分钟OD240变化0.01为U一个单位，CAT活性单位U•g-1FW表示酶活性大小。
5.1.4APX测定
100ul酶液加2700ulPBS缓冲液（50mM,pH7.8）和100ul的AsA以及100ul的H2O2于石英比色杯，轻轻摇匀数秒，于紫外分光光度计上，OD290下动力学测定1分钟。
选择时间段较为笔直的曲线斜率为活度，来计算样品中的酶含量。
5.1.5MDA测定
丙二醛（MDA）含量测定-硫代巴比妥酸法（高俊凤2006）
0.5ml待测酶液加2.5mlMDA反应液，沸水浴反应15分钟，立即冰浴，4800rpm离心10分钟，上清转入新管，先后在450，532和600nm三个波长下比色。
MDA浓度（umol•L-1）=6.45*（OD532-OD600）-0.56*OD450，MDA含量（umol•g-1DW）=MDA浓度×提取液总体积（ml）/组织干重（g）/1000
5.1.6可溶性糖测定
用蒽酮法测定，参照陈毓荃提取可溶性糖，用eppendorf分光光度计测定620nm处的吸光度
5.2叶绿素含量和光合速率测定
用农叶绿素含量测定仪和光合仪测定小麦叶绿素含量和光合速率等。
5.3谷蛋白测定
小麦蛋白含量和谷蛋白聚合体（GMP）含量的测定按照杨学举等的方法进行。
5.4DNA分子指纹分析
5.4.1DNA的提取
用改良的CATB法进行基因组DNA的提取
5.4.2引物的选取及扩增
引物的选取参照朱振东等的方法，PCR扩增体系及条件参照GeneticVariationwithinandamongPopulationsofaWildRiceOryzaGranuiatefromChinaDetectedbyRAPDandISSRMarkers的方法。
PCR扩增体系：
每20μL反应体系中含10Xbuffer2μL，25mmol/LMgCI22.5μL，2.5mmol/LdNTP2.5μL，ISSRprimer20μmol/L，1UTag，templateDNA20ng，甲酚胺0.2μL.PCR扩增条件：
94℃5min，94C45S，55C45S，72℃1.5min，从第二步循环45次，72℃7min，4C结束.反应产物在含有EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测，用100bp的DNAladder作为分子量标记，电泳缓冲液为TAE，4h后在紫外分析仪下检测观察并照相记录。
5.5小麦的差异蛋白分析
5.5.1样品取材
蛋白质组学样品制备关键在于取样。
取样三次生物学重复：
每次生物学重复取3个单株作为一组，然后三次磨样；取材部位要求精确，不掺杂任何多余成分，以免给下一步分析造成误差。
三次重复目的是去除因取样差异造成的误差。
5.5.2样品制备
1〉分别称取250mg样品用液氮研磨，再将研磨充分的样品粉末转移至50mL
离心管中并加入3倍体积的蛋白提取液A，-20℃沉淀过夜。
2〉4℃，20000g离心45min，弃去上清，保留沉淀。
3〉用同上沉淀体积的含有0.07％（v/v）的β-巯基乙醇的冷丙酮将沉淀重悬，
-20℃沉淀1h以上。
4〉4℃，20000g离心1h，弃去上清，保留沉淀。
5〉将沉淀用真空干燥加速离心机抽干。
6〉小心将干燥后的粉末转移至10mL的离心管中，按30µL/mg加入蛋白提取
液B。
静置1h以上。
7〉4℃，40000g离心1h，弃去沉淀，保留上清。
8〉使用2D-Quant试剂盒进行蛋白质定量后，留下相应体积的蛋白溶液进行
下一步实验。
其余的冻存在-80℃冰箱中已备后用。
以上操作在冰上或低温条件下进行。
5.5.3双向电泳实验步骤
（1）第一向：
胶条取出5-10min方可使用；将水化液和样品取出放在冰上融化，融化后在1mL的水化液加入0.0028g的DTT，和5µL的对应的IPGbuffer；上样量1000µg，用水化液补齐到450µL，然后用尽量大的离心力离心0.5h，4℃；
（2）上样：
1〉加样在两极内，正负极各加适量，然后分几枪均匀点在瓷槽里；
2〉将胶条正负极对应然后用手拿负极端，将正极端对准阳极，顶住阳极端，
缓缓下压胶条赶走气泡。
3〉滴加覆盖油盖上槽盖。
4〉记下胶条的编号。
5〉等电聚焦：
：
30v12h，100v1h，1000v1h，8000v12h，最终达到90000w/h即可。
（3）平衡胶条：
完成等电聚焦后和进行第二向电泳之前，IPG胶条要依次在两种
10mL平衡缓冲液中各平衡15min。
第一种：
在胶条平衡液中加入1％（w/v）
的DTT；第二种：
在胶条平衡液中加入4％（w/v）的碘乙酰胺。
经过平衡后
的胶条可以直接进行第二向电泳，也可以放入-80℃长时间保存。
（4）电泳：
IPG胶条平衡后，小心的放在预先制备好的12.5%SDS-PAGE上，用琼
脂糖封顶液封好，避免产生气泡。
然后在电泳仪上进行第二向电泳。
电泳参
数设定为：
预电泳45min，2.5w/胶，然后再根据不同的槽设置参数，本试验
参数为20w/胶电泳5-6h；冷循环水仪设定温度为18（16也可以）℃，待溴酚
兰前沿恰好跑出胶外的时候停止电泳。
（5）考马斯亮蓝染色：
1〉固定，将凝胶放入固定液（40%乙醇，10%乙酸）中固定30min。
2〉放大，将固定后因脱水而变小的凝胶转移至10%的乙酸中放大20min。
应学相应___________________________________________________________________________________________________________________________封顶液封好，避免产生气泡。
然后在电泳仪上进行第二向电泳。
电泳参________________________________________________________________________________________________3〉染色，将凝胶转移至90-100℃热考染液（一片R350片溶于1600mL的冰
乙酸）染色10min。
4〉脱色，用10%的乙酸脱色2-3个min，其间换液1-2次即可。
图像扫描机软件分析：
聚丙烯酰胺凝胶用UMAX扫描仪扫描获取电子图像。
利用专业2D胶分析软件Imagemaster2Dplatinum6.0进行双向电泳的图像分析，包括凝胶图像的背景扣除、对齐、点的匹配和定量。
（6）蛋白质的胶内酶解：
1〉用剪平前端的200µL的枪头从考马斯亮蓝染色的凝胶上戳取待鉴定的
蛋白质点放入500µL的eppendorf管中。
注：
枪头，离心管必须灭菌，进口产品。
手套，口罩，桌面必须干净，
用酒精消毒。
2〉加入50µLmilli-Q-water（可以长时间放置4℃冰箱）或清洗一次，吸干
水后加入50µL的脱色液（50％50mM碳酸氢铵；50％乙腈）放在振荡摇
床上脱色。
如果点着色太深则需要换液继续脱色，直至颜色完全脱净（大
约半小时）。
（50mM碳酸氢铵配成后应密封）
3〉加入50µL的乙腈脱水15min。
4〉放入真空加速干燥离心机中旋转干燥。
（干燥的胶粒应该呈白色）（多
于20min）
5〉在干燥的胶粒中加入5-6µL含有5ng/µL胰蛋白酶的25mM碳酸氢铵溶
液。
（用微离心机奖掖体离到管底，确定酶液加入）
6〉4℃放置20min，让胶粒完全吸涨。
吸去残留酶液，再加入少量（5-6µL）
的25mM碳酸氢铵至完全吸涨。
再4℃放置45min。
7〉用膜封盖，然后在37度水浴12-14h（13），3000g离心2min。
8〉将原液吸出；再进行三步抽提：
（封盖）
收集汇入原液管，真空浓缩，抽干，封口，4℃保存。
5.5.4质谱分析
5.5技术路线图
高压处理
诱变植株小麦材料G4110
单株
种植
6
代
形成稳定遗传系
干
旱
胁
迫
差异蛋白分析
测定生理指标
测定光合特性
6.预期结果
（1）干旱胁迫下不同的稳定遗传系其测定的生理指标各不相同，因为诱变是不定向的，所以与对照既未诱变的材料相比各种酶的含量和光合速率有的高有的低，从中选出综合性状最好的材料。
（2）经过SSR引物扩增后，有些材料出现特异条带，呈现出多样性，选取抗旱性基因条带较多的材料进一步进行研究。
（3）由于高压处理的小麦发生了变异，其一些基因所表达出的蛋白质与未处理的小麦不一样，这可以进一步证明该处理确实能使小麦发生突变，另外，在干旱胁迫下，小麦所含有的蛋白质种类和数量不一样，经过电泳分析后，可以得到一些与抗旱有关的蛋白质。
7.本研究的创新点
作为一项基本的热力学变量，压力是影响物质的性质以及化学反应速度和平衡的重要物理学参数，它同样影响生物大分子及生物体内的各种生理生化反应。
随着高压理论和技术的迅猛发展，高压生物学也应运而生。
目前高压生物学的研究已经深入到生物学的多个领域。
目前有关高压诱变育种的技术还没应用到实践中，仅仅在水稻研究中用到的比较多，本研究正是通过在干旱条件下用各种方法选择出高压诱变小麦后代中具有有优良性状的小麦材料，从而为小麦育种提供更多的种植资源。
8.从事自然科学研究生研究所需主要仪器设备和试剂
8.1仪器设备
直尺、研钵、蒸发皿、电导仪、PH计、电子分析天平、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱、电热鼓风干燥箱、电泳槽、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、液氮罐、全温振荡器、高压蒸汽灭菌锅、紫外可见分光光度计（UV-1800）、叶绿素仪、光合测定仪（LI-6400）原子吸收分光光度计，原子荧光光度计等。
8.2主要试剂
氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、硫酸、磷酸、偏磷酸、高氯酸、硼砂、石英砂、L-苯丙氨酸、邻苯二酚、双氧水、L-甲硫氨酸、硝酸钾、黄胺、1-萘胺、亚硝酸钠、冰醋酸、磺基水杨酸、甲苯、蒽酮、蔗糖、果糖、葡萄糖、牛血清白蛋白、乙酸乙酯、盐酸肼、2,4-二硝基苯肼、无水乙醇、浓盐酸、丙酮、甲醇、苯甲酰氯（PMSF）等。
9.论文工作进展安排
（1）2012.7—2013.2阅读文献、为实验做前期准备、种植小麦材料；
（2）2013.2—2013.6样品的采集、测定各种指标；
（3）2013.6—2013.12样品分析，个别试验补充，数据统计，数据处理；
（4）2013.12—2014.5论文写作，答辩；
10.经费概算
（1）材料费：
包括种子，肥料，仪器使用等费用约1000元；
（2）试剂费：
5000元；
（3）资料费：
复印等500元；
（4）测定费：
3000元；
（5）其他：
500元；
总计：
10000元
11.参考文献
[1]ChiakiK,LinaL,YuichiN.ExtremelyBarophilicBacteriaIsolatedfromtheMarianaTrench,ChallengerDeep,ataDepthof11,000Meters[J].ApplEnvironMicrobiol,1998,64:
1510-1513.
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